張 波,王 松,阿依恒·曲庫爾汗 （新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，新疆 烏魯木齊 830054）

喉乳頭狀瘤（laryngeal papilloma,LP）是一種常見的良性腫瘤，主要影響10歲以下兒童[1]，一般認(rèn)為人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染是主要原因[2]。LP患者可能出現(xiàn)異物感、吞咽困難、呼吸困難或口齒不清等癥狀[1]。目前，手術(shù)是LP的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，包括手術(shù)切除、CO2激光切除和內(nèi)鏡下切除。LP雖然是良性腫瘤，但在兒童中腫瘤生長較快，易復(fù)發(fā)，且其發(fā)展機制尚不清楚[3]。因此，有必要深入研究LP發(fā)生發(fā)展的分子機制。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是由200多個核苷酸組成且不編碼蛋白的RNA分子[4]，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用[5-7]。研究表明，長鏈非編碼RNA核富集轉(zhuǎn)錄本1（nuclear enriched abundant transcript 1,lncRNA NEAT1）在喉癌中通過吸附抑制miR-204-5p促進(jìn)其靶基因軸突導(dǎo)向因子4B（semaphorin 4B,SEMA4B）的表達(dá)從而誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞的增殖和侵襲[8]。然而，lncRNA NEAT1在LP中的作用和調(diào)控機制仍不清楚。

miR-let-7a最早是在線蟲研究過程中發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的微小RNA，已被證明可抑制宮頸癌和肝癌等多種腫瘤的進(jìn)展[9-10]。研究顯示，miR-let-7a可靶向抑制堿性亮氨酸拉鏈和W2結(jié)構(gòu)域2（basic leucine zipper and W2 domains 2，BZW2）的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。然而，miR-let-7a/BZW2軸是否在LP中起作用尚不清楚。

本研究從lncRNA NEAT1在LP細(xì)胞中的表達(dá)以及對miR-let-7a和BZW2的作用入手，探討lncRNA NEAT1對LP細(xì)胞的增殖和凋亡逃逸的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

人喉乳頭狀瘤細(xì)胞Hs840.T及人口腔上皮細(xì)胞（human oral epithelial cells,HOECs）均購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM購于美國Gibco公司。10%胎牛血清購于美國Thermo Fisher Scientific公司。TaqMan human miRNA檢測試劑盒、TRIzol購于美國Invitrogen公司。Power SYBR Green購于日本Takara公司。lncRNA NEAT1的過表達(dá)重組載體pcDNA3.1（+）-lncRNA NEAT1（pcDNA-NEAT1）以及 pcDNA-NEAT1陰性對照（pcDNA-NC）、沉默lncRNA NEAT1的小干擾RNA載體（siNEAT1）以及 siNEAT1的陰性對照（siNC）、miR-let-7a的模擬物（mimic）、mimic的陰性對照（mimic-NC）、miR-let-7a抑制劑（inhibitor）、inhibitor陰性對照（inhibitor-NC）、BZW2的小干擾RNA載體（siBZW2）以及siBZW2的陰性對照（siBZW2-NC）均購于上海Genepharm公司。lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Invitrogen公司。Prime Script RT試劑盒和SYBR Green Real Time PCR試劑盒均購于日本Takara公司。RIPA緩沖液和MTT測定試劑盒購于上海Beyo?time公司。細(xì)胞裂解緩沖液購于美國Sigma公司。PVDF膜購于美國Millipore公司。ECL試劑盒購于美國Bio-Rad公司。兔抗BZW2、GAPDH的一抗和相應(yīng)的羊抗兔二抗均購于英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

Hs840.T和HOECs用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HOECs作為Hs840.T中l(wèi)ncRNA NEAT1、miR-let-7a、BZW2表達(dá)檢測的對照細(xì)胞。

pcDNA-NEAT1、siNEAT1、siNEAT1、mimic、inhibitor、siBZW2以及各自的陰性對照組均基于lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染指定的質(zhì)粒。針對 lncRNA NEAT1特定的siRNA序列是5'-GAGGGAUGAGGGUGAAGAA-3'。將Hs840.T分為pcDNA-NEAT1組、pcDNA-NC組、siNEAT1組、siNC組、mimic組、mimic-NC組、inhibitor組、inhibitor-NC組、siBZW2組、siBZW2-NC組、pcDNA-NEAT1聯(lián)合siBZW2給藥（pcDNA-NEAT1+siBZW2）組和 pcDNANEAT1聯(lián)合siBZW2-NC給藥（pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC）組。

1.3 qRT-PCR檢測lncRNA NEAT1和miR-let-7a的表達(dá)

收集正常培養(yǎng)的Hs840.T和HOECs以及1.2中Hs840.T的各處理組細(xì)胞，按照說明書用TRIzol試劑提取總RNA。根據(jù)Prime Script RT試劑盒說明書合成互補DNA（cDNA），采用莖環(huán)法合成miR-let-7a的cDNA。并根據(jù)SYBR Green Real Time PCR Kit的說明書檢測lncRNA NEAT1、miR-let-7a和BZW2的相對表達(dá)水平，反應(yīng)體系：1 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL、10 μL SYBR Premix Ex Taq、8 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共 40個循環(huán)。GAPDH為lncRNA NEAT1和BZW2的內(nèi)參，U6為miR-let-7a RNA 的內(nèi)參。相對表達(dá)量采用 2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot檢測BZW2的表達(dá)

收集正常培養(yǎng)的Hs840.T和HOECs以及1.2中Hs840.T的各處理組細(xì)胞，用RIPA緩沖液進(jìn)行裂解，使用SDS-PAGE凝膠電泳（90 V 30 min,120 V 1 h）分離收集的細(xì)胞裂解物，然后用濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（400 mA,2 h）。使用5%脫脂牛奶封閉2 h，洗滌后用BZW2一抗（1∶500）4 ℃孵育16 h。洗滌后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h。內(nèi)參蛋白為GAPDH。采用ECL對蛋白條帶進(jìn)行顯色并成像。Image J分析各組條帶的灰度值。

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

lncRNA NEAT1和miR-let-7a及miR-let-7a和BZW2的堿基結(jié)合位點用StarBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測分析。進(jìn)一步驗證lncRNA NEAT1和miR-let-7a及miR-let-7a和BZW2的靶向關(guān)系。含預(yù)測miR-let-7a結(jié)合位點的野生型（WT）和突變型（MUT）lncRNA NEAT1和BZW2 3'-非翻譯區(qū)（UTR）片段的熒光素酶轉(zhuǎn)染載體均由上海吉瑪公司構(gòu)建。根據(jù)說明書將Hs840.T接種在6孔板中并使用lipofectamine 3000聯(lián)合轉(zhuǎn)染mimic和NEAT1 WT/NEAT1 MUT以及mimic和BZW2-WT/BZW2-MUT。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)（美國Promega公司）分析lncRNA NEAT1和BZW2的熒光素酶活性。

1.6 細(xì)胞增殖實驗

采用MTT測定細(xì)胞增增殖率。將各組處理好的Hs840.T接種于96孔板，培養(yǎng)4 h后與MTT試劑混合再維持4 h，棄上清，加DMSO溶解甲瓚。使用多板讀數(shù)器（美國Bio-Rad公司，680型）檢測570 nm波長處的吸光度。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞的凋亡情況

采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測Hs840.T的凋亡情況。將每組1×105個Hs840.T重懸于500 μL Annexin結(jié)合緩沖液，然后用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI標(biāo)記，室溫下避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀（美國MilliporeSigma公司）檢測綠色（Annexin V-FITC）和紅色（PI）熒光。檢測波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad PRISM 5.01軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示。Pearson相關(guān)性分析法分析Hs840.T中l(wèi)ncRNA NEAT1與miR-let-7a表達(dá)的相關(guān)性。2組間的數(shù)據(jù)差異采用t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行LSD-t多重比較。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NEAT1、miR-let-7a、BZW2 在 HOECs和Hs840.T中的表達(dá)

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，Hs840.T中的lncRNA NEAT1、BZW2 mRNA表達(dá)高于HOECs（P<0.05），而Hs840.T中 miR-let-7a的表達(dá)低于 HOECs（P<0.05），見圖1a~c。Hs840.T中BZW2蛋白水平高于HOECs（P<0.05），見圖1d。

圖1 Hs840.T和HOECs中l(wèi)ncRNA NEAT1、miR-let-7a和BZW2的表達(dá)

2.2 LP細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1作為分子海綿吸附miR-let-7a

Hs840.T中l(wèi)ncRNA NEAT1與miR-let-7a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見圖2a。與pcDNA-NC組比較，pcDNA-NEAT1組中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而miR-let-7a的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），見圖2b、c。而與siNC組比，siNEAT1組中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），miR-let-7a的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見圖2d、e。

圖2 lncRNA NEAT1吸附抑制Hs840.T中的miR-let-7a

從StarBase數(shù)據(jù)庫中查詢到lncRNA NEAT1包含miR-let-7a的互補位點，見圖2f。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，Hs840.T中轉(zhuǎn)染mimic導(dǎo)致NEAT1 WT的熒光素酶活性被抑制（P<0.05），而NEAT1 MUT的熒光素酶活性無顯著變化（P>0.05），見圖2g。

2.3 lncRNA NEAT1通過抑制miR-let-7a上調(diào)BZW2

Hs840.T中BZW2與miR-let-7a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），而與lncRNA NEAT1呈正相關(guān)（P<0.05），見圖 3a、b。與 pcDNA-NC 組比，pcDNA-NEAT1組中BZW2的表達(dá)顯著增加（P<0.05），見圖3c、d。與siNC組比，siNEAT1組中BZW2的表達(dá)顯著減少（P<0.05），見圖 3e、f。與 mimic-NC 組比，mimic組中 lncRNA NEAT1的表達(dá)無顯著變化（P>0.05），miR-let-7a的表達(dá)顯著增加（P<0.05），而BZW2的表達(dá)顯著減少（P<0.05），見圖3g~j。與inhibitor-NC組比，inhibitor組lncRNA NEAT1的表達(dá)無顯著變化（P>0.05），miR-let-7a的表達(dá)顯著減少（P<0.05），而BZW2的表達(dá)顯著增加（P<0.05），見圖3k~n。

從StarBase數(shù)據(jù)庫中查詢到BZW2的3'UTR序列包含miR-let-7a的互補位點，見圖4a。另外，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，Hs840.T中轉(zhuǎn)染mimic導(dǎo)致BZW2-WT的熒光素酶活性被抑制（P<0.05），而BZW2-MUT的熒光素酶活性無顯著變化（P>0.05），見圖4b。說明BZW2是miR-let-7a的靶基因。

圖4 lncRNA NEAT1吸附抑制Hs840.T中的miR-let-7a

2.4 lncRNA NEAT1促進(jìn)LP細(xì)胞增殖及凋亡逃逸

pcDNA-NEAT1組Hs840.T的增殖率為（97.33±4.12）% ，高 于 pcDNA-NC 組 的（91.56±2.63）%（t=6.369,P=0.009）。siNEAT1組Hs840.T的增殖率為（76.89±4.58）%，低于 siNC 組的（92.03±5.32）%（t=10.230,P=0.001）。

Annexin-V FITC/PI實驗結(jié)果顯示，pcDNA-NEAT1組的早期凋亡率（0.16 ±0.02）%低于pcDNA-NC組的（0.43±0.02）%（t=5.966,P=0.031）。 pcDNA-NEAT1組的晚期凋亡率（0.33±0.04）%低于pcDNA-NC組的（0.62±0.05）%（t=6.230,P=0.011）。另外，siNEAT1組的早期凋亡率（30.07±2.01）%高于siNC組的（0.46±0.03）%（t=10.330,P=0.001）；siNEAT1組的晚期凋亡率（7.12±0.95）%高于 siNC 組的（0.54±0.07）%（t=9.623,P=0.002）。

2.5 lncRNA NEAT1通過激活BZW2促進(jìn)LP細(xì)胞增殖及凋亡逃逸

與pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC組比較，pcDNANEAT1+siBZW2組的BZW2 mRNA和蛋白表達(dá)都明顯降低（P<0.001），見圖5a、b。MTT結(jié)果顯示，pcDNANEAT1+siBZW2組中 Hs840.T的增殖率（68.26±7.11）%明顯低于 pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC組的（96.30±4.62）%（t=8.569,P=0.002）。

圖5 lncRNA NEAT1通過激活BZW2促進(jìn)LP細(xì)胞增殖及凋亡逃逸

pcDNA-NEAT1+siBZW2組中Hs840.T的早期凋亡率（2.45±0.31）%明顯高于pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC組的（0.11±0.01）%（t=9.882,P=0.001）。pcDNANEAT1+siBZW2組中Hs840.T的晚期凋亡率（12.35±0.95）%明顯高于 pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC組的（0.28±0.02）%（t=9.882,P=0.001）。

3 討論

lncRNA NEAT1是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵分子，與HPV引起的多種腫瘤密切相關(guān)[11-12]。本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)了lncRNA NEAT1促進(jìn)LP發(fā)展的關(guān)鍵證據(jù)。通過qRT-PCR、MTT、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)等實驗確定了lncRNA NEAT1過表達(dá)可以促進(jìn)LP細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡。通過StarBase數(shù)據(jù)庫、qRT-PCR、Western blot實驗以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1通過分子海綿的作用直接吸附miR-let-7a并激活LP細(xì)胞中的BZW2。而敲低BZW2則阻斷了lncRNA NEAT1誘導(dǎo)的LP細(xì)胞增殖，并挽救了細(xì)胞凋亡，敲低BZW2可以明顯促進(jìn)LP細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡。表明lncRNA NEAT1通過調(diào)控miR-let-7a/BZW2軸促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡逃逸從而在LP中發(fā)揮致癌作用，本研究為LP的治療提供了潛在的靶點。

目前，關(guān)于lncRNA在LP中的作用報道極少。有研究表明，lncRNA LINC00174可以通過吸附抑制miR-4500促進(jìn)BZW2表達(dá)，從而加速LP細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[13]。在本研究中，lncRNA NEAT1在LP細(xì)胞中高表達(dá)，而且lncRNA NEAT1過表達(dá)促進(jìn)了LP細(xì)胞增殖并阻礙了細(xì)胞凋亡，而lncRNA NEAT1沉默則顯著阻止了細(xì)胞增殖，明顯加劇了細(xì)胞的凋亡。證實了lncRNA NEAT1在LP中的致癌作用，表明lncRNA NEAT1與LP進(jìn)展的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究顯示，lncRNA NEAT1在多種癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞分泌的外泌體攜帶lncRNA NEAT1可以通過上調(diào)miR-26a/b-5p靶向STAT3信號通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展[14]；Shen等[15]證明了lncRNA NEAT1通過介導(dǎo)KDM5A/Cul4A和Wnt通路加速結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展。本研究結(jié)果也證實lncRNA NEAT1在LP中具有致癌作用。

lncRNA通過分子海綿的作用吸附抑制miRNA從而發(fā)揮生物學(xué)作用。據(jù)報道，lncRNA 408通過海綿化miR-654-5p激活LIMK1信號通路，從而加速乳腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[16]，lncRNA MT1JP已被證明通過海綿化miR-24-3p增強肝癌細(xì)胞對樂伐替尼的耐藥性[17]。此外，lncRNA ISG20通過抑制miR-486-5p促進(jìn)活化T細(xì)胞核因子5的表達(dá)并誘導(dǎo)糖尿病腎病的腎纖維化[18]。

本研究也證實了lncRNA NEAT1含有miR-let-7a的互補位點。此外，本研究通過生物信息學(xué)分析、lncRNA NEAT1對miR-let-7表達(dá)的調(diào)控作用分析以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，證明了LP中l(wèi)ncRNA NEAT1在功能上吸附miR-let-7a從而抑制miR-let-7a的表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，BZW2是miR-let-7a的靶基因，也可以被lncRNA NEAT1直接上調(diào)。在過表達(dá)lncRNA NEAT1的基礎(chǔ)上沉默BZW2明顯抑制了過表達(dá)lncRNA NEAT1導(dǎo)致的LP細(xì)胞增殖和凋亡逃逸，證實BZW2是lncRNA NEAT1和miR-let-7a的關(guān)鍵功能性下游靶點，表明lncRNA NEAT1通過促進(jìn)BZW2信號通路激活了LP的惡性行為。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在LP細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用，并通過直接調(diào)控miR-let-7a/BZW2軸促進(jìn)細(xì)胞增殖并加快細(xì)胞凋亡逃逸，可作為診斷和治療LP的潛在靶點。