王曦++陳定

摘 要：miRNA的主要作用是降低靶基因的翻譯效率和/或降低mRNA的水平，而lncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與其他mRNA（如miRNA靶基因）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相同的miRNA，從而干擾miRNA對(duì)靶基因的抑制。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可同時(shí)獲得lncRNA和mRNA的表達(dá)信息，miRNA測(cè)序結(jié)合降解組測(cè)序可鑒定miRNA及其調(diào)控的靶基因。進(jìn)一步結(jié)合蛋白表達(dá)分析，鑒別miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)節(jié)層次（降解mRNA和/或阻遏翻譯），同時(shí)還可解析lncRNA在miRNA調(diào)節(jié)靶基因這個(gè)過程中的角色和功能。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)鏈非編碼RNA 競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 小RNA 高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：Q811.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2016）10（a）-0176-02

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）主要包括microRNA（miRNA，miR）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）兩大類RNA。已鑒定的ncRNA幾乎參與了基因信息傳遞的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因印跡與沉默、mRNA的穩(wěn)定和翻譯、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位等。

1 miRNA調(diào)節(jié)靶基因的機(jī)制

miRNA是長(zhǎng)短約22 nt的短鏈RNA，在進(jìn)化上具有高度保守性，主要通過與靶基因（targets）3非編碼區(qū)上的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合，能夠通過抑制靶基因miR-tgs的翻譯或降解靶基因mRNA，從而抑制靶基因的表達(dá)。然而miRNA結(jié)合在靶基因編碼區(qū)（CDS）導(dǎo)致翻譯抑制，而結(jié)合3非編碼區(qū)傾向于導(dǎo)致mRNA降解。利用核糖體譜可以度量miRNA對(duì)其靶基因翻譯的抑制效應(yīng)，同時(shí)分析其對(duì)靶基因mRNA水平的抑制/剪切效應(yīng)。擬南芥的核糖體譜分析表明，大多數(shù)miRNA靶點(diǎn)在CDS區(qū)（77%），因而miRNA靶基因的核糖體印跡少較，miRNA表現(xiàn)出翻譯抑制效應(yīng)，而且miRNA主要抑制靶基因的翻譯起始。

miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具psRNATarget結(jié)合了植物中miRNA靶識(shí)別的一些特征，可區(qū)分miRNAs對(duì)其靶基因的剪切和翻譯抑制。因而再結(jié)合降解組測(cè)序分析，可以分揀出在翻譯水平上受miRNAs抑制的其靶基因。

2 LncRNAs作為miRNA的靶模擬物調(diào)節(jié)miRNA

長(zhǎng)鏈非編碼lncRNA是一類長(zhǎng)度超過200 nt的RNA分子，它們數(shù)目眾多、表達(dá)具組織特異性、極少具有蛋白編碼潛能，卻在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平。

目前，通過分析植物的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，在擬南芥中鑒定了2 708個(gè)基因間的lncRNAs（Liu et al，2012）和70%已注釋mRNAs的反義lncRNAs（Wang et al，2014），在玉米中鑒定了1 704個(gè)高可信度lncRNAs（Li et al，2014b）和637個(gè)氮素響應(yīng)的lncRNAs（Lv et al，2016），之后在其他植物如水稻（Zhang et al，2014）、棉花（Wang et al，2015）、番茄（Zhu et al，2015）、向日葵（Flórez-Zapata et al，2016）、楊樹（Shuai et al，2014；Tian et al，2016）等植物中也鑒定了基因間、內(nèi)含子源和反義lncRNAs。目前植物非編碼數(shù)據(jù)庫(kù)GreeNC（greenc.sciencedesigners.com）收錄了37種植物共計(jì)12萬個(gè)lncRNAs（Paytuví Gallart et al，2016）。而做植物lncRNAs功能研究的也有1 187個(gè)，涵蓋43種植物（Xuan et al，2015），包括調(diào)節(jié)水稻光敏不育的LDMAR（Ding et al，2012）、調(diào)節(jié)擬南芥養(yǎng)分磷平衡的IPS1（Franco-Zorrilla et al，2007）和春化開花的COLDAIR（Heo and Sung，2011）以及側(cè)根發(fā)育的ASCO-lncRNA（Bardou et al，2014）。

競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）能與其他RNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相同的microRNA，從而調(diào)節(jié)miRNA的分布和miRNA靶基因的表達(dá)（Salmena et al，2011；夏天等，2012）。lncRNA利用其miRNA結(jié)合位點(diǎn)誘捕miRNA的方式屬于誘餌Decoy原型（Wang and Chang，2011）。部分lncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，如，肌分化長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA1（linc-MD1）能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-133和miR-135調(diào)控肌肉分化（Cesana et al，2011）。這種抑制miRNA功能的方式稱為模擬靶基因（Wu et al，2013）。

LncRNA可作為內(nèi)源靶模擬物（endogenous microRNAtarget mimic，eTM）調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)和功能。利用擬南芥和水稻的RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)檢驗(yàn)eTM是否表達(dá)，同時(shí)證實(shí)了幾個(gè)檢測(cè)到的eTM的確能夠抑制相應(yīng)的miRNA（如miR160，miR166）功能。擬南芥中低磷誘導(dǎo)的lncRNA（包括IPS1）采取模擬靶基因的方式，解除miR399對(duì)靶基因PHO2的抑制，因而調(diào)節(jié)養(yǎng)分磷的動(dòng)態(tài)平衡。關(guān)于lncRNA作為miRNA內(nèi)源靶模擬物的研究只有幾例，包括擬南芥IPS1（Franco-Zorrilla et al，2007）以及擬南芥、水稻中保守的miR160和miR166的內(nèi)源靶模擬物（Wu et al，2013），還有水稻中影響穗發(fā)育和育性的XLOC_057324（Zhang et al，2014），番茄中slylnc1077作為eTM影響sly-miR399（Wang et al，2015）。

樊春燕等（2014）整合miRNAs數(shù)據(jù)、cDNAs數(shù)據(jù)和降解組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法找到擬南芥337個(gè)成熟miRNAs在2 708個(gè)lincRNAs上的可能結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建了miRNAs-mRNAs-lincRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源（ceRNA）假說預(yù)測(cè)lincRNAs的功能。

目前miRNAs的靶標(biāo)研究主要集中于編碼蛋白的基因，而對(duì)于靶標(biāo)為非編碼RNAs的研究較少，尤其在植物中的研究更為少見，將降解組數(shù)據(jù)和miRNAs靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)合是挖掘miRNAs與mRNAs及miRNAs與lincRNAs調(diào)控關(guān)系的有效手段。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可同時(shí)獲得lncRNA和mRNA的表達(dá)信息，結(jié)合miRNA和降解組測(cè)序，在解析miRNA的靶基因的基礎(chǔ)上，還可確定miRNA的內(nèi)源靶模擬物，再結(jié)合蛋白表達(dá)分析，進(jìn)一步確定干擾miRNA抑制靶基因的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源ceLncRNA。接下來通過分析ceLncRNA的突變體和過表達(dá)水稻植株在Cd處理后miRNA/miRNA靶基因/celncRNA表達(dá)的變化，可評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源ceLncRNA對(duì)miRNA的干擾效果。這樣不僅可鑒別miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)節(jié)層次（降解mRNA/阻遏翻譯），同時(shí)還可解析lncRNA在miRNA調(diào)節(jié)靶基因這個(gè)過程中的角色和功能

長(zhǎng)非編碼lncRNAs可作為miRNA的靶模擬物調(diào)節(jié)miRNA，可是基于富集polyA尾的常規(guī)RNA測(cè)序不能得到所有的lncRNA（低豐度而且有些無polyA尾），而lncRNA全轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序可同時(shí)獲得lncRNA和mRNA的表達(dá)信息，結(jié)合miRNA和降解組測(cè)序，可以在解析miRNA靶基因的基礎(chǔ)上，確定干擾miRNA抑制靶基因的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源lncRNA。進(jìn)一步結(jié)合蛋白表達(dá)分析，鑒別miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)節(jié)層次（降解mRNA和/或阻遏翻譯），同時(shí)還可解析lncRNA在miRNA調(diào)節(jié)靶基因這個(gè)過程中的角色和功能。

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