王琦 王馨竹 姜增譽 周景莉 何生

1山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院（太原 030001）；2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院影像科（太原 030001）；3山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科（太原 030001）

心血管疾病位于人類疾病譜首位，是造成人類死亡的最主要因素［1］。在我國，心血管死亡病例以心肌梗死及其引起的心力衰竭、心律失常為主，并有增加趨勢［2］。急性心肌梗死發(fā)生后，冠狀動脈完全堵塞，血流中斷，供血量急劇下降，造成大量心肌細胞死亡［3］，取而代之的是導電性較差的瘢痕組織，繼而發(fā)生慢性階段的病理性重構(gòu)［4］，變薄和變硬的纖維化心臟組織［5］，導致電阻率增加，破壞了心肌電信號，電傳播延遲，造成心臟收縮不同步，進一步引起心肌供血不足，最終導致心力衰竭［6］。在慢性心肌梗死中，目前缺乏能夠改善組織電阻、促進血管生成和抑制心室重塑的改善患者遠期預后有效治療方法［7-8］。導電水凝膠可通過抑制心室重塑和促進心室再同步收縮［9-10］，修復急性心肌梗死后心功能。然而，導電材料對已形成瘢痕的慢性心肌梗死的修復能力及長效性如何尚未可知。

導電生物材料具有導電特性，易于加工［11］，能夠改善心臟電生理［12］，是一種治療心肌梗死的理想材料［13-15］。聚吡咯（Polypyrrole，PPY）因能提高心肌收縮，它是第一個在生物醫(yī)學領(lǐng)域得到發(fā)展和使用的一種導電聚合物［16］。但是這種導電聚合物因為生物相容性差和機械強度不足的缺點，限制其在生物組織工程中的應用。為了克服這一缺陷，本研究將其與天然材料殼聚糖相結(jié)合［17-18］，合成了聚吡咯-殼聚糖（Polypyrrole-Chitosan，PPYCHI）可注射導電水凝膠。

筆者已證實了導電水凝膠PPY-CHI 對急性心肌梗死早期促心肌傳導及同步化電活動的可行性［9］。本實驗擬通過構(gòu)建大鼠慢性心肌梗死模型驗證可注射導電水凝膠PPY-CHI 是否也能長期降低組織電阻、促進心肌電傳導和血管生成及抑制心室重塑，以期闡明PPY-CHI 對心肌梗死后的持續(xù)修復作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑及儀器主要實驗試劑、儀器：98%聚吡咯、低分子殼聚糖、甘油磷酸二鈉、25%戊二醛、六水三氯化鐵（Sigrma，美國）；透析膜（Fisher，加拿大）；手術(shù)器械（FST，德國）；心臟超聲儀（Vivid T，美國）；熒光倒置顯微鏡（Ti-U，Nikon，日本）。

1.1.2 實驗動物SD 雌性大鼠40 只，SPF 級，6～8 周齡，體質(zhì)量200～250 g；SD 新生大鼠20 只，SPF級，1～3 d，均購買于山西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 導電水凝膠PPY-CHI 的制備按照標準化方案［9］，合成了導電復合材料PPY-CHI。選取同等濃度的CHI 作為對照材料，調(diào)至pH=6 左右待用。向PPY-CHI 和CHI 復合物中加入不同劑量甘油磷酸鈉（50%質(zhì)量濃度）和戊二醛（4%/0.4%質(zhì)量濃度）形成水凝膠。

1.2.2 導電水凝膠PPY-CHI 的導電率及電壓損失測定（1）四探針法：采用四探針電導分析儀，對導電水凝膠PPY-CHI 及CHI 的導電率進行測量，事先制備了尺寸和厚度均為1 mm 的PPY-CHI 和CHI 薄膜，并與4 個探針（探針間距為2.5 mm）密切接觸，同一個樣品測試3 個不同的區(qū)域，根據(jù)系統(tǒng)軟件計算導電率，比較兩者的導電率。（2）電壓損失測定：采用微電極陣列對導電水凝膠PPY-CHI和CHI 距離刺激點不同距離處的場電位幅值進行測量，先在水凝膠（水凝膠PPY-CHI 和CHI 的制備如上所述）0 cm 處做上標記，再將電刺激器的正極和負極均放置于距標記0.5 cm 處，初始給予100 mV 的電壓值，之后每秒給400 mV。電刺激產(chǎn)生的電反通過ECG 軟件進行監(jiān)測。同理，將正負極記錄叉分別移至1.0、1.5、2.0 cm 處，記錄每處的電壓，每間隔重復測量5 次。

1.2.3 導電水凝膠PPY-CHI 的生物相容性（1）NRVMs 的提?。喊凑諛藴驶桨福缜八觯?0］，成功分離出NRVMs 細胞。（2）NRVMs 細胞共培養(yǎng)：將上述分離的NRVMs 按照5 × 105/cm2的密度分別接種于含有Saline、CHI 和PPY-CHI 包被的培養(yǎng)皿中，共同孵育3 d，鏡下觀察細胞在水凝膠PPY-CHI 及CHI 包被下的生長狀態(tài)。（3）NRVMs 標記物檢測：將上述培養(yǎng)NRVMs 加入4%PFA 固定半小時；0.2%細胞通透液常溫下孵育10 min；加入封閉液常溫封閉1 h；加入混合后一抗（CX-43；SARC，1∶1 000，Invitrogen），4 ℃下過夜反應；第二天使用稀釋后熒光二抗（Alexa Fluor 546，山羊抗兔；Alexa Fluor 488，山羊抗鼠，1∶1 000，Invitrogen），常溫下避光反應1 h；隨后加入DAPI（1∶1 000，Sigma），常溫下避光反應10 min；滴加抗淬滅劑，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡觀察并攝片。

1.2.4 慢性心肌梗死模型的制作大鼠慢性心肌梗死模型的制作采用前述方法［9，19］，對大鼠心室左前降支進行永久結(jié)扎，形成心肌梗死模型。對大鼠充分麻醉并插管后，采取右側(cè)30°仰臥位，刮去胸前毛發(fā)，定位大鼠左邊第一個和第二個乳頭之間，碘伏消毒后，鋪設洞巾，逐層開胸，暴露心臟，找到左前降支動脈并永久結(jié)扎，直到心尖部損傷心肌變白，則造模成功，縫合傷口。

1.2.5 移植導電水凝膠PPY-CHI 治療心肌梗死心肌梗死造模4 周后，將大鼠隨機分為Saline、CHI和PPY-CHI 組，經(jīng)誘導麻醉、氣管插管、對心肌梗死大鼠進行二次胸腔解剖，選擇前切口的相鄰肋骨之間入路，完全暴露心臟，抽取100 μL 的相對應材料注入梗死區(qū)域。蘇醒后放入干凈籠中長期觀察。

1.2.6 治療前后心臟機械功能評估5%異氟烷麻醉大鼠后，剃掉其胸毛，保持2%麻醉劑濃度，采取左側(cè)位，在M 型超聲模式下選取心臟短軸和長軸測量。分別在3 組大鼠的-1、0、4、8、12、26 周進行檢測，比較3 組不同時間點的左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室縮短分數(shù)（LVFS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDS），評估3 組材料在治療前、后的心功能連續(xù)變化情況。

1.2.7 導電水凝膠PPY-CHI 及CHI 對大鼠心肌梗死局部組織電阻變化通過四探針測試儀測量移植導電材料22 周后大鼠心臟組織電阻，首先將4 個電極探針同電阻儀相連，然后插入心臟左心室瘢痕區(qū)或邊緣區(qū)，深度約為1 mm。通過上述方式分別測量導電水凝膠PPY-CHI、CHI 和Saline 各組心肌梗死部位及周邊區(qū)電阻（n=5），比較其組織電阻高低。

1.2.8 大鼠心臟切片馬松染色經(jīng)包埋脫蠟后，根據(jù)PhyEasyTM馬松染色試劑盒的步驟進行，A 液對心肌細胞核染色，B 液對心肌細胞胞漿染色，采用分色液分色，再脫水透明處理后封片，通風櫥中風干，過夜，鏡下攝片。

1.2.9 血管密度免疫熒光染色玻片脫蠟后，使用0.1%Tris-EDTA 行抗原修復；0.2% 細胞通透液常溫下孵育10 min；加入封閉液常溫封閉1 h；加入一抗（α-SMA，1∶1 000，Invitrogen），于4 ℃過夜反應；第二天加入熒光二抗（Alexa Fluor 488，山羊抗鼠，1∶1 000，Invitrogen），常溫避光孵育1 h；隨后加入DAPI（1∶1 000，Sigma），常溫下避光反應10 min；滴加淬滅劑，蓋上蓋玻片，鏡下觀察攝片。

1.3 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 9.3 進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布以（）表示，組間比較選擇單因素方差分析，兩組間以獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死模型的制備及PPY-CHI 移植結(jié)扎雌性SD 大鼠的左心室前降支，術(shù)中可見心尖部位損傷心肌變白（圖1A），并將術(shù)前、術(shù)后超聲心動圖進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與造模前相比，LVEF、LVFS 顯著下降，驗證了心肌梗死模型的成功制備。并選取心臟功能LVFS 在25%左右的動物隨機分為Saline、CHI 和PPY-CHI 組開展后續(xù)實驗。

圖1 心肌梗死模型的制備及PPY-CHI 移植Fig.1 Preparation of myocardial infarction model and PPY-CHI transplantation

為了測定3組材料是否能與大鼠心肌細胞良好結(jié)合，在3組材料植入前分別與NRVMs共培養(yǎng)并通過CX-43 和SARC 進行免疫熒光標記（圖1C、1D），NRVMs 在3 組材料包被下生長狀況良好且每視野陽性細胞數(shù)未見明顯差異，為細胞的良好載體。

大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)4 周后，將3 組大鼠分別給予相應的移植治療，植入PPY-CHI 水凝膠后可見心肌組織間有黑色物質(zhì)凝集（圖1B）。

2.2 治療前后機械功能的變化情況動物實驗及檢測指標按照流程進行（圖2A）。在心肌梗死發(fā)生前（-1 周），心肌梗死發(fā)生后（4 周）、治療后4、8、12 和33 周分別使用超聲心動圖對不同治療組的大鼠（移植PPY-CHI 水凝膠組、CHI 水凝膠組和Saline 組）進行心臟功能評估。典型的M 超圖像（圖2B），心肌梗死后心室腔較梗前有所擴張、心室前壁收縮波逐漸消失；治療后心室腔的收縮程度不一、心室前壁波形得到一定程度的恢復。

圖2 心功能監(jiān)測Fig.2 Cardiac function monitoring

對各組LVFS、LVEF、LVIDS 進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)治療后LVFS 和LVEF 逐步增加，LVIDS 逐步降低（圖2C）。注射CHI 后4、8、12 和22 周后LVEF和LVFS 均較注射Saline 組有所改善。但PPY-CHI注射后4、8、12 和22 周，LVEF、LVFS 的改善更為顯著，LVIDS進一步的降低。可能是由于移植PPYCHI 后心臟擴張的程度減弱，促使心臟同步收縮。

2.3 導電水凝膠PPY-CHI 移植縮小心肌梗死面積采用馬松染色，觀察導電水凝膠PPY-CHI 移植后對大鼠心室重塑的影響。結(jié)果顯示，PPY-CHI組的瘢痕面積明顯低于CHI 組和Saline 組，在心肌梗死周邊區(qū)可見心室壁厚度顯著增加，且PPYCHI 組顯著高于CHI 組，兩組又明顯高于Saline 組。然而，3 組心臟在其他區(qū)域均未觀察到這種差異（圖3A、3B）。以上數(shù)據(jù)表明，導電水凝膠PPY-CHI對心肌梗死的修復具有促進作用，能夠消除心肌梗死后對心臟重構(gòu)作用。

圖3 導電水凝膠移植22 周后大鼠馬松染色Fig.3 Masson's trichrome staining on rats after 22 weeks of conductive hydrogel transplantation

2.4 導電水凝膠PPY-CHI移植促進血管生成為了評估血管生成，用α-SMA 來定量毛細血管密度。PPY-CHI 和CHI 組熒光強度明顯高于Saline 組，而PPY-CHI 組又高于CHI 組熒光強度（圖4A、4B）?？偟膩碚f，與CHI 組相比，PPY-CHI 組毛細血管密度明顯增加，表明PPY-CHI 組的血管生成能力較強。以上結(jié)果說明PPY-CHI 通過改善局部血供，促進心肌梗死后血管生成。

圖4 導電材料移植22 周后毛細血管密度熒光圖Fig.4 luorescence map of capillary density and arteriole density after 22 weeks of conductive material transplantation

2.5 導電水凝膠PPY-CHI 移植對大鼠心肌梗死局部組織電阻變化在體外實驗中，采用四探針法多點檢測PPY-CHI 和CHI 兩組材料的導電率，結(jié)果證實PPY-CHI 水凝膠的導電性明顯高于單獨使用CHI 的導電性（圖5A）；采用微電極陳列法測量距電極0.5、1、1.5、2 cm 處的場電位幅值，比較相同電壓刺激后不同距離電位損失情況（表1 和圖5B），PPY-CHI 水凝膠相較于CHI 水凝膠具有更高的場電位，表明電信號在不同距離下PPY-CHI傳導衰減低于CHI。通過四探針法和等距離電壓損失幅度測量發(fā)現(xiàn)，PPY-CHI 水凝膠不管是在電導率還是在場電位幅值的測量，其性能均優(yōu)于單獨使用CHI 水凝膠。由此證明PPY-CHI 的導電性更加優(yōu)越。

表1 導電材料水凝膠PPY-CHI 和CHI 場電位幅值對比表Tab.1 Comparison table of potential amplitudes of PPY-CHI and CHI fields in hydrogels of conductive materials ±s

表1 導電材料水凝膠PPY-CHI 和CHI 場電位幅值對比表Tab.1 Comparison table of potential amplitudes of PPY-CHI and CHI fields in hydrogels of conductive materials ±s

組別PPY-CHI 組CHI 組F 值P 值0.5 cm 76.58±9.39 70.80±3.20 5.395＜0.000 1 1 cm 69.88±10.70 18.34±3.20 21.569＜0.000 1 1.5 cm 60.12±11.25 11.74±1.74 7.303＜0.000 1 2 cm 53.64±10.58 5.98±1.41 7.565＜0.000 1

為了驗證PPY-CHI 在大鼠心肌梗死局部的導電性，移植導電材料22 周后，通過四探針測試儀測量了纖維瘢痕區(qū)域及周邊區(qū)域組織電阻（圖5C）。測量過程分別測量各組心肌梗死部位及邊緣區(qū)電阻（圖5B）。比較3 組組織電阻（圖5D），發(fā)現(xiàn)注射導電水凝膠PPY-CHI 組的組織電阻要小于注射導電水凝膠CHI 組的電阻和Saline 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），證明導電水凝膠PPY-CHI 降低了局部組織電阻、增加了組織的導電性。

3 討論

盡管導電生物材料在治療急性心肌梗死方面顯示了較好的療效［20-21］，但其對慢性心肌梗死的療效仍未可知。前期側(cè)重于對大鼠急性心肌梗死后電傳導及血管生成進行了探究，但對于抑制心室重塑尚未說明，且治療時間均在3 個月內(nèi)的急性心肌梗死，對于梗死后3 個月以后或者慢性心肌梗死患者PPY-CHI 是否仍有效果，以及對心室重塑是否有積極作用，是本實驗預探究的問題。

本研究在SD 大鼠心肌梗死造模4 周后在心肌梗死局部注入導電水凝膠PPY-CHI 治療，結(jié)果顯示在移植PPY-CHI 4 周后即表現(xiàn)出明顯改善左室心功能的作用（與梗后4 周相比），LVEF、LVFS 明顯升高，LVIDS 明顯降低，這種作用一直持續(xù)到在體實驗結(jié)束，與HE 等［9］的研究結(jié)果一致。而這種持續(xù)的改善作用不能用降低組織電阻，促進同步心臟收縮完全解釋。隨著對導電材料作用的深入研究，它改善左室心功能的機制還包括改善心肌細胞存活微環(huán)境、抑制心肌梗死局部炎癥反應、促進新生血管生成，抑制心室重構(gòu)等［8-10，22］。本實驗重點關(guān)注了導電材料移植促進血管生成、抑制心室重構(gòu)和降低組織電阻的作用。首先，通過α-SMA熒光染色檢測毛細血管密度，發(fā)現(xiàn)PPY-CHI 治療組的熒光強度遠高于CHI 組和Saline 組，這可能是由于PPY-CHI 能夠改善局部血供，增加血管密度，抑制細胞凋亡，從而改善心功能。其次，對其心臟組織進行了馬松染色，結(jié)果分析顯示，與單獨使用Saline 組和CHI 組比較，PPY-CHI 組的瘢痕大小明顯低于其他兩組，且在心肌梗死周邊區(qū)心室壁厚度顯著增加，這可能是由于PPY-CHI 通過增加纖維組織的強度，以防異常心室重塑來進行心臟修復。最后，對其心肌梗死局部組織電導率進行了分析，相較于CHI 單獨注射而言，注射PPY-CHI 在心臟瘢痕區(qū)域具有更低的電阻和更快的傳導速度，這可能是由于其PPY-CHI 增加了心肌內(nèi)的電信號傳播，促進瘢痕區(qū)域內(nèi)心肌細胞的同步收縮，從而降低纖維化瘢痕抵抗率來維持心臟功能并改善電傳導。

PPY 因易于表面修飾，能夠支持細胞黏附和增殖而被用于心肌修復［10，23-24］。然而由于PPY 具有較差的力學性能而難以用于支架制造［25］，將它們與其他聚合物混合已被成功證實可以增強其材料特性，用于MI 的治療［9-10，13，21］。早期研究表明，PPY 與海藻酸鹽的混合物注入大鼠梗死區(qū)可誘導動脈生成，但注射5 周后實驗組的梗死面積無顯著差異，這可能歸因于PPY 的導電性［26］。沿著這一思路，MIHIC 等［22］將PPY 與CHI 混合物應用于心肌梗死的治療，8 周后生物材料處理的心臟瘢痕大小顯著減小。在電生理研究中，PPY-CHI 也顯示出較強的導電性，在冷凍損傷后7 d 的大鼠心肌損傷區(qū)域植入PPY-CHI，增強了梗死組織的電信號傳播，并在注射后4 周改善了心功能，而未引起心律失常［10］。這些發(fā)現(xiàn)也得到了HE 等［9］的支持，他們在心肌梗死后7 d，將PPY-CHI 注入梗死心肌，可觀察到，在植入材料后12 周，LVFS 較梗后增加了10%，組織電阻顯著降低，促進了心臟再同步收縮，增強心功能，而不引起心律失常。本實驗中，在大鼠心肌梗死造模后4 周將PPY-CHI 導電水凝膠植入，22 周后其LVFS 較梗前增加了（10.6 ±0.55）%，組織電阻較Saline組降低（14.28±7.59）%，毛細血管密度較Saline 組增加（4.06 ± 1.75）%，左心室壁厚度較Saline 組增加（1.17±0.04）cm。本研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致［9］，即在活體動物研究中，PPY-CHI 對心功能的改善作用從第12 周持續(xù)到第22 周。

本次研究僅對體內(nèi)心肌梗死的長期修復機制作了較多探索，但較少涉及與之對應的體外細胞實驗。所以還需要大量的體外實驗進一步驗證本次研究結(jié)果，以期為臨床防治慢性心肌梗死提供科學依據(jù)。

綜上所述，證實PPY-CHI 可持續(xù)促進血管生成和心室重塑，使組織電阻率降低，增強瘢痕區(qū)域的導電能力，降低心律失常的發(fā)生率，讓心臟再同步收縮，最終改善心功能，為慢性心肌梗死的治療提供了新的策略。