賈紹華，丁海鑫，孫萌遙，金詩鵬

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院（藥物工程技術(shù)研究中心），黑龍江 哈爾濱 150076）

細(xì)胞自噬是程序性細(xì)胞死亡（PCD）類型之一，與細(xì)胞凋亡不同，它是哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞在自噬相關(guān)基因（ATG）的調(diào)控下，通過細(xì)胞骨架的運(yùn)輸和溶酶體內(nèi)的水解酶，降解細(xì)胞內(nèi)衰老蛋白和受損細(xì)胞器的過程，又被稱為II型程序性細(xì)胞死亡[1]。在營養(yǎng)不足、缺氧、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、代謝條件應(yīng)激等多種狀態(tài)下都可通過細(xì)胞自噬來提高細(xì)胞對生物大分子的回收能力，從而使細(xì)胞能在壓力狀態(tài)下也存活[2]。P13K/Akt/mTOR信號在腫瘤細(xì)胞中廣泛存在，在控制細(xì)胞的生長、增殖、代謝等過程中起著重要作用[3]。

苦參堿（matrine）是由豆科植物苦參的干燥根、植株等部位經(jīng)乙醇等有機(jī)溶劑提取制成的一種生物堿，具有抗菌、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)心腦血管疾病、抗腫瘤等多種藥理活性[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能有效治療肝癌[6]、胃癌[7]、前列腺癌[8]、乳腺癌[9-10]等多種癌癥，其可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。本文通過苦參堿對MCF-7細(xì)胞自噬及其P13K/Akt/mTOR信號通路的研究，從自噬的角度進(jìn)一步揭示其抗腫瘤作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ECO-170P-230培養(yǎng)箱（美國NBS公司）；CKX-41-32型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Adventurer萬分之一電子天平（美國Ohous公司）；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)有限公司）；DL-CJ-1N醫(yī)用型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；DL-CJ-1N醫(yī)用超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；Image Quant LAS 500凝膠成像系統(tǒng)（GE公司）；DYCZ-24N型垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；DYCZ-40D型電泳轉(zhuǎn)印槽（北京六一儀器廠）；硝酸纖維素（NC）膜（美國PALL公司）； DMI3000B熒光顯微鏡（德國Leica公司）；日立H8650透射電鏡（日本日立高新技術(shù)公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（美國康寧公司）。

1.2 藥品與試劑

苦參堿（含量≥98 %，批號：A0094，規(guī)格：20 mg，成都曼思特；RPMI1640溶液（大連美侖）；胎牛血清（批號：2017412，杭州四季青）；鹽酸表阿霉素（批號：17110102，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)）；溴化四氮唑藍(lán)（MTT，批號：20170512，天津阿爾法）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0006，碧云天）；特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號：MA0186，大連美侖）；兔抗β-actin多克隆抗體（批號：bs-0061R，博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號：A0208，碧云天）；兔抗LC3多克隆抗體（批號：bs-8878R，博奧森）；兔抗AKT多克隆抗體（批號：AA326，碧云天）；兔抗Phospho-AKT（Ser473）多克隆抗體（批號：AA329，碧云天）；兔抗PI3Kinase p110α/PIK3CA 多克隆抗體（批號：AF7749，碧云天）；兔抗Phospho-PI3K多克隆抗體（批號：AF5905，碧云天）；兔抗mTOR多克隆抗體（批號：AF1648，碧云天）；兔抗PhosphomTOR多克隆抗體（批號：AF5869，碧云天）；4 %多聚甲醛固定液（批號：BL539A，天津阿爾法）；自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3，批號：AD21042301，上海漢恒）；2.5 %戊二醛溶液（批號：A00151，天津阿爾法）。

1.3 細(xì)胞株

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院（藥物工程技術(shù)研究中心）提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80 %～90 %且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，用0.25 %胰蛋白酶消化并吹打成細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）法檢測苦參堿對MCF-7細(xì)胞自噬的影響

取處生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)基，再加入PBS清洗，加入胰酶進(jìn)行消化，消化完全后加入3 ml培基，用移液槍將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，分別在6孔板中每孔加入1.5 ml細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁，空白對照組加入1.5 ml 1640溶液，陽性對照組加入0.4 μg/ml鹽酸表阿霉素溶液作為陽性對照，給藥組分別加入0.4，0.8，1.2 mg/ml苦參堿溶液，給藥后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出6孔板，每孔加入10 μl自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后將6孔板取出，PBS清洗3次，每次5 min，每孔加入多聚甲醛固定20 min后，PBS清洗3次，每次5 min，再用PBS清洗，熒光顯微鏡觀察，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中注意避光。

2.3 透射電鏡（TEM）法觀察苦參堿給藥后MCF-7細(xì)胞的形態(tài)變化

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，傳代后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行給藥，空白對照組加入無血清的1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入濃度為0.4 μg/ml的鹽酸表阿霉素溶液，給藥組加入0.8 mg/ml苦參堿溶液，48 h后，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下，1500 r/min離心5 min，待細(xì)胞成為細(xì)胞團(tuán)后，加入1.5 ml戊二醛固定液，固定，低溫切片機(jī)切片，TEM下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 Western blot法檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，待觀察到細(xì)胞完全貼壁且生長密度超過80 %，傳代，將新培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h，分別加入最終濃度為0.4，0.8，1.2 mg/ml的苦參堿，陽性對照組加入終濃度為0.4 μg/ml的鹽酸表阿霉素（EPI），陰性對照組加入含10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中刮下，直至貼壁細(xì)胞面變得透明。再將懸液收集至EP管中，1500 r/min離心5 min，棄上清，每管加入PBS1 ml，吹勻，將懸液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，1500 r/min離心5 min，再次棄去上清，每管中加入蛋白質(zhì)裂解液100 μl。吹打混勻，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，加入5×蛋白稀釋液將蛋白濃度調(diào)平，每管中加入1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液配制成電泳上樣所需樣品，沸水水浴10 min，-20 ℃保存使用。選擇12 %的分離膠、10 %的濃縮膠，恒壓80 V/120 V，直至條帶跑至近下側(cè)邊緣，停止電泳。打開膠板，根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量切去多余的凝膠，將NC膜做好標(biāo)記，按黑色夾板、多孔墊片、三層濾紙、凝膠、NC膜、三層濾紙、多孔墊片、白色夾板的順序放置于電轉(zhuǎn)液中，將電轉(zhuǎn)儀置于4 ℃冰箱中，恒流200 mA，電泳1.5 h左右。將轉(zhuǎn)膜完成后的NC膜置于5 % 脫脂奶粉溶液中，室溫，封閉2 h。將封閉后的NC膜置于密封袋中，加入稀釋好的一抗，用壓膜機(jī)封口，平放在4 ℃冰箱里孵育過夜，第二天將NC膜取出，TBST清洗3次，每次15 min，然后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗3次，每次15 min。加ELC，避光，將膜平放在Image Quant LAS 500凝膠成像系統(tǒng)中，用Image pro plus 6.0測定條帶灰度值，以各組待測蛋白條帶灰度值和內(nèi)參蛋白灰度值比值計(jì)算蛋白的相對表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 苦參堿對MCF-7細(xì)胞自噬的影響

結(jié)果見圖1、圖2。由圖1可見，陽性對照組、中劑量組和高劑量組與空白對照組自噬水平差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EPI組的細(xì)胞自噬現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)了明顯的溶酶體與自噬小體融合成為自噬溶酶體的生物學(xué)過程，苦參堿各劑量組隨著給藥濃度的升高，細(xì)胞的自噬率呈明顯上升并伴隨著自噬溶酶體的出現(xiàn)，提示苦參堿能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬。

圖1 苦參堿對MCF-7細(xì)胞自噬率的影響

TEM觀察結(jié)果見圖2。由圖2可見，陰性對照組MCF-7細(xì)胞形態(tài)正常；1.0，0.4 μg/ml EPI處理MCF-7細(xì)胞48 h后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)豐富的自噬空泡，表明苦參堿可升高細(xì)胞自噬的水平。

圖2 苦參堿對MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響

3.2 苦參堿對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

不同濃度的苦參堿作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，Western Blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。與陰性對照組相比，微管相關(guān)蛋白輕鏈II/I（LC3-Ⅱ/LC3-I）的比值隨著苦參堿給藥濃度的增加而變大；Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白（Beclin-1）的表達(dá)量呈上升趨勢；磷脂酰肌醇三羥基激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）相對表達(dá)量在各組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），磷酸化磷脂酰肌醇三羥基激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表達(dá)量明顯降低，與陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明苦參堿能上調(diào)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬水平，其機(jī)制可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)。

圖3 苦參堿對MCF-7細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3-I、LC3-II、Beclin-1蛋白表達(dá)的影響

4 討論

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的基本生命進(jìn)程，近年國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞自噬活性高出正常水平數(shù)倍，并從多個(gè)方面影響惡性腫瘤的發(fā)生和預(yù)后過程[12-13]。其可分為組成型和適應(yīng)型，組成型多作用于去除受損或衰老細(xì)胞器并維持基礎(chǔ)能量代謝，而適應(yīng)型則作用于營養(yǎng)缺乏時(shí)，動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)以滿足能量需求[14]，其生理功能包括降解自身受損、變性、衰老的蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)及受損的細(xì)胞器，調(diào)節(jié)免疫功能或延長細(xì)胞壽命等。

與自噬相關(guān)的基因在進(jìn)化上都非常保守，被命名為ATG基因。到目前為止，已有40余種ATG基因，其中15個(gè)核心基因與哺乳動(dòng)物的ATG具有保守的一致性[15]。其中Beclin-1是哺乳動(dòng)物ATG6的同源基因，其與ATG14蛋白結(jié)合，參與自噬泡的形成與延伸，在調(diào)節(jié)自噬細(xì)胞雙層膜的形成中起著重要作用；在自噬啟動(dòng)過程中，ATG5-12-16復(fù)合體與ATG8（LC3）-I結(jié)合到自噬體內(nèi)膜與自噬體外膜上，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II，以脂質(zhì)的形態(tài)存在。自噬小體形成后，除了部分LC3-II仍與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合外，其他主要ATG蛋白都重新進(jìn)入細(xì)胞漿， LC3-II則全部留在成熟的自噬小體上，在自噬小體與溶酶體徹底融合為自噬溶酶體后降解，這種特征一般可用于監(jiān)測自噬過程[16]，故Beclin-1和LC3都被廣泛認(rèn)同為自噬的相關(guān)標(biāo)志性蛋白。本研究中，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志性蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1的表達(dá)量均呈上升趨勢，表明給藥后MCF-7細(xì)胞內(nèi)有自噬現(xiàn)象的發(fā)生；與此同時(shí)mRFP-GFP-LC3法和TEM法觀察發(fā)現(xiàn)了明顯的溶酶體與自噬小體融合為自噬溶酶體及豐富的自噬空泡的生物學(xué)過程，這些結(jié)果都強(qiáng)有力地證明了苦參堿可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中自噬現(xiàn)象的發(fā)生。另外Western-blot法檢測到MCF-7細(xì)胞內(nèi)p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量均呈下降趨勢，進(jìn)一步揭示了苦參堿可能通過降低PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的磷酸化使MCF-7細(xì)胞自噬水平上升。

總之，細(xì)胞自噬在健康細(xì)胞中發(fā)揮著維持穩(wěn)態(tài)功能的重要作用[17]，且其在體內(nèi)也有預(yù)防癌癥發(fā)展的作用。有研究發(fā)現(xiàn)自噬的存在也降低了DNA的損傷和腫瘤形成的可能性[18]。與此相一致的是，自噬基因敲除的小鼠體內(nèi)胰腺癌病變的發(fā)生率上升[19-20]。盡管如此，自噬也可能在某些疾病中適應(yīng)良好[21]，如腫瘤細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下可通過自噬激活來維持生存，使其在營養(yǎng)枯竭的微環(huán)境中得以生存和增殖[22]，因此細(xì)胞自噬對于腫瘤細(xì)胞究竟是利還是弊，以及其與細(xì)胞凋亡究竟存在何種聯(lián)系，仍需進(jìn)一步研究。