陳書秀，李曉捷，李霞，孫娟，趙楠，史良

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264003）

海帶是一種具有很高營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值的大型褐藻，也是最早實現(xiàn)全人工養(yǎng)殖和育苗的藻類之一，在食品、化工、藥用等的市場需求量日益增加。海帶養(yǎng)殖也在防治赤潮，促進(jìn)海區(qū)生態(tài)平衡方面起到重要的作用。因此，海帶養(yǎng)殖具良好的發(fā)展前景。苗種繁育是海帶大規(guī)模養(yǎng)殖的前提，目前采用的育苗方式主要有兩種:以海帶生活史為依據(jù)的傳統(tǒng)夏苗培育和以海帶配子體特性為依據(jù)的克隆育苗方法。與前者相比，克隆育苗方法工藝簡單，品種純度較高，且不受季節(jié)限制，是推動海帶育苗產(chǎn)業(yè)化的新模式。

配子體克隆育苗方法主要由配子體大規(guī)模培養(yǎng)、采苗和育苗管理3 部分構(gòu)成，其中配子體人工高密度培養(yǎng)是該方法產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。目前已對配子體種質(zhì)資源的保存[1-3]、培養(yǎng)條件[4-10]、擴培方法[11-14]等進(jìn)行了大量研究，得出了海帶配子體適宜生長的溫度、光照及所需氮磷濃度范圍；可采取的擴培方法有打碎接種和通氣懸浮培養(yǎng)等。配子體培養(yǎng)不僅需要N、P、Fe 等營養(yǎng)的供應(yīng)，無機碳也是配子體生長利用量最大的營養(yǎng)成分之一。岳國峰等[13,14]研究發(fā)現(xiàn)，海帶雌雄配子體只能利用游離的CO2作為碳源。海水中游離的CO2僅占無機碳總量的0.5%，當(dāng)海帶配子體高密度培養(yǎng)時，無機碳必將成為最主要的限制因子。目前采用通空氣懸浮培養(yǎng)方法，主要作用是攪拌混勻和防止氧積累，對無機碳的補充作用不大。海水總無機碳濃度主要由溫度、堿度、鹽度和pH 決定，在其他條件一致的情況下，pH 可直接顯示無機碳的變化[15]。隨著無機碳濃度的改變，所引起的pH 的變化也會對海藻的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響[16-19]。因此，在補充無機碳的過程中，必須保證pH 變化范圍與所培養(yǎng)海藻的適應(yīng)范圍相一致。

海帶“奔?！笔菢s成等養(yǎng)殖時間較長、較廣的海帶品種，是中國海洋大學(xué)劉濤教授及其團隊與山東尋山集團公司歷時5 年（2006—2011）聯(lián)合培育出的優(yōu)良海帶品種，其與海帶親緣關(guān)系很近[20,21]，與海帶的分化未達(dá)到種的水平，仍屬于海帶[22]。該研究嘗試在此海帶配子體通空氣高密度連續(xù)培養(yǎng)過程中，以CO2配氣裝置補充無機碳源，并通過控制培養(yǎng)液的pH 調(diào)整CO2的補充量及補充頻率，使海帶配子體在充足的碳源和適宜的pH 的范圍內(nèi)生長，提高海帶配子體的生長率，以期為海帶配子體高密度培養(yǎng)提供一種更加高效的方式。

1 材料與方法

1.1 材料

取自實驗室保存的海帶‘奔牛’雌雄配子體在8℃～10℃、24 h 光照和光照強度30 μmol/（m2·s）下加富滅菌海水（10 mg/L NaNO3-N，1 mg/L KH2PO4-P）培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 配子體克隆的處理

取適量的雌雄配子體于容積為5 000 mL 的加入3 000 mL 滅菌海水的三角瓶中，利用小循環(huán)泵破碎處理10～15 min。粉碎后細(xì)胞液經(jīng)300 目篩絹過濾，使雌雄配子體細(xì)胞段大小基本達(dá)到2～5 個細(xì)胞。

1.2.2 不同pH 對海帶配子體生長的影響

將處理過的雌雄配子體分別等體積、等密度加入于培養(yǎng)皿中，讓其自然附著于載玻片上。在海水中添加NaNO3和KH2PO4，總有效N 為10 mg/L，有效P 為1 mg/L 作為培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為：24 h 光照、光照強度40 μmol/（m2·s）、溫度為10℃。3 d 后更換不同初始PH（6.0、7.0）的培養(yǎng)液，以正常海水（pH8.2）培養(yǎng)液為對照組（組③），初始pH6.0 為組①、初始pH7.0 為組②。每6 h 測定pH 并更換培養(yǎng)液，經(jīng)過30 d 培養(yǎng)之后，拍照（Olympus Ⅸ51）,并采用Image-pro 統(tǒng)計數(shù)據(jù)。每個處理組設(shè)3 個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿測定了3 個數(shù)據(jù)，即每個處理組共記錄9 個數(shù)據(jù)（n=9）。根據(jù)初始配子體平均長度（L0）和實驗結(jié)束時配子體平均總長度（L1）計算相對生長速率（RGR，%/d），即RGR=100×［ln（L1）－ln（L0）］/t，其中t 為試驗天數(shù)（d）。pH 采用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)，用pH 計測定。

1.2.3 不同培養(yǎng)方式對海帶配子體生長的影響

在18.9 L 礦泉水桶（有效水體15 L）中，以0.5 g/L 的密度接種處理過的海帶雌雄配子體。在海水中添加NaNO3和KH2PO4總有效N 為10 mg/L，有效P 為1 mg/L 作為培養(yǎng)液。在24 h 光照，光照強度40 μmol/（m2·s），溫度為10℃條件下培養(yǎng)。每5 d 更換一次培養(yǎng)液，15 d 時克隆液倒入篩絹過濾至不滴水時測量鮮重，計算特定生長率（SGR）。計算公式SGR=100%×[ln（W2）-ln（W1）]/（t2-t1），其中W1=起始重量，W2=結(jié)束重量，t1=起始時間，t2=結(jié)束時間。利用pH 計測定培養(yǎng)液48 h 的pH 變化。采用3 種培養(yǎng)模式，每種培養(yǎng)模式設(shè)置3 個重復(fù)。

具體方式如下：Ⅰ：靜置培養(yǎng)，每天搖瓶3 次，避免配子體克隆貼于瓶底；Ⅱ：通空氣懸浮培養(yǎng)，充氣機和培養(yǎng)容器之間安裝空氣過濾系統(tǒng)，充氣速率為400 mL/min，充氣頻率為每30 min 充氣5 min，每天共充氣24 次，以觀察到克隆上下翻轉(zhuǎn)為準(zhǔn)。Ⅲ：定時定量補充CO2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)：在培養(yǎng)方式Ⅱ的基礎(chǔ)上，每2 d 每桶用純CO2壓力罐補充CO2（1～2 min），直到培養(yǎng)液pH7.0，充氣量為120 L/h。

1.2.4 不同配子體擴增培養(yǎng)方式對海帶配子體發(fā)育的影響

取1.2.3 實驗中3 種繼代培養(yǎng)方式培養(yǎng)60 d 的海帶雌雄配子體，分別用300 目篩絹過濾，獲得含2～5 個細(xì)胞的細(xì)胞段懸濁液，然后每組的雌雄配子體按照質(zhì)量比2∶1 的比例混合均勻。取一定量的雌雄混合懸濁液加入到12 cm（直徑）的培養(yǎng)皿中，放置在溫度10℃，鹽度31，光照強度30 μmol/（m2·s），光照周期均為10L∶14D 條件下培養(yǎng)。在海水中添加NaNO3、KH2PO4、檸檬酸鐵作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中總有效氮為10 mg/L，有效磷為1 mg/L，有效鐵為0.5 mg/L。每個處理組3 個重復(fù)。每個培養(yǎng)皿隨機觀察10 個100×視野，分別統(tǒng)計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細(xì)胞數(shù)，按卵囊形成數(shù)、排卵數(shù)和孢子體數(shù)之和占總細(xì)胞數(shù)的百分比計算發(fā)育率。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH 對海帶配子體生長的影響

間隔6 h 更換調(diào)整一次，處理組①、②、③的pH分別維持在6.0～6.1、7.0～7.1，及8.2～8.3。

由表1 可知，所用模型有統(tǒng)計學(xué)意義。pH（P<0.001）、性別（P<0.05）對海帶’配子體生長有顯著影響，但pH 與性別的交互作用對海帶配子體生長無顯著影響（P>0.05）。Eta2pH>Eta2性別，表明pH對海帶’奔?！渥芋w克隆生長的影響大于性別的影響。pH 及性別對海帶配子體的生長有顯著影響。

表1 不同pH、性別對海帶’奔牛’配子體生長影響的方差分析Tab.1 Variance analysis of effects of different pH values and sexuality on the growth of kelp S.japonica’Benniu’gametophytes

圖1 為雌雄配子體克隆的相對生長率在不同處理組的變化情況。結(jié)果顯示，處理組①（pH6.0～6.5），雌雄配子體相對生長率[♀（4.61±1.28）%，♂（3.35±1.23）%]顯著低于其他2 組，雌配子體的相對生長率（4.61±1.28）%顯著高于雄配子體（3.35±1.23）%。處理組②（pH7.0～7.3）雌雄配子體的相對生長率與對照組③無顯著差異（P>0.05），且在2 組培養(yǎng)條件下，雌、雄配子體的相對生長率無顯著差異（P>0.05）。

圖1 不同pH 下海帶’奔牛’雌雄配子體相對生長率Fig.1 Relative growth rate of female and male gametophytes of kelp S.japonica’Benniu’exposed to different pH values.Data are shown as means and SD（n=3）

2.2 不同培養(yǎng)方式及性別對海帶’奔?！渥芋w生長的影響

48 h 內(nèi)培養(yǎng)方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ培養(yǎng)液的pH 變化范圍分別為8.2～8.9，8.2～8.8 和7.0～8.3（圖2）。

圖2 海帶配子體培養(yǎng)液48 h 內(nèi)pH 變化Fig.2 The range of medium pH during 48 h

由表2 可知，所用模型有統(tǒng)計學(xué)意義，即培養(yǎng)方式（P<0.001）及性別（P<0.001）極顯著影響海帶’奔牛’配子體克隆的生長，但培養(yǎng)方式與性別的交互作用對海帶配子體克隆生長無顯著影響（P>0.05）。Eta2培養(yǎng)方式的影響>Eta2性別的影響，即培養(yǎng)方式對配子體克隆生長的影響大于性別。

表2 不同培養(yǎng)方式、性別對海帶’奔?！渥芋w生長影響的方差分析結(jié)果Tab.2 Variance analysis of effects of different culture methods and sexuality on the growth of gametophytes in kelp S.Japonica‘Benniu’

不同實驗組的雌雄配子體克隆的特定生長率不同。靜置培養(yǎng)方式下，雌雄配子體特定生長率（♀10.03%，♂9.21%）顯著低于其他2 種培養(yǎng)方式。在3 種培養(yǎng)方式條件下，雌配子體（10.03%～15.41%）的特定生長率顯著高于雄配子體（9.21%～13.70%）。在補充CO2+通空氣懸浮培養(yǎng)條件下，雌雄配子體的特定生長率（♀15.41%；♂13.70%）顯著高于其他2種培養(yǎng)方式（圖3）。

圖3 不同培養(yǎng)方式下海帶’奔?！菩叟渥芋w特定生長率Fig.3 Specific growth rate of female and male gametophytes in kelp S.japonica‘Benniu’under the different cultivation methods.Data are shown as means and SD（n=3）

2.3 不同配子體擴增培養(yǎng)方式對海帶配子體發(fā)育的影響

在3 種配子體擴增培養(yǎng)方式下培養(yǎng)60 d 的配子體均可正常發(fā)育，且各組間的發(fā)育率無顯著差異（P>0.05，表3）。隨著發(fā)育時間的延長，各組的發(fā)育率顯著增加（發(fā)育時間P<0.001，表3）。3 種擴增培養(yǎng)方式培養(yǎng)的配子體均在第14 d 出現(xiàn)卵囊并排卵（表4），第27 d 的小苗率均在60%以上，最終發(fā)育率無顯著差異（P>0.05，表5）。

表3 不同配子體擴增培養(yǎng)方式及發(fā)育時間對海帶’奔?！渥芋w發(fā)育影響的方差分析結(jié)果Tab.3 Variance analysis of effects of different culture methods and development periods on the development of kelp S.Japonica‘Benniu’gametophytes

表4 不同擴增培養(yǎng)方式對海帶’奔?！渥芋w發(fā)育的影響Tab.4 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’n=3;D；%

表4 不同擴增培養(yǎng)方式對海帶’奔?！渥芋w發(fā)育的影響Tab.4 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’n=3;D；%

表5 不同擴增培養(yǎng)方式對海帶’奔牛’配子體發(fā)育率的影響Tab.5 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’.Data are shown as means and SD（n=3）n=3;（D；%

表5 不同擴增培養(yǎng)方式對海帶’奔?！渥芋w發(fā)育率的影響Tab.5 Effects of different culture methods on gametophyte development rate of kelp S.japonica ’Benniu’.Data are shown as means and SD（n=3）n=3;（D；%

注：同一列上的相同大寫字母表示發(fā)育率在相同培養(yǎng)時間不同培養(yǎng)方式下差異不顯著（P>0.05）；同一行上的不同小寫字母表示發(fā)育率在相同培養(yǎng)方式不同培養(yǎng)時間差異顯著（P<0.05）。Note:Means with the same capital letters in the same column are not significant differences between culture methods（P>0.05）;means with the different letters in the same line are significant differences between sampling times in the same culture method（P<0.05）.

3 討論

3.1 不同pH 和培養(yǎng)方式對海帶配子體生長的影響

海水中的無機碳是海洋藻類生長利用量最大的營養(yǎng)成分之一，是進(jìn)行光合作用的必需碳源，但不同藻類利用無機碳的形式不同，不同藻類即使在相同生長條件下所利用的無機碳濃度也不盡相同[13-15,23-25]。岳國峰等[13,14]比較了海帶配子體和幼孢子體無機碳素營養(yǎng)的利用，發(fā)現(xiàn)海帶雌雄配子體只能利用游離的CO2為碳源，海水中CO2濃度的升高有效加快了雌雄配子體利用無機碳的速度；還發(fā)現(xiàn)海水pH 升高會抑制海帶配子體對無機碳的利用。pH8.7 時配子體對無機碳的吸收利用率降低40%。本實驗結(jié)果表明，pH（P<0.001）顯著影響海帶’奔?！渥芋w生長，pH7.0～7.5 組配子體相對生長率最高。靜置培養(yǎng)與傳統(tǒng)通空氣懸浮培養(yǎng)條件下的特定生長率也顯著低于補充CO2培養(yǎng)組，前者的pH 在48 h 達(dá)到8.7～8.9，這可能是配子體生長受限的重要因素之一。海水總無機碳濃度主要由溫度、堿度、鹽度和pH 決定，在其他條件一致的情況下，pH 可直接顯示無機碳的變化。Skirrow 等[15]研究表明，天然海水中（pH8.1～8.3），CO2濃度隨著pH 的升高而逐漸降低，當(dāng)pH 接近于9 時，游離CO2濃度接近于0。因此，靜置培養(yǎng)與傳統(tǒng)通空氣懸浮培養(yǎng)條件下的pH 達(dá)到8.7～8.9，表明培養(yǎng)液中CO2已成為限制因素，若不及時更換培養(yǎng)液，配子體生長將會受到抑制。

該實驗嘗試在傳統(tǒng)通氣懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上定時定量補償CO2，將培養(yǎng)液pH 持續(xù)穩(wěn)定在7.0～8.4左右，并保持CO2的含量一直處于較高的水平，由此保證碳源充足，減少pH 升高引起的負(fù)面效應(yīng)。結(jié)果表明，該方法培養(yǎng)的配子體特定生長率顯著高于其他2 組。此結(jié)論與張栩等[26]結(jié)論相同，但與之相比，本文所采用的補充CO2的方法簡單易操作，節(jié)約成本，更有利于在育苗基地推廣使用。

3.2 不同pH 和培養(yǎng)方式對海帶配子體發(fā)育的影響

CO2進(jìn)入海水后，會發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，改變海水酸化和酸堿度平衡等，不可避免地影響海水中的海藻等初級生產(chǎn)者。高濃度CO2對海藻的生長速率、光合作用、呼吸作用、生化組分、營養(yǎng)鹽的吸收等都有顯著影響，且存在明顯的種間差異[27-32]。這些差異性不僅與藻體無機碳利用機制有關(guān)，也有可能是CO2加富使水體中pH 下降引起。如pH 降低會對某些褐藻的生長和光合作用造成較大的負(fù)面效應(yīng)[33]，也會影響海帶如巨藻（Macrocystis pyrifera）等早期生命史階段游孢子萌發(fā)、配子體性別比例、配子體發(fā)育等[16-19]。Roleda 等[17]研究表明，pH 降低至7.59～7.60，巨藻游孢子的萌發(fā)率顯著降低，配子體生長也受到一定的抑制，但同時加入可溶解無機碳，有效減少了pH 降低引起的這種負(fù)面效應(yīng)。Leal等[19]研究發(fā)現(xiàn)，pH 降低提高了巨藻和裙帶菜（Undaria pinnatifida）游孢子的萌發(fā)率，促進(jìn)了配子體的生長，對配子體性別比例及其后期發(fā)育無顯著影響。該研究表明，適量增加海水培養(yǎng)液中CO2對海帶配子體生長有明顯的促進(jìn)作用；當(dāng)配子體長期處在pH<7 的環(huán)境中，生長顯著受抑制。

為了檢驗配子體長期在較高濃度CO2的海水培養(yǎng)液中生長，是否會對其發(fā)育能力產(chǎn)生不利的影響。以在3 種不同方式下培養(yǎng)60 d 的海帶’奔?！菩叟渥芋w以質(zhì)量比2∶1 混合后，在適宜條件下進(jìn)行了發(fā)育培養(yǎng)，實驗結(jié)果顯示，3 種培養(yǎng)方式下培養(yǎng)的配子體均可正常發(fā)育，發(fā)育進(jìn)程及發(fā)育率無顯著差異。由此可以看出，在傳統(tǒng)通空氣擴增培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)培養(yǎng)液pH 變化，定時定量補充CO2可以用于海帶配子體大規(guī)模高密度培養(yǎng)，與光生物反應(yīng)器相比，成本低廉，操作簡便，適合在育苗基地大規(guī)模推廣。

3.3 結(jié)論

比較發(fā)現(xiàn)：配子體生長的最適生長pH 范圍為7.0～8.3。其次從配子體培養(yǎng)成本出發(fā)，通空氣懸浮培養(yǎng)過程中每2 d 補充一次CO2，利用純CO2壓力罐（出氣量：120 L/h）向15 L 海水中充氣1～2 min，保證了充足的碳源，使培養(yǎng)液pH 范圍控制在7.0～8.4，排除了pH 對配子體生長不利影響，避免了頻繁測定pH 對配子體的混種或雜藻等污染。發(fā)育實驗檢驗了該方法使配子體長期處在較高濃度CO2的海水培養(yǎng)液中生長，并未對其發(fā)育能力產(chǎn)生不利的影響。該方法可用于海帶配子體大規(guī)模高密度培養(yǎng)成本低廉，操作簡便，適合在育苗基地大規(guī)模推廣。