張冀野，王世興，劉東姣，杜新科，牟晉華，申旭紅

（中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670）

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量居世界首位[1]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水污染問題也日益凸顯[2]。魚菜共生模式是將傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖與水培蔬菜有機結(jié)合的生態(tài)友好型養(yǎng)殖模式[3]，構(gòu)建魚-微生物群-植物的協(xié)同體系，將魚類殘餌和排泄物等含氮成分轉(zhuǎn)化為毒性較小的硝酸鹽，供植物生長[4]。該模式通過植物生長實現(xiàn)氮的轉(zhuǎn)化和利用，有效控制可溶性含氮物濃度，達到水質(zhì)凈化和農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的雙重目的[5]。

魚類腸道菌群在維持魚體健康中發(fā)揮重要作用，具有促進魚類新陳代謝、增強免疫、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌以及激發(fā)腸上皮細胞的增殖等功能[6-8]。廣義上，魚類腸道菌群分屬兩大類：原籍菌群和外籍菌群[7]。原籍菌群能促進腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)，抑制病原體的入侵和增殖，其中的益生菌對改善腸道菌群平衡有積極作用[8-10]。外籍菌群在正常情況下能保持腸道菌群動態(tài)平衡，但當養(yǎng)殖環(huán)境惡化時，極有可能惡性增殖，導致疾病發(fā)生[6]。魚類腸道菌群的組成、結(jié)構(gòu)和功能易受各種環(huán)境因素的影響[9]。近年來，魚菜共生系統(tǒng)菌群多樣性研究受到廣泛關(guān)注，主要集中于植物根際和水環(huán)境微生物菌群[10,11]。Goddek 等[12]研究表明，魚菜共生系統(tǒng)根際微生物菌群能有效促進植物生長；Sanchez 等[13]發(fā)現(xiàn)，魚菜共生養(yǎng)殖水體中存在豐富的益生菌。有關(guān)魚菜共生系統(tǒng)魚體腸道菌群的研究尚少，主要為室外天然養(yǎng)殖水體魚體腸道菌群研究[14,15]。本研究在環(huán)境可控的實驗室條件下探究魚菜共生模式對魚體腸道菌群產(chǎn)生的影響，避免開放環(huán)境干擾，能夠獲得更接近實際的結(jié)果。

麥穗魚（Pseudorasbora parva）個體較小，肉質(zhì)細嫩，富含氨基酸，對水質(zhì)敏感，是一種具有水質(zhì)監(jiān)測功能的潛在經(jīng)濟魚類[16,17]。目前尚無針對麥穗魚腸道菌群的研究。羅莎生菜（Lactuca sativa）和水蕹菜（Ipomoea aquatica）為大眾餐桌常見的蔬菜，具有生長快，穩(wěn)定性強的特點[18]。本研究選擇麥穗魚、羅莎生菜和水蕹菜，建立麥穗魚-羅莎生菜和麥穗魚-水蕹菜兩種魚菜共生系統(tǒng)，以單獨養(yǎng)殖麥穗魚的系統(tǒng)作為對照，研究不同系統(tǒng)中麥穗魚腸道菌群的結(jié)構(gòu)特點，為魚菜共生系統(tǒng)魚類腸道菌群研究及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用麥穗魚捕撈于煙臺市牟平區(qū)野外池塘，選取生長狀況良好、規(guī)格相似的麥穗魚108 尾，平均初始體長為（7.30±0.56）cm，平均初始體質(zhì)量為（3.88±0.78）g，消毒，進行馴養(yǎng)與蔬菜暫養(yǎng)，后進行試驗。羅莎生菜平均株高（13.85±0.92）cm；水蕹菜平均株高（26.10±1.84）cm，均購自山東壽禾種業(yè)。試驗餌料按藍鯽飼料與拉絲蛋白粉以1∶0.2 比例配置，粒徑約1.0 mm。

養(yǎng)殖試驗從2020 年11 月24 日起，至2021 年1 月4 日結(jié)束，持續(xù)6 周。養(yǎng)殖期間，麥穗魚于每日早、中、晚定時投喂，及時補水以保持水體體積恒定，時刻保持水質(zhì)良好，水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標準。

1.2 方法

試驗于中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院實驗室內(nèi)完成。試驗分為3 組：麥穗魚-羅莎生菜（PL 組）、麥穗魚-水蕹菜（PI 組）；單養(yǎng)麥穗魚的對照組（PT組）。每組設(shè)3 個重復。試驗用9 個泡沫養(yǎng)殖箱，規(guī)格見圖1，每個箱內(nèi)養(yǎng)殖麥穗魚12 尾。每個魚菜共生養(yǎng)殖箱的箱體邊緣都固定等面積蔬菜浮床（覆蓋面積占水體面積的35%），浮床底部覆蓋紗布以避免魚類啃食。試驗設(shè)計如圖1。

圖1 試驗設(shè)計詳圖Fig.1 The schematic diagram of experimental tanks

1.3 腸道樣品采集

試驗結(jié)束時，從每個平行組隨機取一尾健康麥穗魚，用MS222 麻醉后，測量體質(zhì)量和體長，用70%乙醇和無菌水沖洗魚體，在無菌環(huán)境下完整取出每尾魚的整個腸道（食道后端至肛門）。將每個處理組的3 個魚體腸道混合為1 個樣本，保存于-80℃冰箱中，直至進行微生物組分析。

1.4 DNA 的提取和高通量測序

利用E.Z.N.A.Soil DNA 試劑盒（Omega，美國）提取總?cè)郝浠蚪MDNA。為確保提取出足夠數(shù)量的高質(zhì)量基因組DNA，使用Qubit 3.0（life，美國）測量DNA 濃度。

PCR 擴增16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)。采用KAPA HiFi Hot Start Ready Mix（TaKaRa Bio，日本）進行擴增，引物：正向（CCTACGGGNGGCWGCAG）和反向（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。擴增程序為：95℃預變性3 min，隨后進行25 次擴增循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后一輪循環(huán)結(jié)束后保持72℃延伸5 min（PCR 儀：ABI GeneAmp9700 型）。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，利用AMPure XP beads 純化擴增產(chǎn)物。使用Qubit 3.0 測定文庫DNA 濃度，用生物分析儀（Agilent 2100，美國）對其進行質(zhì)量控制。構(gòu)建測序文庫并在Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.5 生物信息學和統(tǒng)計分析

高通量測序?qū)? 份腸道樣品的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控處理，并對每個樣品的reads 隨機采樣至相同的測序深度以達到抽平效果。將所有不包含引物的有效細菌序列移交至下游分析。試驗篩選核苷酸相似度為97%的OTUs，并將其歸一化以控制噪音。

用Mothur 1.43.0 分析物種豐度、Alpha 多樣性指數(shù)。物種稀釋曲線由PAST 制成。使用R 軟件的hclust 函數(shù)構(gòu)建聚類樹。通過PICRUSt2 預測不同養(yǎng)殖系統(tǒng)中麥穗魚的代謝活動，根據(jù)京都基因和基因組百科全書（KEGG）進行功能推斷。采用Origin 繪制豐度堆積圖和熱圖，并對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，描述性統(tǒng)計值以平均值±標準差（Mean±SD）表示，差異顯著性水平為P<0.05，若存在顯著性差異，再進行Duncan’s 多重比較以檢驗組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚類生長指標

經(jīng)過6 周的養(yǎng)殖試驗，3 種養(yǎng)殖系統(tǒng)中麥穗魚體質(zhì)量和體長均增加，但是，各組間末體質(zhì)量和末體長差異不顯著（P＞0.05）（表1）。其中，PL 組和PI組的存活率均顯著高于PT 組（對照組）（P＜0.05）。

表1 不同養(yǎng)殖系統(tǒng)中麥穗魚的生長情況和存活率Tab.1 Growth performance and survival rate of top mouth gudgeon P.parva in different farming systems

2.2 腸道菌群多樣性

對樣品進行測序共獲得有效序列266 758 條，平均序列數(shù)88 919 條，PL 組、PI 組和PT 組序列數(shù)分別為92 529、95 925 和79 204 條。按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，共得到6 938 個OTU 的代表序列。稀釋曲線如圖2 顯示，伴隨測序深度的增加，各樣本的OTU 數(shù)趨于平緩，說明測序質(zhì)量可靠，測序結(jié)果能夠反映不同養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)麥穗魚腸道菌群的組成。利用不同養(yǎng)殖系統(tǒng)中OTU 檢出數(shù)目進行Alpha 多樣性分析（表2）。其中，Coverage 指數(shù)反映測序結(jié)果的覆蓋率，所有樣本中的Coverage 指數(shù)均≥99.99%，表明樣本中微生物被充分檢出，測序質(zhì)量較好。PI 組中Shannon 指數(shù)最高，其次是PT組，PL 組最低；PI 組同樣具有最高的Simpson 指數(shù)，其次是PL 組，PT 組最低。Chao1 和Ace 指數(shù)反映物種豐富度，PI 組的Chao1 和Ace 指數(shù)最高，其次為PL 組，最后為PT 組。

表2 樣本多樣性指數(shù)Tab.2 The Alpha diversity indices of three samples

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve

通過加權(quán)Unifrac 距離構(gòu)建UPGMA 聚類分析樹（圖3）。PI 組和PL 組的腸道微生物樣本先聚為一支，兩者與PT 組麥穗魚腸道微生物樣本的距離相對較遠。

圖3 層次聚類樹Fig.3 Hierarchical clustering tree

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)

3 種養(yǎng)殖系統(tǒng)中共測出11 個門，其中不能被分類到任何已知類群的序列被認定為“未分類細菌”（unclassified Bacteria），對比分析了排名前5 位菌門的相對豐度。3 種養(yǎng)殖系統(tǒng)中麥穗魚腸道菌群主要由變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）和浮霉菌門（Planctomycetes）組成，但各菌門的比例不同（圖4）。在PL 組中，以變形菌門（61.40%）、擬桿菌門（35.04%）和浮霉菌門（1.54%）為主，占總豐度的97.98%。在PI 組中，以變形菌門（65.05%）、擬桿菌門（26.00%）、厚壁菌門（4.09%）和放線菌門（3.28%）為主，占總豐度的98.42%。PT 組以變形菌門（81.52%）、擬桿菌門（15.33%）和厚壁菌門（1.15%）為主，占總豐度的98.00%。變形菌門在各組中占絕對優(yōu)勢，PT 組中變形菌門明顯高于PL組和PI 組。PL 組和PI 組擬桿菌門占比明顯高于PT 組，PI 組中厚壁菌門和放線菌門占比高于PL 組和PT 組。

圖4 門水平相對豐度堆積圖Fig.4 The relative bacterial abundance at the phylum level

在屬水平細菌相對豐度堆積圖中（圖5），3 個樣本共鑒定出97 個屬，豐度排名前20 的屬占各組豐度的90%以上。在3 種養(yǎng)殖系統(tǒng)中，苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、沉積物桿狀菌屬（Sediminibacterium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）依次為豐度前3 的優(yōu)勢菌屬。PL 組的優(yōu)勢菌屬依次為苯基桿菌屬（42.82%）、沉積物桿狀菌屬（31.19%）、慢生根瘤菌屬（4.33%）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）（4.16%）和井桿菌屬（Phreatobacter）（2.70%），占總豐度的85.20%；PI 組的優(yōu)勢菌屬為苯基桿菌屬（40.37%）、沉積物桿狀菌屬（22.45%）、慢生根瘤菌屬（11.77%）、井桿菌屬（4.59%）、Pontibacter（2.74%）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（2.25%），占總豐度的84.17%；PT 組的優(yōu)勢菌屬為苯基桿菌屬（54.23%）、沉積物桿狀菌屬（13.78%）、慢生根瘤菌屬（9.91%）、Bosea（4.79%）和嗜糖假單胞菌屬（2.69%），占總豐度的85.42%。兩魚菜組（PL 組和PI組）的苯基桿菌屬豐度明顯低于PT 組，而沉積物桿狀菌屬和井桿菌屬豐度明顯高于PT 組。PI 組的慢生根瘤菌屬豐度高于PT 組和PL 組。僅在PT 組中檢測到乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（1.10%）。

圖5 屬水平相對豐度堆積圖Fig.5 The relative bacterial abundance at the genus level

2.4 腸道菌群功能

利用PICRUSt2 預測各養(yǎng)殖模式下麥穗魚腸道細菌群落的功能組成，并通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫對測序數(shù)據(jù)進行比對，除去與魚體無關(guān)的功能通路，共得到29 種二級功能通路（圖6）。在二級通路中，有12 種參與代謝（Metabolism），4 種參與遺傳信息處理（Genetic Information Processing），3 種參與環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing），3 種參與細胞過程途徑（Cellular Processes），7 種參與機體系統(tǒng)（Organismal Systems）一級功能通路。

圖6 PICRUSt2 預測麥穗魚功能聚類熱圖Fig.6 Heat map of predicting function of topmouth gudgeon P.parva through PICRUSt2

KO（KEGG Orthology）豐度熱圖顯示，兩魚菜組（PL 組和PI 組）首先聚集成一支，后與PT 組匯集。在遺傳信息處理方面包含復制、修復（Replication and Repair）等四種二級功能通路，PL 組表達量最高，且與PI 組功能表達量更接近，均高于PT 組。PL組和PI 組的氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、能量代謝（Energy Metabolism）等主要二級代謝功能通路的相似度和豐度高于PT 組。PI 組環(huán)境信息處理方面的表達量明顯高于PL 組與PT 組。

功能預測結(jié)果的準確性可通過NSTI 值評估。利用PICRUSt 對人腸道微生物樣品的預測結(jié)果較好，為0.03±0.02，其他哺乳動物腸道微生物預測結(jié)果為0.14±0.06，土壤樣本為0.17±0.02[19]。本研究中，PL組、PI組、PT組的NSTI 值分別為0.097、0.090 和0.076，預測準確度較高，證明結(jié)果可靠。

3 討論

腸道菌群在魚體生長發(fā)育中具有重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種魚菜共生系統(tǒng)腸道菌群Alpha 多樣性整體高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖系統(tǒng)，其中PI 組微生物群落各項指數(shù)均為最高（表2）。該結(jié)果與Ke 等[15]對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的室外池養(yǎng)結(jié)果一致。聚類樹與功能熱圖中PL 組和PI 組聚集更加緊湊，表明不同魚菜共生系統(tǒng)對麥穗魚腸道菌群的結(jié)構(gòu)有趨同性影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門是麥穗魚腸道菌群的優(yōu)勢門，與先前鯉科魚腸道研究結(jié)果一致[21]。麥穗魚腸道菌群的優(yōu)勢門還有擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和浮霉菌門，這些菌門均也廣泛存在于淡水魚腸道中[18,22]。其中，擬桿菌門和厚壁菌門可通過產(chǎn)生多糖水解酶來降解膳食纖維，產(chǎn)生單糖和短鏈脂肪酸作為魚類能量來源[23]；浮霉菌門可參與復雜化合物代謝，在魚體腸道中亦被發(fā)現(xiàn)具有多糖降解能力[24]。3 種養(yǎng)殖系統(tǒng)中麥穗魚腸道菌群在某些優(yōu)勢門的豐度上存在差異，與PT 組相比，PL 組和PI 組中變形菌門豐度較低。Shin 等[25]將變形菌門豐度的升高作為疾病發(fā)生的潛在判斷標志，故魚菜共生模式可能對維持麥穗魚健康起到積極影響。麥穗魚存活率結(jié)果（表1）進一步顯示，PL 組和PI 組的存活率均顯著高于PT 組（P＜0.05）。

屬水平腸道菌群的組成分析表明，3 種養(yǎng)殖系統(tǒng)中豐度前三的優(yōu)勢菌屬依次為苯基桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、慢生根瘤菌屬，但豐度差異較大。PL 組和PI 組中苯基桿菌屬豐度均低于PT 組。目前苯基桿菌屬對魚體影響未知，有待進一步研究。PL 組和PI 組的沉積物桿狀菌屬豐度明顯高于PT 組。魚類腸道菌群與養(yǎng)殖水環(huán)境中微生物菌群具有很強的相關(guān)性[26]。Van 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，開口前虹鱒（Oncorhynchus mykiss）腸道中的第一優(yōu)勢菌屬沉積物桿狀菌屬來源于其養(yǎng)殖水環(huán)境。本研究推測PL 組和PI 組水環(huán)境中也含有較高豐度的沉積物桿狀菌屬。沉積物桿狀菌屬具有硝化功能，可降低有機物污染，間接促進魚體健康[27]。PL 組和PI 組麥穗魚的存活率更高（表1），一定程度上印證了該推測。慢生根瘤菌屬豐度PI 組>PT 組>PL 組，未體現(xiàn)出魚菜共生模式與傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式的類別差異。該結(jié)果說明，魚菜共生模式中，不同種類的蔬菜對魚體腸道菌群的影響也不同。根瘤菌可以產(chǎn)生多種具有纖維素分解和果膠分解活性的酶，增強魚類消化植物細胞壁的能力，從而提高飼料利用率[28]。本試驗中，PI組慢生根瘤菌屬促進麥穗魚消化多糖的效力最高，PT 組次之，PL 組最低。

PT 組麥穗魚腸道乳酸桿菌屬的豐度明顯高于PL 組和PI 組，這說明魚菜共生模式可能對乳酸桿菌屬在麥穗魚腸道中定植產(chǎn)生負面影響。乳酸桿菌屬被普遍認為是腸道益生菌，屬內(nèi)部分菌種已經(jīng)被加工成口服微生物制劑以抑制病原體繁殖[29]。3 種養(yǎng)殖系統(tǒng)中麥穗魚體質(zhì)量與體長增加量未呈現(xiàn)顯著差異（表1），可能與該因素有關(guān)?；诖?，本研究建議在麥穗魚魚菜共生系統(tǒng)合理添加乳酸桿菌以增強魚體健康。其他魚種的魚菜共生系統(tǒng)也建議將乳酸桿菌作為重點考慮使用的添加劑。

腸道菌群既能促進機體營養(yǎng)物質(zhì)消化，又能與機體的代謝相互作用，影響宿主的正常生理功能[8]。PICRUSt2 揭示魚菜共生模式中菌群對魚體功能的影響（圖6）。相較于PT 組，PI 組和PL 組的大部分代謝功能（包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂代謝等）、機體系統(tǒng)和遺傳信息處理表達增強，有利于魚體營養(yǎng)物質(zhì)的利用及細胞功能的發(fā)揮，促進魚類的生存和生長。故本研究構(gòu)建的兩種魚菜共生系統(tǒng)對麥穗魚腸道菌群結(jié)構(gòu)均起正向效應(yīng)。

PI 組在環(huán)境信息加工能力方面明顯優(yōu)于PL 組和PT 組（圖6），說明PI 組麥穗魚具有更強的抗逆性，能更好地維持腸道菌群的穩(wěn)定性。雖然兩種魚菜共生系統(tǒng)對腸道菌群具有趨同影響，但PI 組麥穗魚在腸道菌群多樣性、腸道有益菌豐度和環(huán)境信息加工方面均優(yōu)于PL 組。對該麥穗魚魚菜共生系統(tǒng)水質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，水蕹菜組的水質(zhì)凈化效果也要優(yōu)于羅莎生菜組[30]。故本研究認為，麥穗魚-水蕹菜系統(tǒng)功能整體優(yōu)于麥穗魚-羅莎生菜系統(tǒng)，其在長期養(yǎng)殖中可能會體現(xiàn)出更明顯優(yōu)勢。

結(jié)論

本研究認為，麥穗魚魚菜共生系統(tǒng)能有效降低魚體腸道變形菌門的豐度，提高沉積物桿狀菌屬的豐度。該系統(tǒng)顯著提高麥穗魚存活率，對其腸道健康有正向促進作用。相較于麥穗魚-羅莎生菜系統(tǒng)，麥穗魚-水蕹菜系統(tǒng)表現(xiàn)出更大的發(fā)展?jié)摿Αａ槍︳~菜共生系統(tǒng)麥穗魚腸道乳酸桿菌相對不足的問題，建議向飼料中添加乳酸桿菌制劑，以提高系統(tǒng)生產(chǎn)力。未來魚菜共生研究應(yīng)充分利用宏基因組等新型測序技術(shù)探明腸道菌群與宿主魚的互作關(guān)系，以設(shè)計出更加合理高效的魚菜共生養(yǎng)殖模式。