李宇鹍 劉欣 王榮 沈茜 丁雪麗 田字彬

(1 青島大學附屬醫(yī)院消化內科,山東 青島 266003; 2 濰坊醫(yī)學院整形外科醫(yī)院)

高尿酸血癥是一種常見代謝性疾病,由嘌呤代謝失調引起[1］。在大多數哺乳動物中,尿酸通過尿酸氧化酶轉化為更容易溶解的尿囊素排出體外。然而尿酸氧化酶基因在人類和類人猿的進化過程中發(fā)生了沉默突變,因此人類易患高尿酸血癥[2］。

人體尿酸主要通過腎臟途徑和腸道等腎外途徑進行排泄,其中腎臟排泄約占70%,腸道排泄約占30%[3-4］。尿酸的腸道排泄依賴于完整的腸道屏障及其維持的腸道穩(wěn)態(tài)。本課題組前期研究發(fā)現,高尿酸血癥模型小鼠糞便中短鏈脂肪酸(SCFAs)的含量明顯降低,可能存在有腸道黏膜屏障的損傷[5-6］。SCFAs是由特定的厭氧菌發(fā)酵膳食纖維和抗性淀粉等產生,在調節(jié)能量代謝、免疫、腸道發(fā)育方面有重要作用[7］。SCFAs主要為乙酸、丙酸和丁酸,其中丁酸是結腸上皮細胞最主要的能量來源,直接影響腸細胞生長和分化,對維持腸黏膜的健康和完整有重要意義[8］。研究表明丁酸鈉能夠調節(jié)脂肪性肝炎小鼠的腸道菌群,保護腸道屏障,從而減輕小鼠的脂肪性肝炎[9］。本研究旨在探討丁酸鈉對高尿酸血癥模型小鼠腸黏膜屏障的保護作用及機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

SPF級6周齡雄性C57BL/6小鼠24只,體質量18～23 g,來自山東省痛風實驗室。氧嗪酸鉀(美國Sigma公司);丁酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);BCA蛋白濃度試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);ZO-1兔單克隆抗體(英國Abcom公司);Occludin兔單克隆抗體(Servicebio);GAPDH、Tublin鼠單克隆抗體(上海愛必信生物科技有限公司);ELISA試劑盒、超敏化學發(fā)光(ECL)底物液(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組和處理C57BL/6小鼠于24 ℃、濕度50%、標準12-12 h晝夜節(jié)律環(huán)境下適應性喂養(yǎng)7 d。隨機分為對照組、模型組、丁酸鈉組,每組8只。模型組每天腹腔注射氧嗪酸鉀250 mg/kg,并自由取食高酵母飼料,制備高尿酸血癥模型[10］,丁酸鈉組小鼠在模型組飼養(yǎng)基礎上每天灌胃丁酸鈉200 mg/kg,對照組每天腹腔注射和灌胃等劑量生理鹽水,共干預21 d。

1.2.2樣本采集和制作 在干預的第7天,所有小鼠腹腔均注射氧嗪酸鉀1 h以后,于內眥靜脈取血0.5 mL,檢測血尿酸水平,以判斷高尿酸血癥小鼠模型是否成功。第21天時,記錄所有小鼠體質量,并收集小鼠新鮮糞便,用于后續(xù)實驗。然后CO2法處死,處死12 h前禁食,取所有小鼠小腸組織,置于液氮中,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取各組小鼠小腸組織0.5 cm,以40 g/L多聚甲醛固定后,經脫水、包埋、透明、切片等步驟,制作成4 μm厚的病理切片。HE染色顯微鏡下觀察小腸組織病理改變。

1.2.3Western blot方法檢測各組小鼠腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達 提取所有小鼠小腸組織總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。制備10%分離膠、5%濃縮膠,將玻璃板固定在電泳槽上,先80 V后120 V恒壓電泳,290 mA恒流濕轉法轉膜。完成以后,用抗體稀釋液按說明書稀釋一抗(ZO-1、Occludin 1∶1 000稀釋,Tublin、GAPDH 1∶5 000稀釋),將一抗完全浸潤PVDF膜后置于4 ℃搖床孵育過夜,使用與一抗相對應的稀釋過的二抗(1∶15 000稀釋)室溫孵育PVDF膜1.5 h,ECL化學顯影,暗室曝光。實驗重復3次,用Image J軟件分析條帶灰度值,目的蛋白的相對表達量以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值計算。

1.2.4免疫組化檢測小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白的表達 取所有小鼠小腸組織切片,烘烤2 h后二甲苯脫蠟,復水;用TRIS-EDTA修復抗原3 min;用體積分數0.03的H2O2-甲醇溶液在暗匣中避光室溫孵育10 min,阻斷內源性過氧化物酶活性;以體積分數0.10的羊血清37 ℃下孵育30 min,封閉非特異性抗原;滴加一抗(ZO-1 1∶100稀釋,Occludin 1∶500稀釋),濕盒內4 ℃下孵育過夜;滴加二抗,37 ℃下孵育30 min,DAB顯色5～10 min;蘇木素復染,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。熒光顯微鏡下隨機選取不重疊的視野5個,采用Image Pro-Plus 6.0進行免疫組化染色結果分析,免疫組化ZO-1和Occludin蛋白染色陽性結果呈現棕黃色,分離色彩后選取黃色部分,測定陽性顆粒積分吸光度和陽性表達面積。

1.2.5RT-qPCR方法檢測小鼠腸組織中ZO-1和OccludinmRNA表達 根據試劑盒說明書使用RNAiso Plus從所有小鼠小腸組織中提取總RNA。用Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒,去除gDNA,將其反轉錄為cDNA,以β-actin作為內參照,進行 RT-qPCR。每個樣品分別設置3個復孔,實驗重復3次。RT-qPCR擴增條件為,94 ℃預變性5 min;然后95 ℃變性3 s,60 ℃退火/延伸30 s,共進行40個循環(huán)。采用2-△△CT的方法計算目的基因的相對表達量,引物名稱及序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學處理

表1 引物名稱及其序列

2 結 果

2.1 模型組小鼠血清尿酸和糞便丁酸含量水平

當灌胃至第7天時,對照組和模型組小鼠的血清中尿酸水平分別為(110.35±18.33)、(353.18±57.32)μmol/L,兩組差異有顯著意義(t=9.95,P<0.05),提示高尿酸血癥小鼠模型建立成功。灌胃第21天時,對照組和模型組小鼠糞便中丁酸含量分別為(217.90±78.15)、(29.75±9.24)μg/g,兩組小鼠比較差異顯著(t=4.78,P<0.05),表明高尿酸血癥小鼠糞便丁酸含量降低,小鼠可以用于后續(xù)實驗。

2.2 各組小鼠體質量變化

干預期間3組小鼠均毛色黑亮,精神狀態(tài)、行動力正常,整體狀態(tài)良好。干預結束時,對照組、模型組和丁酸鈉組小鼠的體質量分別為(21.56±0.83)、(20.33±0.36)、(21.66±0.95)g,3組小鼠體質量比較差異有顯著性(F=4.70,P<0.05),其中模型組比對照組體質量顯著降低(t=3.03,P<0.05),丁酸鈉組與模型組相比體質量顯著升高(t=2.90,P<0.05)。

2.3 各組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白和mRNA表達水平

3組小鼠小腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達量比較差異均具有顯著意義(F=13.65、51.42,P<0.05),其中模型組與對照組、丁酸鈉組2種mRNA表達量比較差異均具有顯著意義(t=2.55～11.04,P<0.05),見圖1。

3組小鼠小腸組織中ZO-1、OccludinmRNA表達量比較差異均有顯著性(F=6.07、10.63,P<0.05),其中模型組與對照組、丁酸鈉組2種mRNA表達量比較差異均具有顯著性(t=3.72～5.12,P<0.05),見表2。

免疫組化染色結果顯示,與對照組小鼠相比,模型組小鼠小腸組織ZO-1以及Occludin蛋白陽性染色面積和強度降低,丁酸鈉組小鼠小腸組織ZO-1和Occludin蛋白陽性染色面積和強度均高于模型組,見圖2。

2.4 各組小鼠小腸組織病理改變比較

顯微鏡下觀察顯示,對照組小鼠小腸上皮結構完整,未見明顯病理損傷;模型組小鼠小腸局部上皮脫落、絨毛大量減少、斷裂;丁酸鈉組小腸上皮相對完整,絨毛輕度斷裂,見圖3。

圖1 各組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達情況

表2 各組小鼠的小腸組織中ZO-1和Occludin的蛋白和mRNA表達情況

圖2 各組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin的表達情況(免疫組織化學染色,400倍)

圖3 各組小鼠小腸組織病理改變(HE染色,400倍)

2.5 各組小鼠小腸組織中TNF-α、IL-6水平比較

對照組、模型組、丁酸鈉組小鼠的小腸組織當中TNF-α的水平分別為(62.40±13.33)、(190.56±53.02)、(57.40±9.88)ng/L,小腸組織當中IL-6的水平分別為(309.80±40.03)、(801.39±113.88)、(310.54±45.92)ng/L。3組小鼠小腸組織TNF-α、IL-6水平比較差異均有顯著意義(F=80.15、26.29,P<0.05),其中模型組與對照組、丁酸鈉組,小鼠小腸組織中2種炎癥因子水平比較差異均具有顯著意義(t=5.74～9.79,P<0.05)。

3 討 論

高尿酸血癥可以促進糖尿病、代謝綜合征、高血壓、動脈粥樣硬化和慢性腎臟病等疾病的發(fā)生和發(fā)展[11］。流行病學調查顯示,高尿酸血癥患病率逐年上升,如愛爾蘭男性高尿酸血癥發(fā)病率為19.7%～25.0%,女性發(fā)病率為20.5%～24.1%[12］;中國女性高尿酸血癥的發(fā)病率為7.9%,男性為19.4%,高尿酸血癥已經成為全球公共衛(wèi)生問題[13-14］。而高尿酸血癥患者是否存在腸道屏障損傷,目前還缺少明確研究報道,僅有少量研究表明高尿酸血癥可能會引起腸道炎癥和腸道生態(tài)失衡,從而影響腸道屏障的功能[15］。人體中的尿酸約有30%是通過腸道排泄的,腸道對尿酸的排泄發(fā)揮著重要作用,近年來尿酸的腸道排泄與腸道菌群的關系成為研究熱點之一。促進尿酸的腸道排泄,可減輕高尿酸血癥患者腎臟排泄負擔,防止和減緩因高尿酸血癥導致的慢性腎功能不全。腸道屏障由腸上皮與細胞間的緊密連接構成[16-18］,ZO-1和Occludin是2種重要的緊密連接蛋白,對于維持腸道屏障的完整性發(fā)揮著重要的作用[16,19］。本研究結果顯示,模型組小鼠小腸組織存在小腸絨毛斷裂、稀疏和腸上皮損傷,小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白和mRNA表達明顯低于對照組小鼠,同時模型組小鼠小腸炎癥因子TNF-α和IL-6水平明顯高于對照組,提示高尿酸血癥誘導的炎癥反應可能與腸道屏障功能受損有關,高尿酸可增加腸道炎癥反應及誘發(fā)腸道屏障功能損傷。

SCFAs是小腸內難以消化的碳水化合物經腸道微生物發(fā)酵的最終產物,丁酸是結腸上皮細胞的能量的底物,可促進腸道緊密連接蛋白表達,從而起到維護腸道屏障完整性的作用[20］。SCFAs可能通過促進腸上皮細胞的生長,加強腸道緊密連接,調節(jié)腸道菌群,維持腸道屏障功能發(fā)揮有益影響[20-21］。同時SCFAs對腸道微生物群具有調節(jié)和改善作用,可抑制有害菌增殖并增加有益菌的數量[22］。腸道絨毛的高度是衡量小腸結構完整性的重要指標之一。本研究顯示模型組小鼠糞便中丁酸含量顯著降低,給予丁酸鈉干預后,丁酸鈉組小鼠小腸病理損傷較模型組明顯減輕,提示丁酸鈉可保護小腸上皮的完整性及維護腸道屏障。有研究表明腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白在腸黏膜屏障完整性中發(fā)揮著至關重要的作用,當緊密連接蛋白出現表達異常,會導致腸道通透性的增強,進而導致多種疾病發(fā)生[23-24］。本研究顯示丁酸鈉組小鼠小腸組織中的ZO-1以及Occludin的蛋白和mRNA表達水平均明顯高于模型組小鼠,免疫組化結果顯示丁酸鈉組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin的陽性染色面積和強度均高于模型組小鼠,提示丁酸鈉可能通過增加腸上皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達保護高尿酸血癥引起的腸道屏障損害。

炎癥因子增加可導致上皮功能及腸道屏障損傷,細胞因子及炎性介質的產生會導致腸黏膜通透性增強、免疫功能障礙以及菌群失調,引起腸屏障功能障礙[25-26］。有研究顯示高尿酸血癥患者的炎癥細胞因子水平升高[27］。本研究結果顯示,丁酸鈉組小鼠小腸組織中TNF-α和IL-6水平明顯低于模型組小鼠,提示炎癥因子水平與腸上皮緊密連接功能障礙相關,丁酸鈉可能通過抑制腸道的炎癥反應來維護腸道屏障。

綜上所述,通過腹腔注射氧嗪酸鉀聯合高酵母飼料可成功構建小鼠高尿酸血癥模型,且高尿酸血癥模型小鼠小腸存在腸道屏障損傷;丁酸鈉灌胃治療可以上調小鼠小腸緊密連接蛋白表達,減輕腸道炎癥,從而發(fā)揮對腸道屏障的保護作用。本研究為丁酸鈉治療高尿酸血癥及痛風提供了理論依據,但具體機制還有待進一步研究。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會批準(文件號AH-QU-MAL20210430)。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》進行。

作者聲明：田字彬、李宇鹍、劉欣、王榮參與了研究設計;李宇鹍、沈茜、丁雪麗參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。