肖倩倩, 金元超, 丁 虎△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430030 2西安市第四醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710005

高三酰甘油血癥是動脈粥樣硬化性心血管疾病的重要發(fā)病因素[1-2]。全基因組關聯(lián)分析也提供了強有力的證據(jù)[3],表明三酰甘油是動脈粥樣硬化性心血管疾病的可遺傳、可改變的危險因素[4]。然而,許多疾病現(xiàn)象無法通過經(jīng)典遺傳學理論進行解釋,存在“遺傳度缺失”現(xiàn)象,表觀遺傳學是其重要補充和近年來的研究熱點。

DNA甲基化是參與心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要表觀遺傳修飾形式[5],它通過募集參與基因阻遏的蛋白質或抑制轉錄因子與DNA的結合來調(diào)節(jié)脂代謝相關基因表達[6]。越來越多的研究表明,DNA甲基化在調(diào)節(jié)血脂穩(wěn)態(tài)和脂質代謝相關的疾病中發(fā)揮重要作用[7]。

有研究表明,脂肪酸去飽和酶1(Fads1)rs174546位點的基因多態(tài)性與高三酰甘油血癥有高相關性,且Fads1的失活會導致動脈粥樣硬化性疾病風險增加[8]。然而,Fads1基因的表觀調(diào)控機制目前仍不清楚。

因此,我們結合以上研究背景,推測高三酰甘油血癥導致Fads1基因啟動子區(qū)的甲基化修飾異常,繼而影響Fads1的表達和高三酰甘油血癥的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Trizol(日本TaKaRa公司),RNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green(中國南京諾唯贊生物科技股份有限公司),20%醫(yī)用脂肪乳(上海百特僑光醫(yī)療用品有限公司),基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司),三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)測定試劑盒(南京建成科技有限公司),Fads1 ELISA試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司),BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),油紅O染液及蘇木精染液(武漢谷歌生物科技有限公司),雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)(美國Promega公司),重亞硫酸鹽轉化試劑盒(美國Active Motif公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及誘導細胞脂肪變性

大鼠肝細胞系BRL-3A由中山大學醫(yī)學院提供。置于37℃、含5% CO2、濕度適宜的細胞培養(yǎng)箱中,使用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時,進行細胞傳代。將細胞消化后,同等密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后,在高脂刺激組加入2 mL含6%脂肪乳的培養(yǎng)液,對照組加入不含脂肪乳的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后通過三酰甘油及膽固醇測定試劑盒檢測細胞內(nèi)TG、TC含量。

1.3 實驗動物及分組

選取36只8周齡、體重約200 g的SPF級雄性SD大鼠(由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供),按照隨機數(shù)字表法隨機分為兩組:對照組、高脂飲食組,每組18只。常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周后,對照組給予基礎飼料喂養(yǎng),高脂飲食組給予高脂飼料(基礎飼料中加入1%膽固醇、10%豬油)喂養(yǎng)。大鼠均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中,室溫(23±2)℃,自由攝食飲水,分籠飼養(yǎng)。

1.4 大鼠血漿標本采集

分別于喂養(yǎng)的第1、3、4、5周后,采集大鼠血漿標本。采集前禁食16 h,用肝素溶液處理毛細玻璃管以避免凝血,再經(jīng)大鼠內(nèi)眥靜脈取血2 mL,置于室溫離心機中3000×g離心8 min,吸取上層澄清液體,即為血漿樣本。收集的樣本送華中科技大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科,測定血漿脂質含量。

1.5 大鼠肝臟標本制備

于喂養(yǎng)的第5周,檢測血脂并確定出現(xiàn)高脂血癥后,單側眼球摘除取血并處死大鼠,剖開腹腔并完整摘取肝臟組織,稱重并拍照。切取肝臟中間部分置于4%多聚甲醛中浸泡過夜,而后制作成石蠟切片,進行蘇木精-伊紅(HE)染色。另切取部分組織放入-80℃冰箱保存,冰凍切片后進行油紅O及蘇木精染色,觀察脂滴沉積情況。

1.6 肝臟組織RNA提取和逆轉錄

取30 mg大鼠肝臟組織,使用剪刀盡可能剪成碎塊,加入1 mL Trizol,置于超聲波發(fā)生儀進行超聲粉碎,并嚴格按照試劑盒操作說明提取肝臟RNA。再利用RNA逆轉錄試劑盒,對RNA進行逆轉錄PCR,得到cDNA。

1.7 實時熒光定量PCR

通過查閱三酰甘油代謝的相關文獻,確定10個相關基因,包括Cpt1a、Lpl、Fads1、Apoa5、Apoc3、Apoc2、Gpihbp1、Angptl3、Lmf1、Ces1d。利用Primer Blast網(wǎng)站,針對上述基因CDS區(qū)設計特異性引物。使用Applied biosystems實時熒光定量PCR儀對目的片段進行擴增。反應條件:預變性,95℃,30 s;變性,95℃,5 s;PCR反應:60℃,30 s,40個循環(huán)。選用大鼠源性GAPDH作為內(nèi)參。用儀器自帶分析軟件分析熔解曲線及相對定量數(shù)據(jù)。

1.8 BSP克隆測序法(bisulfite sequencing PCR)

取30 mg大鼠肝臟組織,用剪刀剪成碎塊,利用基因組DNA提取試劑盒提取大鼠肝臟組織總基因組DNA。測定提取得到的DNA濃度,利用試劑盒對DNA進行重亞硫酸鹽轉化,并對轉化后的DNA進行純化處理,于-20℃冰箱保存。從TRED數(shù)據(jù)庫中獲取Fads1基因啟動子序列,再導入引物設計軟件Meth Primer,預測得到Fads1基因啟動子區(qū)2000 bp內(nèi)CpG島的信息,并針對CpG島兩端設計PCR引物。接下來對重亞硫酸鹽轉化后的DNA樣本進行甲基化PCR擴增,產(chǎn)物回收,酶切、酶連反應,感受態(tài)轉化克隆,挑選陽性克隆進行測序分析,將測序數(shù)據(jù)與Fads1原始序列比對,分析甲基化程度。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,連續(xù)變量用均數(shù)±標準差表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較用LSD-t檢驗,采用Pearson相關性檢測分析Fads1基因甲基化水平與大鼠血漿三酰甘油含量的相互關系,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 構建大鼠高三酰甘油血癥模型

高脂飲食喂養(yǎng)后第3周開始,高脂飲食組大鼠血漿三酰甘油(TG)含量較對照組明顯升高(約為2.1倍,P<0.05),且隨著飼養(yǎng)時間延長,升高程度越明顯,到第5周升高至約3倍(P<0.01);同時,高脂飲食組大鼠血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量有一定的升高趨勢,而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量無明顯變化。提示高脂飲食喂養(yǎng)可有效誘導大鼠出現(xiàn)高三酰甘油血癥(圖1A～1D)。

在喂養(yǎng)的第5周,我們對大鼠肝臟脂質沉積程度進行觀察。光學顯微鏡下,HE染色可見對照組大鼠肝臟肝小葉結構清晰,肝細胞排列緊密,細胞內(nèi)未見脂滴空泡;而高脂飲食組大鼠肝細胞胞漿出現(xiàn)了明顯的脂滴空泡,大小不一,邊界清晰,將細胞核擠向一側,肝細胞間界限不清。油紅O及蘇木精染色可見,相較于對照組,高脂飲食組大鼠肝臟有明顯的脂滴紅染(圖1E)。上述結果提示在高脂喂養(yǎng)的大鼠肝臟中,已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的脂質沉積,肝細胞出現(xiàn)明顯的脂肪變性。

對照組及高脂飲食組大鼠血漿三酰甘油(A)、總膽固醇(B)、低密度脂蛋白膽固醇(C)、高密度脂蛋白膽固醇(D)含量,n=6,與對照組比較,*P<0.05;E:各組大鼠肝臟HE染色(×400)及油紅O和蘇木精染色(×100)圖1 大鼠血脂水平及肝臟組織病理檢測Fig.1 Serum lipid level and liver histopathology in each group of rats

2.2 Fads1在高三酰甘油血癥大鼠中表達下調(diào)

通過查閱文獻,篩選出10個與三酰甘油代謝密切相關的基因。實時熒光定量PCR結果顯示,相較于對照組,有4個基因在肝臟中的表達水平有明顯變化,其中Fads1在高脂飲食組中顯著低表達(P<0.01,圖2A)。利用ELISA方法分析大鼠血漿Fads1含量,發(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)5周后,大鼠血漿Fads1含量降低,較對照組下降了約10%(P<0.05,圖2B)。以上結果表明,高三酰甘油血癥可以明顯抑制大鼠體內(nèi)Fads1的表達,尤其在轉錄水平。

A:兩組大鼠肝臟中三酰甘油代謝相關基因的mRNA表達情況(每行表示每個基因在不同樣本中的表達情況,每列表示每個樣品中所有基因的表達情況;紅色表示基因表達上調(diào),藍色表示基因表達下調(diào),顏色越深代表基因表達變化程度越大);B:兩組大鼠血漿Fads1水平,n=4,與對照組比較,*P<0.05圖2 Fads1在大鼠肝臟和血漿中的表達情況Fig.2 Expression of Fads1 in liver and plasma of rats in each group

2.3 Fads1啟動子區(qū)甲基化位點的預測與鑒定

為明確高三酰甘油血癥抑制Fads1表達的具體機制,我們對Fads1啟動子區(qū)的甲基化修飾進行研究。首先利用Meth Primer網(wǎng)站(http://www.urogene.org/methprimer2/)進行在線預測,結果顯示啟動子區(qū)-423 bp至-173 bp的區(qū)域為CpG島,其中共包含16個CpG二核苷酸。將其劃分為6個甲基化檢測位點,再針對CpG島兩端設計特異性引物(圖3A)。從高脂飲食組及對照組中分別選取4只大鼠的肝臟樣本,提取出完整的基因組DNA,利用特異性引物對CpG島進行PCR擴增,DNA凝膠電泳提示成功擴增出長度為283 bp的目的片段(圖3B)。對該片段進行一代測序,序列與數(shù)據(jù)庫中的吻合,證實了Fads1啟動子區(qū)中CpG島的真實性。

A:Meth Primer預測的Fads1啟動子區(qū)中的CpG島區(qū)域(紅色區(qū)域),具體序列中,紅色二連序列為CpG二核苷酸,共16個,將其分為6個檢測位點,位點1為CpG 1,位點2為CpG 2～4,位點3為CpG 5～6,位點4為CpG 7,位點5為CpG 8～14,位點6為CpG 15～16;B:CpG島PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖,在300 bp附近可見目的片段(283 bp),1～4為對照組,5～8為高脂飲食組圖3 Fads1啟動子區(qū)甲基化位點的預測與鑒定Fig.3 Prediction and identification of methylation sites in the promoter region of Fads1

2.4 Fads1啟動子區(qū)甲基化水平與血漿三酰甘油的相關性分析

為探討Fads1啟動子區(qū)甲基化水平的變化,我們對兩組大鼠肝臟基因組DNA進行了BSP克隆測序。測序結果表明,高脂飲食組中甲基化胞嘧啶未發(fā)生改變,而對照組中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶則轉變?yōu)樾叵汆奏?圖4A)。對6個甲基化位點的甲基化率分別進行分析,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,位點1～5的甲基化率在高脂飲食組大鼠肝臟組織均明顯升高,位點6的甲基化水平則顯著下降,但是總體甲基化率約為對照組的3.5倍(圖4B)。進一步將Fads1基因甲基化水平與大鼠血漿三酰甘油水平進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)甲基化水平與三酰甘油水平呈正相關(R2=0.8175,P=0.002,圖4C)。以上結果說明,大鼠體內(nèi)Fads1基因甲基化率與血漿三酰甘油水平密切相關。

A:對照組和高脂飲食組大鼠Fads1基因測序圖譜,箭頭所指為具體發(fā)生甲基化的胞嘧啶;B:兩組大鼠肝臟Fads1基因啟動子區(qū)甲基化率,與對照組比較,n=4,*P<0.05;C:Fads1基因甲基化水平與大鼠血漿三酰甘油水平的相關性分析圖4 Fads1啟動子區(qū)甲基化水平與大鼠血漿三酰甘油水平的關系Fig.4 Relationship between methylation in Fads1 promoter region and plasma triglyceride levels in rats

2.5 高脂刺激下調(diào)大鼠肝細胞Fads1表達水平

體外培養(yǎng)大鼠肝細胞系BRL-3A,并用6%脂肪乳對細胞進行干預。在此條件下,胞內(nèi)TG含量明顯增多,約為對照組的2.1倍(P=0.0047),出現(xiàn)明顯脂質沉積,胞內(nèi)TC含量也有所上升,說明6%脂肪乳可成功誘導出細胞高脂模型(圖5A、5B)。

隨后,對細胞內(nèi)Fads1的mRNA表達水平進行檢測。實時熒光定量PCR顯示,脂肪乳刺激組細胞Fads1表達水平較對照組顯著下調(diào),約為對照組的20%,這與體內(nèi)實驗結果類似。為探究在此過程中甲基化是否直接參與了Fads1的表達調(diào)控,選用不同濃度的5-氮雜胞苷(5-Aza,DNA甲基轉移酶抑制劑)處理脂肪乳刺激的細胞,并檢測Fads1 mRNA表達水平。結果顯示,與單純脂肪乳刺激組比,當5-Aza濃度大于5 μmol/L時,細胞內(nèi)Fads1表達水平有所回升,約為對照組的40%(圖5C)。說明高脂刺激可通過促進Fads1基因啟動子區(qū)甲基化進而抑制其表達。

2.6 CpG甲基轉移酶下調(diào)Fads1啟動子區(qū)轉錄活性

為探究DNA甲基化對Fads1啟動子區(qū)轉錄活性的影響,我們將Fads1基因啟動子區(qū)片段與pGL3-Basic載體連接,構建熒光素酶報告基因質粒(圖6A),同海腎熒光素酶質粒共轉染進BRL-3A細胞,并利用M.SssI(CpG甲基轉移酶)進行干預(甲基化處理),誘導細胞內(nèi)甲基化水平升高。結果顯示,與對照組相比,甲基化處理組的熒光素酶活性降低了約30%(P<0.05)(圖6B)。

上述結果進一步說明,Fads1基因啟動子區(qū)甲基化修飾水平增高導致其轉錄活性下降,Fads1表達量下調(diào)。

A:細胞內(nèi)三酰甘油水平;B:細胞內(nèi)總膽固醇水平;C:細胞內(nèi)Fads1 mRNA相對表達量;與對照組比較,*P<0.05;與6%脂肪乳刺激組比較,#P<0.05圖5 體外培養(yǎng)大鼠肝細胞系BRL-3A脂質沉積情況及Fads1表達量Fig.5 Lipid deposition and Fads1 expression in rat liver cell line BRL-3A cultured in vitro

A:熒光素酶報告基因質粒示意圖;B:細胞內(nèi)熒光素酶活性,pGL3-Fads1-U代表對照組,pGL3-Fads1-M代表M.SssI處理組,與對照組比較,*P<0.05圖6 熒光素酶報告基因實驗檢測Fads1啟動子區(qū)轉錄活性Fig.6 Detection of transcriptional activity of Fads1 promoter region by luciferase reporter gene assay

3 討論

高三酰甘油血癥作為最常見的血脂異常之一,與動脈粥樣硬化性疾病、胰腺炎、非酒精性脂肪肝等多種疾病相關[9]。本研究在高三酰甘油血癥的大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)Fads1基因啟動子區(qū)域DNA甲基化修飾增加,且與其血漿三酰甘油水平呈正相關,繼而抑制Fads1基因轉錄,導致Fads1表達水平下降,影響血脂代謝。本研究為高三酰甘油血癥所致的基因表達變化提供了新思路。

三酰甘油在體內(nèi)合成、代謝過程極其復雜,涉及多種基因及多種調(diào)控模式[10]。其中,脂肪酸去飽和酶1(Fads1)是多不飽和脂肪酸合成的關鍵限速酶[11]。多不飽和脂肪酸omega-3主要通過Fads1進行代謝,生成二十二碳六烯酸(DHA)[12]。DHA在后續(xù)代謝過程中產(chǎn)生抗炎因子,抑制血小板凝聚。當Fads1失活時,會導致DHA生成減少,抗炎因子減少[13]。

目前,多個全基因組關聯(lián)分析研究表明,Fads1基因多態(tài)性在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。研究表明Fads1 rs174537變異對拉美裔人群循環(huán)三酰甘油含量有較大的影響,會導致多不飽和脂肪酸的失衡及三酰甘油升高,并可能產(chǎn)生較高的心血管疾病風險[14]。在中國漢族人群,冠狀動脈疾病和急性冠脈綜合征患者中rs174556 T等位基因的頻率較對照組顯著升高[15]。本研究發(fā)現(xiàn),Fads1表達量在高脂飲食組大鼠中明顯降低,提示高脂飲食在升高大鼠血脂水平的同時,也影響著體內(nèi)Fads1的表達,兩者共同參與并影響了高三酰甘油血癥的進程。

DNA甲基化修飾是真核生物最常見的表觀遺傳調(diào)控模式之一[16],近幾年心血管領域內(nèi)關于DNA甲基化修飾的研究也越來越多[17]。通過對Fads1基因啟動子區(qū)序列進行分析,發(fā)現(xiàn)包含較多的CpG島,即易發(fā)生DNA甲基化修飾的位點。對Fads1進行甲基化數(shù)量性狀基因座(MQTL)分析,發(fā)現(xiàn)Fads1中3個CpG位點甲基化水平與Fads1的表達呈負相關[18]。在白細胞Fads1區(qū)域的關鍵調(diào)控區(qū)域,觀察到rs174537和DNA甲基化之間的顯著關聯(lián)性,且還與循環(huán)中的omega-6和長鏈不飽和脂肪酸相關[19]。這說明DNA甲基化參與了Fads1的表達調(diào)控,繼而影響下游的三酰甘油及長鏈不飽和脂肪酸代謝。

綜上,本研究揭示了高脂狀態(tài)下Fads1表達及其啟動子區(qū)甲基化水平的基本變化規(guī)律。遺憾的是在本研究中未能檢測大鼠血漿多不飽和脂肪酸的水平,高血脂狀態(tài)對基因甲基化水平影響的更深層次作用機制仍有待進一步研究。