喬業(yè)華 郭棟 王璐 曲婷婷 張翔雁 邢曉明

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科; 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科)

目前,結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上人群中發(fā)病率、致死率位列前3位的惡性腫瘤[1］。隨著醫(yī)療技術(shù)的提高,臨床上多采用化療聯(lián)合放療和免疫療法,以提高治療效果,但是仍有部分患者治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,因此尋找更有效的CRC治療的靶點尤為重要。分泌載體膜蛋白(SCAMPs)是具有4個跨膜結(jié)構(gòu)的載體蛋白,參與高爾基體與后高爾基體循環(huán)的轉(zhuǎn)運,SCAMPs保守蛋白包括SCAMP1～SCAMP5 5個亞型[2-3］。目前關(guān)于SCAMP2的研究主要限于其在囊泡轉(zhuǎn)運、胞吞胞吐中的作用。而且研究發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織相比較,SCAMP2在胰腺癌腫瘤組織以及血液系統(tǒng)腫瘤之中高表達(dá)[4-5］,但尚未有研究揭示SCAMP2在CRC組織中的表達(dá)情況。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測SCAMP2在CRC中的表達(dá)水平,并且通過臨床病理分析探討SCAMP2在CRC發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月—2016年8月青島大學(xué)附屬醫(yī)院309例原發(fā)性CRC患者術(shù)中的CRC組織和癌旁正常組織標(biāo)本,納入標(biāo)準(zhǔn)為術(shù)前未行放、化療者。同時收集患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤分化程度、大小、TNM分期、浸潤程度、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、KRAS和NRAS突變情況等一般臨床資料。電話隨訪患者生存時間、生存狀態(tài)等信息,隨訪截至2022年12月3日。

1.2 方法

1.2.1組織芯片的制備及免疫組織化學(xué)染色 將309例石蠟包埋的CRC組織和癌旁正常組織標(biāo)本,使用組織儀分別制備成2.0 mm孔徑、4 μm厚的組織芯片。將CRC以及癌旁正常組織的芯片依次放入盛有二甲苯、梯度乙醇的玻璃缸中脫蠟、水化,之后放入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中,加熱至100 ℃后持續(xù)2 min,冷卻至室溫,置于30 g/L過氧化氫溶液中浸泡20 min后,滴加山羊血清于取出的組織芯片上,室溫下反應(yīng)30 min。然后滴加SCAMP2一抗稀釋液(1∶800,北京中杉金橋生物科技有限公司,TA506991,OTI3C2)于組織芯片上,同時將僅滴加抗體稀釋液的組織芯片(北京中杉金橋生物科技有限公司,ZLI-9029)作為陰性對照,4 ℃過夜。滴加通用型二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)至組織芯片中并室溫反應(yīng)2 h,滴加DAB顯色液,蘇木素溶液復(fù)染,氨水分化后脫水,滴加中性樹膠封片,置于光學(xué)顯微鏡下對染色結(jié)果進(jìn)行評分。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀 由2名病理醫(yī)師隨機(jī)選擇至少5個高倍視野評價SCAMP2染色情況,選取的高倍視野染色情況存在差異時則以占比多的染色結(jié)果為準(zhǔn),2位醫(yī)師結(jié)果不同時由第三名病理醫(yī)師重新進(jìn)行評分。SCAMP2陽性評定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核或細(xì)胞漿染色為棕黃色。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn):0分為無著色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。以染色強(qiáng)度≥2分為SCAMP2高表達(dá),以染色強(qiáng)度<2分為SCAMP2低表達(dá)[6］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。SCAMP2在CRC組織與癌旁正常組織中的表達(dá)評分比較采用t檢驗,與臨床病理特征的關(guān)系分析采用Pearsonχ2檢驗;生存分析采用Log rank檢驗以及Kaplan-Meier法,采用Graphpad Prism 7軟件繪制生存曲線。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種組織中SCAMP2表達(dá)水平比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,SCAMP2在癌旁正常組織中呈高表達(dá),在CRC組織中呈低表達(dá)(圖1)。309例CRC組織中SCAMP2高表達(dá)者120例,低表達(dá)者189例;309例癌旁正常組織樣本中SCAMP2呈高表達(dá)者232例,低表達(dá)者77例,CRC組織及癌旁正常組織中SCAMP2的表達(dá)水平差異具有顯著性(t=5.042,P<0.05)。

2.2 SCAMP2與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

SCAMP2表達(dá)水平與患者腫瘤大小、MSI有關(guān)(χ2=6.953、4.923,P<0.05),而與年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤程度、KRAS及NRAS突變情況無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

A:癌旁正常組織,B:CRC組織,200倍

表1 SCAMP2表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系[例］

2.3 SCAMP2表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

依據(jù)SCAMP2在CRC組織中的表達(dá)水平情況,將所有患者分為SCAMP2高表達(dá)組120例和SCAMP2低表達(dá)組189例,Kaplan-Meier生存分析顯示,SCAMP2高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的總體生存期分別為(91.481±3.634)、(81.312±2.145)月;SCAMP2高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的無病生存期分別為(34.792±0.708)、(35.860±0.487)月,兩組患者的上述兩個指標(biāo)比較,差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

CRC是臨床上常見的惡性腫瘤,多由腺瘤發(fā)展而來[7-9］。盡管診斷、治療CRC的技術(shù)不斷提高,但部分患者的治療效果仍不理想,常規(guī)治療難以改善患者預(yù)后[10-13］。因此探索CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找相關(guān)的分子標(biāo)記物在臨床上具有重要意義。SCAMPs家族共享四個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD1～4),N端由TMD1連接,高度保守的親水性E肽序列的兩端為TMD2與TMD3[14］。SCAMPs蛋白主要參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運、內(nèi)吞作用以及囊泡循環(huán)[15-17］。最近有研究顯示,SCAMP家族的表達(dá)水平及其變化會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。YANG等[18］研究表明SCAMP1可以促進(jìn)膽囊癌與胰腺癌細(xì)胞遷移與侵襲。VENUGOPALAN等[19］研究顯示,SCAMP3或可作為肺腺癌進(jìn)展的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。GE等[20］研究表明,原發(fā)性膠質(zhì)瘤SCAMP4的低表達(dá)與患者的良好預(yù)后顯著相關(guān),提示SCAMP4是腫瘤潛在的癌基因。MAO等[4］研究表明,SCAMP1、SCAMP5在胰腺癌中高表達(dá),且具有作為診斷、預(yù)后因子的潛在臨床價值。上述研究提示,SCAMP家族蛋白在調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等惡性表型方面發(fā)揮重要作用,但SCAMP2作為SCAMP家族中的關(guān)鍵蛋白在腫瘤中的研究較少,其作用機(jī)制也尚不明確。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測SCAMP2在CRC中的表達(dá)水平,探討其與CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

SCAMP2的結(jié)構(gòu)主要為4個高度保守的跨膜區(qū)域以及多個N端NPF重復(fù)的序列,EH結(jié)構(gòu)域蛋白與NPF相互作用,進(jìn)行囊泡的轉(zhuǎn)運[15］。BLONDEAU等[21］研究發(fā)現(xiàn)SCAMPs與參與物質(zhì)運輸?shù)木W(wǎng)格蛋白共定位,提示SCAMP2同樣參與了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程。本研究的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,SCAMP2在細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞間質(zhì)中均有分布,這可能與其轉(zhuǎn)運功能相關(guān);同時病理特征分析結(jié)果表明SCAMP2的表達(dá)與腫瘤體積具有相關(guān)性,SCAMP2在CRC中低表達(dá),且SCAMP2低表達(dá)患者腫瘤體積較大,提示SCAMP2可能與CRC的發(fā)生有關(guān)系,但還需進(jìn)一步明確其在CRC中的具體作用機(jī)制。本研究顯示SCAMP2的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤程度、KRAS和NRAS突變情況無明顯相關(guān)性,分析原因可能與本研究選用的標(biāo)本全為CRC與癌旁正常組織,因此制作成的組織芯片中陽性細(xì)胞占比為100%。可見僅僅以染色強(qiáng)度作為唯一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價,SCAMP2表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期等指標(biāo)沒有表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。

中國CRC診療規(guī)范推薦將MSI以及KRAS、NRAS基因的篩查結(jié)果作為臨床上CRC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和免疫用藥等的參考依據(jù),因此,研究SCAMP2表達(dá)水平與MSI、KRAS和NRAS基因間的關(guān)系,探討SCAMP2的表達(dá)水平能否作為CRC復(fù)發(fā)以及用藥的參考依據(jù),還是具有比較重要的臨床實際意義[22］。微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定多發(fā)于Lynch綜合征患者,并且是CRCⅡ期患者預(yù)后良好的指標(biāo)及氟尿嘧啶耐藥的靶點[23］。本研究結(jié)果顯示SCAMP2在CRC組織中高表達(dá)與存在MSI有關(guān)系,因此推測SCAMP2也可能是檢測Lynch綜合征的指標(biāo)以及氟尿嘧啶化療耐藥的靶點。YUE等[5］研究發(fā)現(xiàn),與健康人群相比較,急性髓系白血病患者的外周血中SCAMP2 mRNA的表達(dá)水平相對較高,且急性髓系白血病患者預(yù)后不良與SCAMP2 mRNA的高水平表達(dá)相關(guān),提示SCAMP2是急性髓系白血病的潛在致病基因。MAO等[4］研究還發(fā)現(xiàn),SCAMP1～SCAMP4在胰腺癌組織中的表達(dá)高于正常組織,但SCAMP2高表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后不良無關(guān),這與本研究中SCAMP2在CRC組織中低表達(dá)結(jié)論相反,由此推測SCAMP2在不同組織器官中的表達(dá)水平可能與組織的生物學(xué)特性有關(guān),即使是同一種蛋白在不同腫瘤組織的功能也會不同,如SCAMP3在肺腺癌組織中低表達(dá),發(fā)揮抑癌因子的作用;而在胰腺癌組織中高表達(dá),發(fā)揮促癌因子的作用。

綜上所述,SCAMP2在CRC組織中低表達(dá),可能與CRC的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性,其高表達(dá)可能與CRC腫瘤大小、MSI有關(guān)。但SCAMP2在CRC中發(fā)揮作用的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探討,SCAMP2能否作為早期診斷CRC的生物標(biāo)志物尚待明確。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號QYFYWZLL27662)。所有試驗過程均遵照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：喬業(yè)華、郭棟、王璐、曲婷婷參與了研究設(shè)計;喬業(yè)華、張翔雁、邢曉明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。