王瑞麗 施蕊 雷娥 李雕益 包書軍 熊智

摘要：采用qPCR和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)固氮相關(guān)基因（nifH）進(jìn)行檢測(cè)，探究農(nóng)業(yè)果園經(jīng)營(yíng)形式下土壤固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及其影響因素。結(jié)果表明，種植地pH值在5.0左右，屬于典型的酸性土。綜合分析發(fā)現(xiàn)，澳洲堅(jiān)果園種植地帶養(yǎng)分含量明顯升高，并且種植區(qū)域養(yǎng)分含量也存在較大差異，說(shuō)明土壤肥力分布不均。與未種植區(qū)域相比，種植區(qū)域固氮細(xì)菌（相關(guān)基因nifH）群落豐富度和多樣性指數(shù)均呈下降趨勢(shì)。變形菌門（Proteobacteria）為含nifH基因的固氮細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度為18.21%～79.69%，并且種植使土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，固氮相關(guān)基因（nifH）拷貝數(shù)在7.325×106～5.120×107之間。土壤理化因素與功能基因拷貝數(shù)相關(guān)性結(jié)果表明，nifH基因拷貝數(shù)與AK、OP、NH+4-N、NO-3-N、TN、OM等的含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)。澳洲堅(jiān)果種植地中固氮細(xì)菌以變形菌門（Proteobacteria）為最優(yōu)勢(shì)的菌群，這為澳洲堅(jiān)果種植地土壤肥力恢復(fù)和固氮微生物的開(kāi)發(fā)利用提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：澳洲堅(jiān)果園；qPCR；高通量測(cè)序；固氮細(xì)菌；nifH；群落結(jié)構(gòu)；多樣性

中圖分類號(hào)： S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）08-0211-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：3166010405）；云南省重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：202002AA1007）。

作者簡(jiǎn)介：王瑞麗（1995—），女，貴州安順人，碩士研究生，主要從事澳洲堅(jiān)果功能微生物研究。E-mail：1393384429@qq.com。

通信作者：熊 智，博士，教授，主要從事微生物學(xué)和分子生物學(xué)研究。E-mail：zhix-swfu@qq.com。

氮元素是植物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)植物光合作用和增產(chǎn)起關(guān)鍵作用［1］。土壤固氮微生物是一類能將大氣中游離氮轉(zhuǎn)化為含氮有機(jī)物的原核微生物，其數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的變化與土壤氮素循環(huán)密切相關(guān)［2-3］。固氮微生物的固氮作用主要依靠其體內(nèi)的固氮酶，它們都依賴于nifH編碼固氮酶鐵蛋白亞基的基因，可廣泛用于檢測(cè)不同環(huán)境下固氮作用的基因［4］。大量nifH基因的研究表明，土壤有機(jī)質(zhì)和氮肥會(huì)顯著影響固氮微生物的物種數(shù)量和群落多樣性［5］。田永輝等的研究表明，種植年限會(huì)影響茶樹根際固氮微生物的群落組成和多樣性［6］。陳秀波研究發(fā)現(xiàn)，植被種類、土壤理化性質(zhì)、土壤施肥措施等因素會(huì)影響固氮微生物群落和多樣性的變化［7］。張苗苗等分別利用熒光定量PCR和末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性（T-RFLP）技術(shù)研究了長(zhǎng)期不同施肥處理對(duì)固氮基因的豐度和群落多樣性的影響，結(jié)果表明，與不施肥處理相比，稻草還田和施氮磷鉀（NPK）處理都能顯著增加固氮基因的豐度，而秸稈配施NPK處理的nifH基因豐度最高，因而可以增加土壤固氮能力；此外，長(zhǎng)期不同施肥處理顯著改變了群落結(jié)構(gòu)，但是對(duì)群落多樣性沒(méi)有顯著改變［8］。Wu等研究了施氮量和水稻品種對(duì)根系固氮細(xì)菌多樣性的影響，結(jié)果表明，氮肥和水稻品種都會(huì)顯著影響根系土壤固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)，β-變形菌是最主要的水稻根系固氮菌，施用氮肥會(huì)顯著降低α-變形菌的相對(duì)豐度［9］。Tan等的T-RFLP研究結(jié)果表明，施氮肥15 d后水稻根系固氮微生物群落迅速發(fā)生改變，即固氮微生物群落受到氮肥的影響，環(huán)境條件和水稻品種對(duì)根系固氮微生物群落有顯著影響［10］。固氮的富集改變了功能性固氮基因的豐度，固氮菌的數(shù)量越大，根際氮輸入量越大，有利于植物入侵。大量林地生態(tài)系統(tǒng)研究表明，氮循環(huán)微生物受pH值、土層深度和季節(jié)等因素影響。柳建銀研究發(fā)現(xiàn)，同一領(lǐng)域的紅樹林土壤樣品中，固氮微生物群落組成存在差異［11］。Mergel等通過(guò)靶定nifH基因，探究德酸性林地土壤固氮細(xì)菌種群，發(fā)現(xiàn)固氮菌群數(shù)量在0～5 cm土層最高，并隨土壤深度增加而降低［12］。Zhou等的研究表明，溫度對(duì)森林土壤功能菌群變化方面比其他擬議的環(huán)境驅(qū)動(dòng)因素起著更主要的作用［13］。

云南省是我國(guó)最大的澳洲堅(jiān)果種植區(qū)，主要分布于西雙版納、普洱、臨滄、保山、德宏等地市州。目前，澳洲堅(jiān)果已經(jīng)成為云南部分地區(qū)脫貧攻堅(jiān)、鄉(xiāng)村振興的重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)之一［14］。云南省近年大力發(fā)展高效林果業(yè)，目的是改善澳洲堅(jiān)果林的生態(tài)環(huán)境，最終實(shí)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。并且，澳洲堅(jiān)果樹是云南省主要代表果樹種之一，具有滋養(yǎng)水土的作用，對(duì)土壤肥力改善和土壤生態(tài)恢復(fù)具有積極的影響。目前關(guān)于人工農(nóng)業(yè)果林生態(tài)系統(tǒng)中土壤固氮微生物的研究相對(duì)缺乏。

本研究以未種植澳洲堅(jiān)果樹區(qū)域與種植區(qū)域土壤為研究對(duì)象，探討了種植澳洲堅(jiān)果樹對(duì)土壤理化性質(zhì)、土壤養(yǎng)分和群落特征等方面的影響，并且從基因水平上進(jìn)一步研究土壤微生物營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)提供參考。另外，可以比較種植地再利用方式的效果，為生態(tài)修復(fù)、功能微生物開(kāi)發(fā)與利用、土壤肥力恢復(fù)等提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集與處理

土壤樣品于2019年6月在云南省江城縣嘎勒村澳洲堅(jiān)果種植基地采集。樹種選取2013年種植的澳洲堅(jiān)果樹，土壤采集方法是按“S”形路線取樣法，土壤深度為5～30 cm，每棵樹分別在東西南北4個(gè)方向采集等量的土樣，并去除土樣中的雜質(zhì)，混勻后裝入高溫滅菌的采樣袋中，分裝2袋，一袋放在-80 ℃冰箱保存，另一袋4 ℃保存用于測(cè)定土壤養(yǎng)分。共取4個(gè)區(qū)域的土樣，A0表示非種植區(qū)域的土樣，A1、A2、A3代表種植地帶的土樣（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤養(yǎng)分測(cè)定 土壤pH值：分別取1袋土樣置于pH值為4.01、6.86、9.18的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，蒸餾水定容至100 mL，搖勻即配制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液，然后使用智能型漢顯多功能養(yǎng)分速測(cè)儀測(cè)定土壤pH值。

土壤速效鉀（AK）、有效磷（OP）、銨態(tài)氮（NH+4-N）和有機(jī)質(zhì)（OM）含量：根據(jù)智能型漢顯多功能養(yǎng)分速測(cè)儀所提供的試劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用特定的顯色劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)生顯色反應(yīng)，然后按照相應(yīng)的操作步驟測(cè)定其含量。

硝態(tài)氮（NO-3-N）含量：取5 g風(fēng)干土樣于三角瓶?jī)?nèi)，加入0.5 g CaSO4·2H2O和100 mL蒸餾水，蓋塞后在振蕩機(jī)上振蕩10 min。放置5 min后將上清液過(guò)濾于干燥潔凈的三角瓶?jī)?nèi)。吸取25 mL上清液于 100 mL 顯色管中，分別加入0.05 g CaCO3、酚二磺溶液2 mL、純水10 mL，1 ∶1氨水先加至溶液呈黃色，再補(bǔ)加3 mL，定容至100 mL后在分光光度計(jì)上于410 nm處比色。

1.2.2 土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的測(cè)定

1.2.2.1 DNA提取 從-80 ℃冷柜中稱取根際土壤0.2 g，按照土壤總DNA提取試劑盒的步驟提取總DNA，DNA純度和濃度用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，DNA提取效果用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)，檢測(cè)能跑出清晰條帶的DNA方可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.2.2 高通量分析 根據(jù)查得的固氮作用nifH引物序列擴(kuò)增要求，對(duì)提取成功的土壤總DNA進(jìn)行PCR試驗(yàn)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。正向引物F：5′-[JP9]AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′；反向引物 R：5′-[JP9]TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′。 PCR反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正反向引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶 0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板 10 ng，雙蒸水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，75 ℃ 45 s，37個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用美吉生物服務(wù)平臺(tái)完成氮循環(huán)功能基因的測(cè)序。

1.2.2.3 實(shí)時(shí)熒光測(cè)定PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：每個(gè)功能基因?qū)崟r(shí)熒光定量的質(zhì)粒均按照10倍稀釋梯度建立，90 μL稀釋液和10 μL質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)各功能基因預(yù)試驗(yàn)，nifH功能基因取10-8～10-2稀釋液繪制。反應(yīng)體系共20 μL：qPCR反應(yīng)混合物16.5 μL，上下游引物0.8 μL，DNA模板2 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。完成DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，將所有樣本放入熒光定量 PCR 儀中反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)完成后設(shè)置溶解曲線用以檢驗(yàn)產(chǎn)物的特異性。

1.2.2.4 結(jié)果計(jì)算 拷貝數(shù)（copies/μL）=DNA濃度（ng/μL）×10-9×6.02×1023/（分子量×660），式中分子量指載體的大小加上目的基因的片段大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤指標(biāo)分析

由表2可知，未種植區(qū)域土壤中AK、OP、NH+4-N、NO-3-N、TN、OM含量明顯低于種植區(qū)域，差異顯著（P<0.05）；種植區(qū)域各土樣除TN含量差異不顯著外，其他理化指標(biāo)都存在顯著差異（P<0.05），說(shuō)明種植區(qū)土壤肥力不均。

2.2 參與固氮作用的nifH基因群落結(jié)構(gòu)和多樣性

2.2.1 nifH基因群落分類和多樣性

高通量測(cè)序結(jié)果（表3）顯示，在種植區(qū)域與未種植區(qū)域中一共得到74 397條有效序列，其中未種植區(qū)域得到 13 661 條有效序列，種植區(qū)域每個(gè)樣本平均獲得 20 245 條，測(cè)序量能夠滿足后續(xù)的分析需要。未種植區(qū)域有效序列條數(shù)明顯低于種植區(qū)域，操作分類單元（OTU）數(shù)量明顯高于種植區(qū)域。所采土樣覆蓋度均在99.59％以上，說(shuō)明土樣中的固氮細(xì)菌均能被檢測(cè)到，即所測(cè)土樣中固氮細(xì)菌可以完全反映土樣情況。

根據(jù)相似度對(duì)所獲得的有效序列進(jìn)行OTU劃分。所有樣本序列共分為1 334種OTU，通過(guò)與nifH型數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，這1 334種OTU分別歸屬于3域3界8門13綱21目25科29屬38 種。從總體來(lái)看，未種植區(qū)域固氮作用nifH基因OTU數(shù)量最多，說(shuō)明種植會(huì)降低OTU數(shù)量，種植區(qū)域各土樣OTU數(shù)量間也存在顯著差異，說(shuō)明土壤肥力不均。

由各樣本的多樣性指數(shù)（表4）可知，未種植區(qū)域參與固氮作用的nifH基因的物種豐富度指數(shù)明顯比種植區(qū)域高，說(shuō)明種植會(huì)降低物種豐富度。與未種植區(qū)域相比，種植區(qū)域物種多樣性指數(shù)明顯降低，并且種植區(qū)域間也存在差異，說(shuō)明種植區(qū)域由于長(zhǎng)期大量施氮造成土壤肥力相差較大，從而降低了固氮微生物nifH的多樣性。從2個(gè)均勻度指數(shù)可以看出，種植區(qū)域土壤的均勻度低于未種植區(qū)域，表明種植會(huì)降低固氮細(xì)菌nifH的均勻度，同時(shí)種植區(qū)域之間也存在差異，有可能是施肥不均造成。

2.2.2 nifH基因韋恩圖 為了便于比較，對(duì)種植區(qū)域與未種植區(qū)域所采土樣進(jìn)行核心OTU分析（即在給定組內(nèi)所有樣品之間共享OTU），它們對(duì)應(yīng)于4組，包括未種植區(qū)域（A0）、種植區(qū)域（A1、A2、A3）（圖1）。未種植區(qū)域僅有526個(gè)核心OTU局限于單獨(dú)的組，而種植區(qū)域分別有129、78、102個(gè)核心OTU分別局限于單獨(dú)的組，共有89個(gè)核心OTU為所有組共享的，種植區(qū)域中所采樣本與未種植區(qū)域共享的OTU分別為205、182、246個(gè)，說(shuō)明種植澳洲堅(jiān)果樹會(huì)嚴(yán)重影響土壤固氮微生物群落的相似性。

2.2.3 nifH基因的群落柱形圖 由圖2可知，在門水平上，固氮作用nifH基因的群落共有8類物種組成，其中變形菌門（Proteobacteria）是主要物種，在各個(gè)土樣中的相對(duì)豐度介于18.21%～79.69%之間，尤其在A0、A3土樣中分別達(dá)到68.44%、79.69%，而在A1、A2土樣中分別只有18.21%、38.70%。其次是未分類的物種，相對(duì)豐度范圍為17.60％～81.29％，所占比例只比變形菌門低15.22%。在A1、A2、A3土樣中還分布著藍(lán)藻門（Cyanobacteria），相對(duì)豐度分別為0.13%、0.32%、0.18%，同時(shí)在A3土樣中還發(fā)現(xiàn)了厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和廣古菌門（Euryarchaeota），相對(duì)豐度分別為0.05%、0.14%、0.02%。

由圖3可知，在所有樣本中均以未分類的物種相對(duì)豐度最高，未種植區(qū)域可達(dá)30.58%，種植區(qū)域最高可達(dá)81.29％，最低是17.60%；其次是變形菌門（Proteobacteria），未種植區(qū)域豐度可達(dá)22.18%，種植區(qū)域最高可達(dá)33.17％，最低是4.10%。種植區(qū)域紅微菌屬（Rhodomicrobium）的相對(duì)豐度明顯比未種植區(qū)域高，未種植區(qū)域的相對(duì)豐度為9.3%，而種植區(qū)域的分別為2.15%、27.53%、17.13%。未種植區(qū)域未分類根瘤菌目（Rhizobiales）的相對(duì)豐度明顯比種植區(qū)域高，其在未種植區(qū)域的相對(duì)豐度為18.25%，而種植區(qū)域分別為0.90%、4.46%、5.34%?？傮w而言，種植會(huì)影響土壤固氮微生物的群落組成和群落間的豐度。

2.2.4 nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析 采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法選取總豐度排前35位的OTU代表序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，下載相似性最高的序列，利用MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖4所示，所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列相似性為75.57%～100%，樣本OTU根據(jù)門水平，可大致分為硝化螺菌門（Nitrospirae）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和未知菌類（unclassified）4個(gè)門類。在前35位OTU內(nèi)，A1土樣中有35條，A2土樣中有23條，A3土樣中有28條，A0土樣中有23條。與硝化螺菌門相似的序列有17條，A1土樣中有3條，A2土樣中有3條，A3土樣中有9條，A0土樣中有3條。與放線菌門相似的序列，A1土樣中有16條，A0土樣中有2條。與變形菌門相似的序列有4條，A1土樣中有3條，A0土樣中有2條，序列相似度為76.19%～99.72%。其他序列與未知菌類的nifH基因相似，序列相似度為75.57%～100.00%。

2.3 固氮基因?qū)崟r(shí)熒光定量

2.3.1 nifH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)所有功能基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖5可知，固氮作用nifH型細(xì)菌的決定系數(shù)（r2）為0.998 6，說(shuō)明此次定量的數(shù)據(jù)精確；擴(kuò)增效率為99.74%，可以達(dá)到繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果種植地固氮相關(guān)基因（nifH）的拷貝數(shù)在7.325×106～5.120×107之間。

2.3.2 nifH基因與理化因子相關(guān)性分析 由表5可以看出，固氮細(xì)菌nifH基因的豐度與AK、OP、NH+4-N、NO-3-N、TN、OM[JP+2]等的含量在0.01水平上呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，種植地帶固氮基因nifH的多樣性和豐富度顯著降低，種植地帶長(zhǎng)期施肥顯著影響了含nifH基因的固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。取樣時(shí)避過(guò)施肥區(qū)域，但種植區(qū)域群落結(jié)構(gòu)還是存在差異，說(shuō)明土壤肥力是區(qū)分不同群落結(jié)構(gòu)的最主要因素之一。變形菌門（Proteobacteria）為含nifH基因的固氮細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度為18.21%～79.69%。此外，在種植區(qū)域均發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻門（Cyanobacteria）的固氮菌群，這與江西紅壤中的研究結(jié)果［15］相似。董志新等的研究表明，固氮微生物的多樣性受土壤因素和種植條件的影響［16］。Hai等的研究表明，高粱秸稈與牛糞配施能增加固氮菌的數(shù)量，促進(jìn)土壤氮素的固定，降低氮素的損失［17］。Wang等發(fā)現(xiàn)，表層土壤的土壤有機(jī)碳（SOC）含量和銨態(tài)氮的濃度與固氮細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)有顯著的正相關(guān)關(guān)系，這說(shuō)明土壤理化性質(zhì)對(duì)表層土壤固氮細(xì)菌的群落具有選擇性［18］。Sharma等也發(fā)現(xiàn)，土壤濕度、有機(jī)質(zhì)含量和礦質(zhì)氮的濃度是影響固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的主要因素［19］。

本研究通過(guò)對(duì)固氮細(xì)菌實(shí)時(shí)熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果種植地固氮相關(guān)基因（nifH）拷貝數(shù)在7.325×106～5.120×107之間，孟晗研究發(fā)現(xiàn)旱地土壤中細(xì)菌的拷貝數(shù)在106左右［20］，兩者結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)種植澳洲堅(jiān)果會(huì)明顯降低固氮菌群nifH的基因拷貝數(shù)，種植區(qū)域較未種植區(qū)域基因拷貝數(shù)呈明顯的下降趨勢(shì)，這可能是由于施肥造成的，這與李帆研究青藏高原高寒草甸土壤中自生固氮細(xì)菌群落組成的結(jié)果［21］一致。

本研究表明，種植區(qū)域土壤養(yǎng)分含量明顯比未種植區(qū)域高。土壤固氮微生物豐度與養(yǎng)分元素的相關(guān)性分析結(jié)果表明，速效鉀、有效磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、全氮、有機(jī)質(zhì)含量對(duì)nifH基因拷貝數(shù)具有極顯著的影響，并且對(duì)基因拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)性，這與李帆研究土壤中自生固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)［21］一致。蘭鴻珠等研究濕地鹽節(jié)木泥土中固氮細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和功能基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)功能基因拷貝數(shù)與硝態(tài)氮、速效氮含量等存在相關(guān)性［22］。

本研究為研究和利用澳洲堅(jiān)果種植地中的固氮細(xì)菌提供了基礎(chǔ)依據(jù)。另一方面可以比較澳洲堅(jiān)果種植地再利用方式的效果，為生態(tài)修復(fù)、固氮微生物開(kāi)發(fā)與利用、土壤肥力恢復(fù)等提供科學(xué)基礎(chǔ)。

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