張美萍，李曉慧，牛健，陳超，田密

北京振東光明藥物研究院有限公司（北京 100085）

鈣維生素DK咀嚼片是以鈣、維生素D3（VD3）、維生素K2（VK2）為原料制成的營養(yǎng)素補(bǔ)充劑，可以防治骨質(zhì)疏松[1]和血管鈣化[2-3]。鈣是維持骨骼健康的主要營養(yǎng)素，對預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥起到重要作用[4]。維生素D3能夠增加腸道鈣吸收，維持機(jī)體鈣平衡[5]。維生素K2可以活化骨鈣蛋白與鈣離子結(jié)合，刺激成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨形成[6-7]，此外還具有改善血管鈣化等作用[8-9]。

鈣維生素DK咀嚼片制備工藝：原輔料混合→濕法制粒→干燥→整?！偦臁鷫浩b。

濕法制粒[10]得到的顆粒粒徑如果相差太大，會(huì)影響產(chǎn)品混合效果，從而影響營養(yǎng)素的含量均勻性，同時(shí)還會(huì)造成壓片過程中片重不穩(wěn)；總混工藝同樣會(huì)影響產(chǎn)品中營養(yǎng)素的含量均勻性，制粒和總混是產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵工藝，需要重點(diǎn)考察和控制。

相較于正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)在考察因素較多的情況下，需要的試驗(yàn)次數(shù)較多[11]，試驗(yàn)選用的確定性篩選設(shè)計(jì)（definitive screening design，DSD）[12]能夠僅用較少的試驗(yàn)次數(shù)實(shí)現(xiàn)對10個(gè)因素的篩選和優(yōu)化，極大地節(jié)省試驗(yàn)成本[13-14]。此產(chǎn)品中含兩種脂溶性維生素VD3、VK2，其化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，與鈣配伍時(shí)，其穩(wěn)定性是產(chǎn)品開發(fā)的極大挑戰(zhàn)[15-16]。此次試驗(yàn)考察了糖醇添加量、顆粒水分、光照、氧氣對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響，為產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2 000 ppm維生素K2（德國Gnosis）；0.25%維生素D3（廈門金達(dá)威生物科技有限公司）；0.015 mm碳酸鈣（上海諾誠藥業(yè)股份有限公司）；山梨糖醇（保齡寶生物股份有限公司）；麥芽糊精、聚維酮K30、二氧化硅（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；三氯蔗糖（山東三和維信生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

SYH-10三維運(yùn)動(dòng)混合機(jī)（常州市高強(qiáng)干燥設(shè)備有限公司）；HS-200三維運(yùn)動(dòng)混合機(jī)（江蘇星星干燥設(shè)備有限公司）；HLSG-10P高效混合制粒機(jī)（浙江明天機(jī)械有限公司）；FG-50沸騰干燥機(jī)（江蘇國朗機(jī)械制造有限公司）；C&C800旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)（北京創(chuàng)博佳維科技有限公司）；Xse205分析天平（Mettler）；Waters e2695高效液相色譜（Waters科技有限公司）；PinAAcle900T原子吸收光譜儀（Perkein Elmer）；Labonce-250GS穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司）；HX/HS快速水分測定儀（梅特勒-托利多有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)品濕法制粒輔料及工藝優(yōu)化

共選擇3個(gè)輔料變量和2個(gè)工藝變量（表1）用于確定性篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)變量設(shè)置3個(gè)水平，以顆粒合格率（0.250 mm＜d＜0.850 mm）為響應(yīng)，利用JMP 13.0軟件DSD進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 制粒DSD因素和水平

將碳酸鈣、麥芽糊精、山梨糖醇混合均勻后，添加聚維酮K30溶液（添加量為混合粉質(zhì)量的15%）進(jìn)行制粒，濕顆粒置于沸騰干燥機(jī)中（溫度50~55 ℃）干燥，干顆粒用篩分法測定粒徑分布。

1.3.2 產(chǎn)品總混工藝優(yōu)化

根據(jù)1.3.1小節(jié)篩選出的最佳配方和工藝制粒，制得的干顆粒與VD3、VK2、三氯蔗糖、二氧化硅混合。共選擇1個(gè)輔料變量和4個(gè)工藝變量（表2）用于確定性篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)變量設(shè)置3個(gè)水平，以VD3混合均勻度變異系數(shù)為響應(yīng)值。VD3混合均勻度變異系數(shù)（C.V.）通過同一批次10個(gè)樣品中VD3含量的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）計(jì)算得到[17]，C.V.值越大，混合均勻度越差。均勻度變異系數(shù)按式（1）計(jì)算。

表2 混合DSD因素和水平

1.3.3 產(chǎn)品最優(yōu)配方及工藝驗(yàn)證

根據(jù)DSD篩選的最優(yōu)配方及工藝參數(shù)放大3批進(jìn)行驗(yàn)證（56 kg/批），檢測其顆粒合格率、VD3混合均勻度及含量、鈣含量、VK2含量[18]，并對片劑感官、脆碎度和片重差異進(jìn)行檢測。VD3含量檢測方法：《中國藥典 四部 2020版》；鈣含量檢測方法：GB 5009.92[19]。

1.3.4 影響產(chǎn)品穩(wěn)定性因素考察

1.3.4.1 不同山梨糖醇添加量對VD3、VK2穩(wěn)定性影響

將山梨糖醇添加量分別調(diào)整為0，10%，20%，30%和40%，麥芽糊精添加量分別對應(yīng)為40%，30%，20%，10%和0，制得干顆粒后與其他原輔料混合均勻，壓片（1.0 g/片），用白色塑料瓶密封包裝，置于穩(wěn)定性箱（溫度37±2 ℃，相對濕度75%±5%）3個(gè)月，分別于0，1，2和3月檢測VD3和VK2含量，并計(jì)算穩(wěn)定性，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。穩(wěn)定性按式（2）計(jì)算。

式中：W0為0月維生素含量，μg/片；Wn為加速后維生素含量，μg/片；n為1，2和3月。

1.3.4.2 不同顆粒水分對VD3、VK2穩(wěn)定性影響

將制粒后的濕顆粒干燥水分分別控制在2%，5%，8%和11%時(shí)得干顆粒，其余步驟參照1.3.4.1小節(jié)進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

1.3.4.3 不同包裝條件對VD3、VK2穩(wěn)定性影響

將制備的樣品分別置于白色塑料瓶、棕色塑料瓶、透明塑料瓶、白色塑料瓶（加脫氧劑）密封包裝，參照1.3.4.1小節(jié)進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)品濕法制粒輔料及工藝優(yōu)化

根據(jù)表3試驗(yàn)設(shè)計(jì)對聚維酮K30溶液濃度、麥芽糊精添加量、山梨糖醇添加量、制粒時(shí)間和干燥時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以顆粒合格率為評價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 制粒DSD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行向前逐步多元回歸，按式（3）計(jì)算。

模型的R2為0.953，P為0.001 4，說明該模型擬合較好且顯著（P＜0.01）。結(jié)果顯示，聚維酮K30溶液濃度（X1）和制粒時(shí)間（X4）對顆粒合格率有影響但不顯著（P＞0.05），而X1與X4有顯著的二階交互作用（P＜0.01），此外X1的二階平方項(xiàng)也顯著影響（P＜0.01）。結(jié)果顯示X1與顆粒合格率負(fù)相關(guān)，X4與顆粒合格率正相關(guān)。聚維酮K30濃度過高會(huì)導(dǎo)致粉末黏性過大，搖擺制粒時(shí)不易成粒且粘篩網(wǎng)，造成顆粒合格率下降。制粒時(shí)間延長能夠提高原輔料的黏性，黏合劑用量也應(yīng)相應(yīng)降低，在制粒時(shí)不能忽略兩者的交互作用而單獨(dú)調(diào)整其中一個(gè)參數(shù)。根據(jù)DSD優(yōu)化結(jié)果，聚維酮K30溶液濃度（X1）為14.4%，制粒時(shí)間（X4）為300 s時(shí)，顆粒合格率最高。

2.2 產(chǎn)品總混工藝優(yōu)化

姜艷喜等[20]發(fā)現(xiàn)粉體顆粒的水分一定程度上影響顆粒間的黏著力及顆粒與容器壁的附著力，從而影響混合效果。利用DSD試驗(yàn)設(shè)計(jì)對顆粒水分、二氧化硅添加量（潤滑劑）、裝載系數(shù)、混合轉(zhuǎn)速和混合時(shí)間進(jìn)行考察和優(yōu)化，以VD3混合均勻度變異系數(shù)（C.V.值）為評價(jià)指標(biāo)（VD3添加量最小為0.25%），C.V.值越小說明混合均勻性越好。試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 總混工藝DSD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行向前逐步多元回歸，按式（4）計(jì)算。

模型的R2為0.957，P為0.000 6，說明該模型擬合較好且顯著（P＜0.01）。結(jié)果顯示裝載系數(shù)（X8）和混合時(shí)間（X10）對混合均勻性有顯著影響（P＜0.01），此外X10的二階平方項(xiàng)也顯著影響（P＜0.01）。結(jié)果顯示X8與混合均勻性負(fù)相關(guān)，X10與混合均勻性正相關(guān)。在產(chǎn)品商業(yè)化生產(chǎn)中裝載系數(shù)過小，混合時(shí)間較長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品生產(chǎn)成本增加，在滿足產(chǎn)品混合均勻性前提下，應(yīng)適當(dāng)提高裝載系數(shù)，減少混合時(shí)間，以縮短產(chǎn)品生產(chǎn)周期。根據(jù)DSD優(yōu)化結(jié)果，裝載系數(shù)（X8）為0.4，混合時(shí)間（X10）為22 min時(shí)，VD3混合均勻性最好。

2.3 產(chǎn)品最優(yōu)配方及工藝驗(yàn)證

按照DSD優(yōu)化得到的最優(yōu)配方及工藝參數(shù)（表5），進(jìn)行3批次產(chǎn)品驗(yàn)證，結(jié)果見表6。

表5 優(yōu)化配方及工藝參數(shù)

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照表5參數(shù)設(shè)計(jì)進(jìn)行3批產(chǎn)品工藝放大驗(yàn)證，結(jié)果顯示（表6）：3批產(chǎn)品的顆粒合格率均良好，與擬合結(jié)果吻合，能夠滿足壓片要求；C.V.值均不超過5%，證明混合均勻性良好；功效成分鈣、VD3、VK2含量均合格；感官、脆碎度及片重差異均符合要求，說明經(jīng)過優(yōu)化后的產(chǎn)品工藝穩(wěn)定，質(zhì)量合格，能夠用于大生產(chǎn)。

2.4 影響產(chǎn)品穩(wěn)定性因素考察

2.4.1 不同山梨糖醇添加量對VD3、VK2穩(wěn)定性影響

糖醇類輔料因在制劑中能與大多數(shù)原料配伍、可壓性好、口感好等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于片劑中[21]。但糖醇具有引濕性，可能對產(chǎn)品的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響。山梨糖醇不同添加量對VD3、VK2穩(wěn)定性的影響結(jié)果見表7。

表7 山梨糖醇不同添加量VD3、VK2穩(wěn)定性結(jié)果（n=3）

由表7數(shù)據(jù)可知，山梨糖醇添加量對片劑中VK2穩(wěn)定性影響較大，添加量與VK2穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。添加量為0和10%時(shí)，加速3個(gè)月穩(wěn)定性分別為91.21%和89.23%，兩者無顯著性差異（P＞0.05），這與Orlando等[16]的研究結(jié)果基本一致：VK2與碳酸鈣配伍加速3月穩(wěn)定性超90%。添加量高于10%時(shí)，均顯著影響了VK2含量穩(wěn)定性，而山梨糖醇的添加量對VD3穩(wěn)定性影響較小，原因可能是VD3原料經(jīng)過了微囊化包埋，而VK2原料未進(jìn)行包埋導(dǎo)致其穩(wěn)定性差。侯志遠(yuǎn)等[22]認(rèn)為可以通過原輔料相容性試驗(yàn)排除與VD3有作用的輔料，得到的輔料可以成為VD3的“保護(hù)傘”，改善VD3在復(fù)方固體制劑中的穩(wěn)定性，此產(chǎn)品中麥芽糊精相比山梨糖醇更能夠?qū)K2起到“保護(hù)”作用，可適當(dāng)降低山梨糖醇的添加量，這也提示企業(yè)在進(jìn)行同類產(chǎn)品開發(fā)時(shí)，應(yīng)注意糖醇類輔料對VK2穩(wěn)定性的影響。

2.4.2 不同顆粒水分對VD3、VK2穩(wěn)定性影響

水分是很多化學(xué)反應(yīng)的介質(zhì)，過多的水分會(huì)軟化維生素微粒，增加氧氣和水分的滲透性，破壞維生素穩(wěn)定性[23]。制粒工藝中黏合劑溶液的添加是引入水分的主要途徑，顆粒經(jīng)過干燥可以去除大部分水分，試驗(yàn)通過控制干燥時(shí)間將顆粒水分分別調(diào)整到2%，5%，8%和11%，以考察水分對VD3、VK2穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如表8所示。

表8 不同顆粒水分VD3、VK2穩(wěn)定性結(jié)果（n=3）

由表8數(shù)據(jù)可知，顆粒的含水量對片劑中VD3和VK2穩(wěn)定性都有影響，水分含量與穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。顆粒水分為2%和5%時(shí)，加速3個(gè)月VD3和VK2穩(wěn)定性均能達(dá)到80%以上，穩(wěn)定性較好，兩者無顯著性差異（均P＞0.05），顆粒水分含量高于5%時(shí)，加速3月后VD3和VK2穩(wěn)定性均顯著低于顆粒水分為2%時(shí)（均P＜0.01）。為了節(jié)約能源同時(shí)縮短產(chǎn)品生產(chǎn)周期，該產(chǎn)品顆粒干燥水分控制在5%左右即可。

2.4.3 不同包裝條件對VD3、VK2穩(wěn)定性影響

Begari等[24]研究發(fā)現(xiàn)VK2對光比較敏感，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存及使用過程中采取適當(dāng)?shù)谋芄獯胧梢越档蚔K2的分解率。孫健等[25]將配方粉進(jìn)行48 h光照后，VK的留存率不足70.0%，建議配方粉包裝盡可能選擇阻光阻氧的包裝材質(zhì)，以降低光照因素對其產(chǎn)生的影響。此產(chǎn)品不同包裝條件對VD3、VK2穩(wěn)定性影響試驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 不同包裝條件對產(chǎn)品中VD3、VK2穩(wěn)定性影響結(jié)果（n=3）

利用不同包裝條件考察光照、氧氣對VD3、VK2穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如表9所示。樣品分別用白色、棕色、透明塑料瓶包裝，VD3經(jīng)3個(gè)月加速穩(wěn)定性分別為91.34%，91.21%和78.67%，透明塑料瓶3月穩(wěn)定性顯著低于白色塑料瓶（P＜0.01），表明光照會(huì)影響VD3穩(wěn)定性。棕色與白色塑料瓶相比差異不顯著（P＞0.05）。內(nèi)置脫氧劑對VD3穩(wěn)定性影響不顯著（P＞0.05），可能是因?yàn)閂D3包埋壁材起到隔絕氧氣的作用。VK2經(jīng)3個(gè)月加速穩(wěn)定性分別為87.39%，88.27%和61.20%，透明塑料瓶3月穩(wěn)定性顯著低于白色塑料瓶（P＜0.01），表明光照同樣影響VK2穩(wěn)定性。棕色與白色塑料瓶相比差異不顯著（P＞0.05），說明白色塑料瓶內(nèi)同樣含有遮光物質(zhì)，能夠滿足產(chǎn)品對阻光的要求。內(nèi)置脫氧劑顯著改善其穩(wěn)定性（P＜0.01），表明氧氣對VK2穩(wěn)定性有影響。此產(chǎn)品在生產(chǎn)及儲(chǔ)存過程中應(yīng)盡量避光，企業(yè)在成本允許的條件下包裝時(shí)盡量使用脫氧劑。

3 結(jié)論

目前VD3、VK2與鈣配伍的產(chǎn)品，混合均勻性和穩(wěn)定性是兩大技術(shù)性難題，尤其是VK2穩(wěn)定性研究方面的報(bào)道較少。此研究通過DSD優(yōu)化了制粒和混合工藝參數(shù)，用較少次數(shù)的試驗(yàn)完成了共10個(gè)變量的優(yōu)化，經(jīng)過優(yōu)化后的產(chǎn)品混合均勻性良好，且經(jīng)過放大驗(yàn)證能夠在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。同時(shí)對影響產(chǎn)品VD3、VK2穩(wěn)定性的因素進(jìn)行了考察，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。文章針對這兩個(gè)問題進(jìn)行重點(diǎn)研究，研制的產(chǎn)品混合均勻性和穩(wěn)定性均能符合要求，下一步可對配伍的輔料種類進(jìn)行重點(diǎn)篩選優(yōu)化，以得到口味更佳、穩(wěn)定性更好的產(chǎn)品。