段瑞雪 楊斌 夏天紅 閻龍 梁小芹 劉宏斌

1寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院（銀川 750004）；2甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點實驗室（蘭州 730050）；3中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院普通外科（蘭州 730050）；4甘肅省人民醫(yī)院（蘭州 730050）

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、病死率高等特點［1］。手術(shù)切除是提供治愈的一線治療方法，早期胃癌5 年生存率可達(dá)90%［2-3］。因其起病隱匿，多數(shù)患者（70%）就診時處于疾病晚期［4］。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療成為提高胃癌治愈率、降低病死率的關(guān)鍵。程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）在各類細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，在促進(jìn)腫瘤免疫逃避方面發(fā)揮重要作用［5］。臨床PD-L1 檢測通常采用組織活檢，但其存在侵入性取樣、腫瘤異質(zhì)性、瘤體破裂和患者依從性差等限制。液體活檢是從原發(fā)或遠(yuǎn)處腫瘤位置呈現(xiàn)疾病的快照，可用于腫瘤標(biāo)志物的重復(fù)取樣，被認(rèn)為是比傳統(tǒng)組織活檢更為實用的動態(tài)監(jiān)測方法［6］。外泌體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，普遍存在于血液、尿液、膽汁、唾液等體液中［7］。研究表明癌細(xì)胞可以釋放攜帶PD-L1 的外泌體［8］。外泌體PD-L1（exosome PD-L1，ePD-L1）與細(xì)胞表面PD-L1 具有相同的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［9］，可直接與PD-1 結(jié)合誘導(dǎo)免疫抑制，從而抑制細(xì)胞毒性T 細(xì)胞功能，促使腫瘤免疫逃逸［10］。FAN 等［11］對1 例轉(zhuǎn)移性胃癌患者血漿ePD-L1 進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與免疫細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，可反映患者免疫抑制狀態(tài)。本研究檢測胃癌血漿和組織間隙ePD-1 的表達(dá)水平，分析其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為胃癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院2021 年12 月至2022 年12 月的40 例術(shù)后病理確診胃腺癌的患者，同時選取20 例無心、肝、腎功能障礙且無原發(fā)惡性腫瘤的健康患者作為對照組。選取10 例癌組織和配對癌旁組織作為實驗組和對照組。所有受試者樣本采集均由本人或委托人簽署知情同意書。本研究經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院倫理委員會審批（編號：2021KYLL203）。

胃癌相關(guān)樣本納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者在術(shù)前未進(jìn)行新輔助治療；（2）患者既往無惡性腫瘤、糖尿病和肝腎疾病等；（3）GC 患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用《胃癌診治指南》2022 年版；（4）納入研究的患者組織由具有GC 診斷經(jīng)驗的病理學(xué)家通過標(biāo)準(zhǔn)蘇木精和伊紅染色切片進(jìn)行組織學(xué)診斷；（5）樣本新鮮且無污染，血漿樣本儲存-80 ℃，解凍后立即使用。組織樣本離體后立即使用。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體的提取收集胃癌和健康患者外周血，置于EDTA 抗凝管內(nèi)。以300×g、2 000×g分別離心10、20 min。吸取上層血漿，以10 000×g離心30 min，去除殘留細(xì)胞碎片。吸取上清轉(zhuǎn)移至超高速離心管，PBS 配平后放入貝克曼超高速離心機(jī)以100 000 ×g離心1 h，倒去上清，PBS 重懸離心管底部，加入PBS 配平后再次以100 000×g離心1 h。倒去上清液并加入100 μL PBS 吹打充分混勻外泌體沉淀，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 組織外泌體的提取胃癌組織離體后立即放入填充PBS 的聚丙烯管，冰上轉(zhuǎn)移至實驗室。使用清潔鑷子將組織轉(zhuǎn)移至含有RPMI-1640 懸浮培養(yǎng)皿中，無菌手術(shù)刀將組織輕輕切成2 mm ×2 mm×2 mm 的小片段。培養(yǎng)皿中加入30 μL 膠原酶D 和4 μL DNase I，置于37 ℃恒溫箱孵育30 min。通過70 μmol/L 過濾器過濾，將過濾液體以300×g、2 000 ×g分別離心10、20 min，以去除細(xì)胞和組織碎片。吸取上清配平后放入貝克曼超高速離心機(jī)以118 000 ×g離心2 h。PBS 重懸沉淀顆粒，置于-80 ℃儲存。所有離心均在4 ℃下完成。

1.2.3 透射電子顯微鏡（TEM）室溫條件下，移液槍吸取100 μL 重懸外泌體，向其加入2.5%戊二醛固定。在銅網(wǎng)上滴加10 μL 外泌體懸液，室溫靜置10 min，吸水紙吸取多余液體，吸取15 μL 的2%磷鎢酸溶液滴加到銅網(wǎng)上復(fù)染處理3 min，然后置于白熾燈下孵育10 min 使外泌體懸液干燥。將銅網(wǎng)移至透射電鏡樣品槽內(nèi)并觀察外泌體大小及形態(tài)，獲取電鏡成像結(jié)果。

1.2.4 免疫印跡實驗（WB）將血漿外泌體懸液和蛋白提取試劑RIPA 蛋白裂解液混合。BCA蛋白測定外泌體總蛋白濃度。采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳外泌體總蛋白，并電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h，用抗CD81、TSG101、HSP70、Calnexin 等一抗孵育過夜（4 ℃）。次日TBST 溶液漂洗3 次，并與二抗孵育60 min。TBST 溶液洗膜3 次。采用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯影。

1.2.5 ePD-L1 蛋白檢測按照說明書配制洗滌稀釋液、生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液。標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋濃度為625、312.5、156.25、78.125 pg/mL。向酶標(biāo)反應(yīng)孔中加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和外泌體樣本，封板后37 ℃恒溫箱孵育90 min。洗板3 次。酶標(biāo)反應(yīng)孔中加入100 μL 生物素化抗體工作液，混勻封板后置于37 ℃恒溫箱恒溫孵育60 min。洗板4 次。酶標(biāo)反應(yīng)孔中加入100 μL 酶結(jié)合物工作液，混勻封板后置于37 ℃恒溫箱恒溫孵育30 min。洗板5 次。酶標(biāo)反應(yīng)孔加入100 μL 顯色底物，混勻封板后避光顯色15 min。加入50 μL 終止液。酶標(biāo)儀讀取450 nm波長下反應(yīng)孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動計算ePDL1 濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法借助SPSS23.0 和Graphpad prism 8.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料比較組間差異，采用兩獨立樣本t檢驗、校正t檢驗或秩和檢驗。計數(shù)資料比較組間差異采用χ2檢驗、連續(xù)性校正χ2檢驗或Fisher's 確切概率法。兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。繪制ROC曲線對ePDL1 的診斷價值與意義展開評價。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的分離與鑒定TEM 觀察血漿和組織間隙外泌體高度相似，均為“碟”狀或具有雙層膜的球形囊泡，囊泡邊緣密度高，直徑約30～120 nm（圖1A、C）。WB 實驗對外泌體膜特異性陽性蛋白標(biāo)志物CD81、TSG101、HSP70 的表達(dá)及陰性蛋白標(biāo)記物Calnexin 的表達(dá)進(jìn)行測定（圖1B、D）。

圖1 A、C，血漿、組織外泌體TEM 成像；B、D，WB 檢測血漿、組織外泌體標(biāo)志蛋白Fig.1 A、C，TEM images of plasma and tissue exosomes；B、D，WB were used to detect exosome marker proteins in plasma and tissue

2.2 血漿和組織間隙ePD-L1 的表達(dá)情況血漿ePD-L1 表達(dá)水平在胃癌和健康對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），胃癌組表達(dá)水平顯著高于健康對照組。胃癌組織ePD-L1 表達(dá)水平高于癌旁組織外泌體，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ePD-L1 在胃癌血漿（A）和組織中的表達(dá)水平（B）Fig.2 Expression levels of ePD-L1 in plasma（A）and tissues of gastric cancer（B）

2.3 胃癌血漿和組織ePD-L1 表達(dá)相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)性顯示，血漿和組織ePD-L1 表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.731 5，P=0.016 2），見圖3。

圖3 GC 血漿和組織PD-L1 相對濃度之間的相關(guān)性Fig.3 Correlation between plasma and tissue relative concentrations of PD-L1 in GC

2.4 胃癌血漿ePD-L1 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系ePD-L1 表達(dá)水平與CA19-9、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM 分期等顯著相關(guān)（P＜0.05）。與年齡、性別、BMI、CEA、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

表1 血漿ePD-L1 表達(dá)和胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between plasma ePD-L1 expression and clinicopathologic features in patients with gastric cancer 例（%）

2.5 組織ePD-L1的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Ⅲ、Ⅳ期組織ePD-L1 的表達(dá)顯著高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.01），此外，組織ePD-L1 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度、腫瘤大小等有相關(guān)性（P＜0.01），但與分化程度無相關(guān)性（P=0.67）。見圖4。

圖4 胃癌組織ePD-L1 的表達(dá)水平Fig.4 Expression level of ePD-L1 in gastric cancer

2.6 血清CEA、CA19-9 和血漿ePD-L1 表達(dá)對胃癌的診斷價值ROC 曲線分析顯示血清CA19-9、CEA 的AUC 分別為0.676、0.758，ePD-L1 的AUC 為0.796（95%CI：0.658～0.935，P＜0.001），具有較好的靈敏度（表2）。三者聯(lián)合用于診斷GC 的曲線下面積為0.905，靈敏度為75%，特異度為90%（圖5）。

表2 ePD-L1、CA19-9、CEA 的診斷效能Tab.2 Diagnostic efficacy of ePD-L1，CA19-9 and CEA

圖5 ROC 曲線分析CA19-9、CEA、ePD-L1 對GC 的診斷效能Fig.5 ROC curve analysis of the diagnostic efficiency of CA19-9，CEA and ePD-L1 for GC

3 討論

外泌體是近年來興起的一種納米級細(xì)胞囊泡，其攜帶豐富的生物學(xué)信息，釋放后可與受體細(xì)胞結(jié)合參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，影響受體細(xì)胞的生理功能［12］。隨著對外泌體的不斷深入了解，發(fā)現(xiàn)其通過致癌蛋白和核酸參與了腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫逃避及腫瘤耐藥［13-15］。其中外泌體對腫瘤免疫的影響引起學(xué)者關(guān)注，腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體將局部免疫抑制特性傳播到整個腫瘤微環(huán)境中，并參與建立轉(zhuǎn)移性生態(tài)位［16］。腫瘤來源的外泌體富含PD-L1，其表達(dá)水平與腫瘤分期、免疫治療的反應(yīng)性和預(yù)后顯著相關(guān)［17-19］。LI等［20］對非小細(xì)胞肺癌患者血漿ePD-L1 進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、轉(zhuǎn)移和pTNM 分期顯著相關(guān)。本研究中血漿ePD-L1也被證明在胃癌的發(fā)展過程中具有一定作用，我們發(fā)現(xiàn)胃癌血漿ePD-L1 表達(dá)水平高于健康對照組，其表達(dá)與CA19-9、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和pTNM 分期等臨床病理特征顯著相關(guān)。進(jìn)一步通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，血漿ePD-L1 用于診斷GC 的曲線下面積為0.796。CA19-9、CEA 的AUC 值分別為0.676 和0.758，可以看出，ePD-L1 對于胃癌的診斷效能優(yōu)于CEA 和CA19-9。此外，三者聯(lián)合診斷胃癌的最大AUC 值為0.905，特異度和靈敏度分別為90%和75%。

腫瘤微環(huán)境是以腫瘤細(xì)胞為中心的動態(tài)生態(tài)系統(tǒng)［21］，組織間隙外泌體在腫瘤微環(huán)境信號傳導(dǎo)發(fā)揮重要作用［22］。CRESCITELLI 等［22］在結(jié)腸癌組織切片中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞縫隙中存在大量形態(tài)不同的外泌體。在本研究中，我們使用組織解離和差速超速離心的方式分離出組織間隙外泌體，并檢測出癌組織間隙ePD-L1 的表達(dá)水平高于癌旁組織間隙。Pearson 相關(guān)性分析顯示血漿ePD-L1與組織ePD-L1 的表達(dá)呈正相關(guān)升高。由此，我們可以推斷GC 血漿ePD-L1 可能來源于組織間隙ePD-L1。

總而言之，ePD-L1 在胃癌患者血漿和組織中表達(dá)均升高，其表達(dá)與胃癌臨床病理特征相關(guān)，可能參與胃癌進(jìn)展。因此可作為胃癌可靠診斷生物標(biāo)志物。