吳翔　余洋　謝麗源

摘要［目的］篩選獲得分類地位明確、具有較好除臭效果的微生物菌株。［方法］通過平板涂布法從雞糞發(fā)酵料中篩選具有除臭效果的菌株，并檢測各菌株對雞糞中氨氣和硫化氫的降解率。通過表型特征、生理生化特征和遺傳特征等多相分析來確定目的菌株的分類地位。［結(jié)果］篩選獲得一株除臭細(xì)菌3-1，對氨氣和硫化氫的降解率分別達(dá)到了63.08%和62.80%。鑒定結(jié)果表明，細(xì)菌3-1為原磷谷氨酸桿菌（Glutamicibacter protophormiae），在GenBank核酸登錄號為OM816730。［結(jié)論］菌株3-1在無害化處理畜禽糞污方面具有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 除臭細(xì)菌；篩選；鑒定

中圖分類號 X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）06-0058-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.016

Screening and Identification of a Deodorant Bacterial Strain

WU Xiang1，2，YU Yang1，2，XIE Li－yuan1，2

（1. Sichuan Institute of Edible Fungi，Chengdu，Sichuan 610066;2. National Observing and Experimental Station of Agricultural Microbiology in Xindu，Chengdu，Sichuan 610066）

Abstract ［Objective］ To screen microbial strains with clear classification status and good deodorization effect.［Method］Strains with deodorization effect were screened from chicken manure fermentation materials by plate coating method， and the degradation rates of ammonia and hydrogen sulfide in chicken manure were tested.The taxonomic status of the target strain was determined by multiphase analysis of phenotypic characteristics， physiological and biochemical characteristics and genetic characteristics.［Result］ The strain 3-1 possessing deodorizing functions was isolated，the amount of NH3 and H2S removed were 63.08% and 62.80% .The identification results showed that bacteria 3-1 was Glutamicobacter prototropiae， and the nucleic acid registration number in GenBank was OM816730.［Conclusion］ The isolated strain 3-1 have great potential for the harmless treatment of livestock manure.

Key words Deodorant bacterial;Screening;Identification

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活水平的提高，對肉、蛋、奶等產(chǎn)品的需求越來越大，促進(jìn)了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。而畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展必然增加畜禽糞污產(chǎn)生的量，給環(huán)境帶來新的壓力。其中畜禽糞便中含有的大量蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)被分解為NH3、H2S等惡臭氣體［1］，這些氣體會引起周圍強烈的刺激性，損害吸入群體的人身健康。目前對這些惡臭氣體主要的處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法［2-6］，而生物法主要通過微生物降解、轉(zhuǎn)化惡臭成分，具有成本低、不易產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，因此是解決惡臭氣體重要的研究方向。該研究從雞糞發(fā)酵物中篩選降解NH3和H2S的微生物菌株，為后續(xù)研發(fā)除臭劑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

含氮富集液體培養(yǎng)基［7］：蔗糖25 g，NH4NO3 2 g，KH2PO4 2 g，NaCl 2 g，F(xiàn)eSO4 0.1 g，CaCl2 0.5 g，ZnSO4 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水950 mL，滅菌后的雞糞浸出液50 mL，pH 7.5～8.0。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。

產(chǎn)氣檢測培養(yǎng)基［8］：蔗糖2 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5～7.0。

1.2 樣品采集及處理

在成都市大邑縣、邛崍市采集雞糞發(fā)酵物共計5個，稱取樣品各5 g分別置于富氮液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，放入30 ℃、120 r/min搖床振蕩，3 d后在轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。

1.3 菌株篩選

將富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，選取適宜稀釋度的稀釋液0.1 mL，采用平板涂布法涂布于LB培養(yǎng)基上，于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待菌長出后將純化后的單個菌株接種到產(chǎn)氣培養(yǎng)基，利用石蕊試紙和醋酸鉛試紙檢測各菌株的產(chǎn)氣情況，菌株生長過程中產(chǎn)生NH3紅色石蕊試紙將變?yōu)樗{(lán)色，產(chǎn)生H2S氣體醋酸鉛試紙將變?yōu)楹谏?］。參照李玥等［8］的方法，再次檢測2種氣體產(chǎn)氣試驗都不變色菌株的除氨和除H2S能力，確定篩選目標(biāo)菌株。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 顯微形態(tài)和培養(yǎng)形態(tài)特征分析。

將篩選所得的目標(biāo)菌株于LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌株形態(tài)特征，并對菌落形態(tài)拍照；挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)。

1.4.2 生理生化特征分析。

菌株大部分生理生化特征利用Biolog Gen Ⅲ型細(xì)菌鑒定儀的微孔板檢測，具體按照Biolog Gen Ⅲ MicroPlateTM使用說明書步驟操作，其微孔板布局如圖1所示。其他生理生化試驗檢測內(nèi)容參照趙斌等［10］的《微生物學(xué)實驗》進(jìn)行操作。將LB培養(yǎng)基NaCl含量調(diào)節(jié)為1%、4%、8%和10%（w/v），pH分別調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10、11，檢測菌株生長pH范圍和NaCl耐受情況，檢測菌株在7、15、25、30、40、45和50 ℃條件下的生長情況。

1.4.3 菌株16S rRNA基因序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）的說明書提取細(xì)菌基因組DNA。用細(xì)菌通用引物（正向引物27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）參照張飛官等［11］的方法擴(kuò)增菌株16S rDNA。PCR產(chǎn)物在生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。將測得的16S rRNA基因序列提交到GenBank，獲得各菌株的登錄號。參照張越己等［12］的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

從5個雞糞發(fā)酵物樣品中分離獲得52株菌株，其中細(xì)菌38株，放線菌14株。在利用試紙檢測各菌株產(chǎn)生NH3和H2S氣體的過程中發(fā)現(xiàn)，有5株細(xì)菌同時不產(chǎn)生NH3和H2S，它們分別是3-1、3-2、4-3、5-2、5-4，分別檢測了這5株菌的除氨和除H2S能力，結(jié)果如表1所示，從表1可看出，菌株3-1的除氨率和除硫化氫率均為5個菌株中最高的，分別達(dá)到了63.08%和62.98%，因此選該菌為最優(yōu)的目的菌株確定其分類地位。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征。

菌株3-1是革蘭氏陽性的好氧細(xì)菌，在LB培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)出隆起、邊緣整齊的形狀，菌株表面濕潤，無可溶性色素，菌株為乳白色，培養(yǎng)過程中菌株顏色無變化，無金屬光澤，在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)該菌呈現(xiàn)桿狀，如圖2所示。

2.2.2 生理生化特征。

菌株3-1培養(yǎng)22 h后在Biolog鑒定板上的鑒定結(jié)果如圖3所示。將該菌Gen Ⅲ鑒定板上的鑒定結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中比對，未發(fā)現(xiàn)有與該菌結(jié)果具有匹配可能性的菌株，距離最近的菌為Bacillus megaterium，但與該菌的相似度（SIM）為0.212，距離（DIST）為10.253，無匹配可能性。鑒定結(jié)果表明該菌具有一定的耐酸性和耐鹽性，可在pH 低至5和含8%NaCl的培養(yǎng)液中生長，生長溫度是15～30 ℃?？衫煤?、D-麥芽糖、D-纖維二塘、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、棉子糖、蜜二塘、D-水楊酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、甘油、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、果膠等生長。

2.2.3 菌株16S rRNA基因部分序列分析。

菌株3-1的16S rRNA基因部分序列長度為1 424 bp，在GenBank核酸登錄號為OM816730。根據(jù)菌株3-1系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株3-1屬于貝氏谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）細(xì)菌，與該屬菌株原磷谷氨酸桿菌Glutamicibacter protophormiae DSM 20168系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，其16S rRNA基因相似性為99.93%；其次是菌株Glutamicibacter soli SYB2，相似性為99.07%；通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株3-1相關(guān)菌株16S rRNA基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA基因部分序列分析結(jié)果［13］，初步判定菌株3-1屬于原磷谷氨酸桿菌（Glutamicibacter protophormiae）。

3 討論

在已有的降解畜禽糞污臭氣方面的研究中，發(fā)現(xiàn)具有這類功能的微生物主要包括芽孢桿菌［14］、鐮刀菌［15］、酵母菌［16-17］等，該研究所得的降解氨氣和硫化氫的菌株為原磷谷氨酸桿菌（Glutamicibacter protophormiae），已有的報道中該類菌主要具有產(chǎn)生L-谷氨酸、谷氨酸等功能［17］，鮮有該類菌用于降價畜禽糞污臭氣成分的報道。該研究篩選出的菌株3-1對氨氣和硫化氫都有較好的去除效果，具有研發(fā)為功能菌株生產(chǎn)除臭劑的潛力，為除臭菌劑的研發(fā)等后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。

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基金項目 成都市重點研發(fā)支撐計劃項目（2022YF0500956SN）；四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國際科技交流合作提升行動計劃項目（2021ZSSFGH05）。

作者簡介 吳翔（1981—），女，四川理縣人，副研究員，博士，從事土壤微生物研究。

收稿日期 2022-05-06