胡婧楠 廖 曼 何 濤 李博林 徐偉超 郭立芳 張春旭

(1.河北省中醫(yī)院藥學(xué)部,河北 石家莊 050011;2.河北省中醫(yī)院疼痛科,河北 石家莊 050011;3.河北省中醫(yī)院脾胃病科,河北 石家莊 050011;4.河北省中醫(yī)院設(shè)備處,河北 石家莊 050011)

幽門螺桿菌(Hp)高度適應(yīng)胃環(huán)境,全球約50%的人感染Hp[1]。Hp通過黏附在胃上皮細(xì)胞上,損害胃黏膜,引發(fā)慢性炎性反應(yīng),從而進(jìn)一步擴(kuò)大胃組織損傷[2]。有報(bào)告表明,Hp感染與慢性胃炎、腸上皮化生、胃腺癌和消化不良事件有關(guān)[3-4]。因此,找到一種有效的治療方式,降低機(jī)體炎性反應(yīng),對(duì)于疾病的治療具有重要意義。p38/絲裂原活化蛋白激酶2(p38/mitogen-activated protein kinase 2,p38/MK2)信號(hào)通路是與炎癥性疾病密切相關(guān)的傳導(dǎo)通路,p38/MK2信號(hào)通路的激活可引起機(jī)體炎性反應(yīng)加劇,相關(guān)炎癥因子水平升高[5]。有研究顯示,感染和炎癥發(fā)生時(shí),p38/MK2信號(hào)通路被激活,p38、MK2表達(dá)水平升高,高表達(dá)的p38、MK2可引起機(jī)體炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和IL-6表達(dá)水平升高,從而進(jìn)一步加劇機(jī)體炎性反應(yīng),不利于患者康復(fù)[6]。葛根芩連湯出自《傷寒論》,主要由葛根、黃連、黃芩和甘草組成,具有清熱解毒功效,有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn),在消化系統(tǒng)疾病中,葛根芩連湯具有顯著的治療效果[8]。但其具體作用機(jī)制還不清楚,因此本研究通過建立Hp感染人正常胃黏膜上皮(GES-1)細(xì)胞模型,并采用葛根芩連湯進(jìn)行干預(yù),以探討葛根芩連湯的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試藥與儀器 細(xì)胞:Hp國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43504,購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司;人GES-1細(xì)胞株,購自武漢普諾賽生命科技有限公司。試藥:RPMI1640培養(yǎng)基(批號(hào):7BH-9421)、胎牛血清(批號(hào):AF-5150)、胰蛋白酶(批號(hào):cxz-10-31)購自美國Gibco公司;Skirrow瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):LA3510)購自北京索萊寶科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8,批號(hào):631254-XV)購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(ANNEXIN V-FITC/PI,批號(hào):CA1020),購自美國Sun-Shine公司;總RNA提取試劑盒(批號(hào):TCF-514123)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):GFXC-367)購自南京建成生物工程研究所有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒(批號(hào):YR-6494)購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;p38(批號(hào):LI-6415)、MK2(批號(hào):OCC-3325)和肌動(dòng)蛋白β-actin(批號(hào):CB-681)蛋白抗體購自美國Abcam公司;二抗(山羊抗兔,批號(hào):61258)購自南京建成生物工程研究所有限公司。葛根(15 g,批號(hào)21083001)、炙甘草(6 g,批號(hào)21101822)、黃芩(9 g,批號(hào)21091631)、黃連(9 g,批號(hào)21100921)均為配方顆粒,購自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,加100 mL無菌水于60 ℃超聲溶解,并稀釋至不同濃度。阿莫西林膠囊(批號(hào)4782111156,國藥準(zhǔn)字H13023964),購自石家莊制藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司,取1000 mg內(nèi)容物加100 mL無菌水于60 ℃超聲溶解,再稀釋至所需濃度。儀器:超凈工作臺(tái)SW-CJ-1D(上海尚凈科技有限公司);HWS-80B恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津市宏諾儀器有限公司);Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];5320R 4℃離心機(jī)(德國徠卡公司);Mini-PRO TEAN電泳儀(美國伯樂公司);Bio-Rad微孔板閱讀器(美國GE Healthcare公司);EVOS M7000倒置顯微鏡[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];BKQ-B75高壓蒸汽滅菌鍋(山東博科科學(xué)儀器有限公司);FC500流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);熒光定量PCR儀(CFX connectTM型,美國伯樂公司);LAS 4000成像系統(tǒng)(美國GE Healthcare公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的人GES-1細(xì)胞從液氮罐中取出,立即放入37 ℃水浴進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇,將復(fù)蘇后的細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)基中,采用細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行分裝,并放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[培養(yǎng)條件:5%二氧化碳(CO2),37 ℃]24 h,觀察細(xì)胞覆蓋率,當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%后更換培養(yǎng)基,并加入胰蛋白酶。

1.2.2 Hp培養(yǎng) 取Skirrow瓊脂培養(yǎng)基平板,密集劃線接種Hp菌株,于37 ℃、微需氧環(huán)境[85%氮?dú)?N2)、10% CO2和5%氧氣(O2)]中培養(yǎng)48～72 h,用滅菌0.9%氯化鈉注射液洗下菌苔并混勻。采用涂片革蘭染色后顯微鏡下檢測細(xì)菌情況,將菌液用滅菌0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行溶解,用酶標(biāo)儀于550 nm處測定其吸光度值,用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)至細(xì)菌濃度為1108 CFU/mL,4 ℃冷藏備用。

1.2.3 細(xì)胞分組 按照葛根芩連湯干預(yù)劑量的不同、是否有Hp感染(感染復(fù)數(shù)MOI為200∶1),將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(正常人GES-1)、模型組(Hp感染+正常人GES-1)、葛根芩連湯低劑量組(Hp感染+正常人GES-1+葛根芩連湯10 μmol/L)、葛根芩連湯中劑量組(Hp感染+正常人GES-1+葛根芩連湯20 μmol/L)、葛根芩連湯高劑量組(Hp感染+正常人GES-1+葛根芩連湯40 μmol/L)及陽性藥對(duì)照組(Hp感染+正常人GES-1+阿莫西林水溶液5 μmol/L)。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)加入胰蛋白酶1 mL,并輕微吹打2 min,使細(xì)胞完全懸浮。將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中離心(2000 rpm,10 min),棄上清,加入1 mL RPMI1640培養(yǎng)基,充分懸浮細(xì)胞,取一塊新的96孔板,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基并加入新的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)基并加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液,持續(xù)培養(yǎng)3 h,各組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。Bio-Rad微孔板閱讀器讀取450 nm處的吸光度,重復(fù)3次,通過吸光度計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5 細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平檢測 實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谑占锨逡河?支新的離心管中,置于-80 ℃保存、備用。采用ELISA檢測上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平,根據(jù)ELISA試劑盒說明書,對(duì)上清液樣本進(jìn)行處理后,采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測樣本吸光度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品中TNF-α、IL-1β和IL-6濃度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 用27 mL去離子水稀釋3 mL 10倍濃度的結(jié)合緩沖液(10× Binding Buffer)至30 mL,每次3 mL。用1 mL 1倍濃度的結(jié)合緩沖液(1× Binding Buffer)重懸細(xì)胞,300×g離心10 min,棄上清;用1 mL 1倍濃度的結(jié)合緩沖液(1× Binding Buffer)重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL;每管加入100 μL細(xì)胞懸液(1×105個(gè));向每管中加入5 μL 用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V-FITC),輕輕混勻后,室溫避光孵育10 min;再加入5 μL 熒光染料碘化丙啶(PI),室溫避光孵育5 min;最后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至500 μL,輕輕混勻,用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR) 取出培養(yǎng)皿放入無菌操作臺(tái),棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。提取細(xì)胞總RNA,然后反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,并在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜訕舆M(jìn)行PCR反應(yīng)。配制體系:引物2.25 μL,cDNA 3.0 μL, SYBR Green qPCR SuperMix 17.25 μL,去酶水7.5 μL,每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。PCR條件:94 ℃,12 min;96 ℃,12 s;62 ℃,25 s;72 ℃,40 s,共35個(gè)循環(huán),采用2-ΔΔct法進(jìn)行計(jì)算。見表1。

表1 引物序列

1.2.8 蛋白免疫印跡(Western bloting)檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 配制蛋白酶K溶液(1 mL PBS加入100 μL蛋白酶K),棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液并加入1 mL蛋白酶K溶液,使用細(xì)胞刮懸浮細(xì)胞,然后破碎細(xì)胞并在3000 rpm,4 ℃條件下離心20 min,用加樣槍將上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離、轉(zhuǎn)模和封閉后用特異性抗體p38、MK2和β-actin(抗體稀釋濃度1∶5000)在4 ℃條件下孵育12 h,孵育后的條帶清洗3次(1%吐溫),二抗(山羊抗兔,稀釋濃度1:1000)孵育2 h,應(yīng)用LAS 4000成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組人GES-1細(xì)胞存活率比較 與空白對(duì)照組比較,模型組人GES-1細(xì)胞存活率降低(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯各劑量組和陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞存活率均升高(P<0.05),且葛根芩連湯各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05);陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞存活率與葛根芩連湯高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與葛根芩連湯低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組人GES-1細(xì)胞存活率比較

2.2 各組人GES-1細(xì)胞炎癥因子比較 與空白對(duì)照組比較,模型組TNF-α、IL-1β和IL-6均升高(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯各劑量組和陽性藥對(duì)照組TNF-α、IL-1β和IL-6均降低(P<0.05),且葛根芩連湯各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05);陽性藥對(duì)照組TNF-α、IL-1β和IL-6與葛根芩連湯高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與葛根芩連湯低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組人GES-1細(xì)胞炎癥因子比較

2.3 各組人GES-1細(xì)胞凋亡率比較 與空白對(duì)照組比較,模型組人GES-1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯各劑量組和陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),且葛根芩連湯各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05);陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞凋亡率與葛根芩連湯高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與葛根芩連湯低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖1。

圖1 各組人GES-1細(xì)胞凋亡率比較圖

表4 各組人GES-1細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組人GES-1細(xì)胞p38、MK2 mRNA表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較,模型組人GES-1細(xì)胞p38、MK2 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯各劑量組和陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞p38、MK2 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05),且葛根芩連湯各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05);陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞p38、MK2 mRNA表達(dá)與葛根芩連湯高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與葛根芩連湯低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組人GES-1細(xì)胞p38、MK2 mRNA表達(dá)水平比較

2.5 各組人GES-1細(xì)胞p38、MK2蛋白表達(dá)水平比較 模型組人GES-1細(xì)胞p38、MK2蛋白表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P<0.05);與模型組比較,葛根芩連湯各劑量組和陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞p38、MK2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),且葛根芩連湯各劑量組效應(yīng)呈劑量依賴性(P<0.05);陽性藥對(duì)照組人GES-1細(xì)胞p38、MK2蛋白表達(dá)與葛根芩連湯高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與葛根芩連湯低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6、圖2。

A:空白對(duì)照組;B:模型組;C:葛根芩連湯低劑量組;D:葛根芩連湯中劑量組;E:葛根芩連湯高劑量組;F:陽性藥對(duì)照組

表6 各組人GES-1細(xì)胞p38、MK2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

胃癌目前已被列為最常見的癌癥之一,且死亡率較高[9]。Hp是一種革蘭氏陰性菌,在胃癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10]。Hp感染將導(dǎo)致脲酶、空泡毒素A、CagA蛋白、炎癥介質(zhì)和活性氧代謝產(chǎn)物等致病因子釋放,胃黏膜上皮細(xì)胞異常增生和凋亡,最終演變成胃癌[11]。因此,降低Hp感染率和提高Hp感染后的治愈率,闡明Hp感染后人GES-1細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制,對(duì)于胃癌防控尤為重要。本研究建立Hp感染人GES-1細(xì)胞細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)Hp感染可引起人GES-1細(xì)胞存活率降低,凋亡水平升高。

炎性反應(yīng)是大多數(shù)疾病的主要誘因。TNF-α是體內(nèi)一種重要的促炎細(xì)胞因子,在多種生理反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[12]。IL-6是活化T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵因子,能夠催化和放大炎性反應(yīng),其表達(dá)水平可有效反映組織細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度,作為急慢性炎癥臨床診斷的有效指標(biāo)[13]。IL-1β能誘導(dǎo)產(chǎn)生和釋放多種炎癥因子[14]。本研究檢測了各組細(xì)胞上清液的相關(guān)炎癥因子,結(jié)果顯示Hp感染人GES-1細(xì)胞后,細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平均顯著增加,說明Hp感染可能會(huì)導(dǎo)致炎性反應(yīng)加劇,從而引發(fā)胃部疾病。

炎性反應(yīng)主要依賴于細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路刺激。絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信號(hào)通路是其中一條重要的調(diào)控通路,目前已被證實(shí)其在Hp感染所致的胃黏膜炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15]。p38及其下游蛋白MK2是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的成員,也是引發(fā)細(xì)胞對(duì)細(xì)菌脂多糖、氧化應(yīng)激和炎癥等反應(yīng)的重要介質(zhì)[16]。p38/MK2信號(hào)通路在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程中起到重要作用,直接或間接參與炎性反應(yīng)[17]。p38/MK2信號(hào)通路通過酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活,環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)活性增加,刺激機(jī)體TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)增加,導(dǎo)致炎性反應(yīng)加劇[18]。p38/MK2通路的激活還可以引起環(huán)氧酶-2(COX-2)的高表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而造成胃黏膜損傷[19]。研究發(fā)現(xiàn),未經(jīng)Hp感染的人GES-1細(xì)胞難以檢測出p38/MK2表達(dá),而Hp感染后p38/MAPK的表達(dá)顯著增高,表明Hp感染導(dǎo)致的炎性反應(yīng)與p38/MK2信號(hào)通路激活密切相關(guān)[20]。本研究對(duì)人GES-1細(xì)胞進(jìn)行Hp感染后,細(xì)胞中p38、MK2的表達(dá)水平均顯著增加,提示Hp感染可引起p38/MK2信號(hào)通路的激活,進(jìn)一步刺激TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌,加重炎性反應(yīng)。

近年來,中藥輔助治療Hp感染已成為研究的熱點(diǎn)。葛根芩連湯由多種中草藥配伍,具有清熱止利、堅(jiān)陰厚腸功效,可有效緩解腸炎患者疾病癥狀,同時(shí)通過降低血清TNF-α和IL-6表達(dá)水平,以降低炎性反應(yīng)。本研究對(duì)Hp感染的人GES-1細(xì)胞采用不同劑量的葛根芩連湯進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示葛根芩連湯可有效提高人GES-1細(xì)胞的生存率,同時(shí)降低細(xì)胞凋亡水平,通過分析上清液TNF-α、IL-1β和IL-6和細(xì)胞內(nèi)p38、MK2表達(dá)水平,提示葛根芩連湯可能是通過抑制p38/MK2信號(hào)通路,從而降低TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子表達(dá)水平,發(fā)揮抑制Hp的作用。