潘叢彬,王思琪,趙寶清,堯 青,郭西英,歐陽昌漢,任展宏**,劉 超**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室)

目前,細(xì)胞免疫熒光染色是鑒別心肌細(xì)胞類型的常用方法[1-2],然而,此方法對抗體的要求較高,并且具有操作復(fù)雜和用時長等較多缺點。因此,摸索出一種簡單、快速及有效的區(qū)分和鑒別心肌細(xì)胞的方法對于心血管疾病研究極為重要。心肌細(xì)胞有一個規(guī)律排列的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò),以執(zhí)行心臟收縮功能。這些執(zhí)行收縮功能的肌原纖維和閏盤都是多蛋白復(fù)合物,必須在發(fā)育過程中以有規(guī)律的方式組裝,以保證心臟的功能完整性[3]。而心肌成纖維細(xì)胞位于結(jié)締組織網(wǎng)絡(luò)中,呈細(xì)長狀,可分泌包括多種膠原在內(nèi)的大量細(xì)胞外基質(zhì)成分[4]。我們通過使用熒光標(biāo)記染料Phalloidin(鬼筆環(huán)肽)與Tubulin Tracker分別標(biāo)記微絲和微管,首次發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞能被標(biāo)記,而心肌成纖維細(xì)胞不能被標(biāo)記。基于此,我們?yōu)殍b定心肌細(xì)胞純度提供了一種新的方法,可以簡便及快速區(qū)分心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞,并為心血管疾病研究提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細(xì)胞

Sprague-Dawley(SD)大鼠(出生1～3d,SPF級),雌雄不限,由湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院SPF級動物實驗室提供。H9c2與MCFs細(xì)胞系購于北納生物。

1.2 試劑耗材

試劑耗材見表1。

表1 主要試劑與耗材

1.3 主要儀器設(shè)備

FV3000激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(OLYMPUS),CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher),倒置顯微鏡(Nikon)。

1.4 方法

1.4.1 與原代細(xì)胞的分離和細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)參考實驗室指南[2],有細(xì)微修改,具體操作如下:乳鼠全身75%乙醇消毒,開胸取出心臟,置于4℃預(yù)冷的PBS中清洗殘余血液。將心臟轉(zhuǎn)移至含有冷的PBS無菌安瓿瓶中,取心尖部位并剪碎成約1mm3的碎片。棄去PBS,加入約10倍體積的0.1%Ⅱ型膠原酶消化液,輕柔吹打后靜置,待組織塊自然沉降后,棄去上清液。重復(fù)上述消化過程,每次消化后的上清液收集于37℃等體積的含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,終止膠原酶消化到組織消化完全。將收集到的細(xì)胞懸液在室溫條件下以1000rpm,5min離心,棄去上清液。加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,用40μm細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁90min。收集上層未貼壁的原代大鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat primary cardiomyocytes,NRCM)于50mL無菌離心管中,加入終濃度為0.1mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶,并接種于28.2mm玻底培養(yǎng)皿中,37℃,5% CO2培養(yǎng)48h。更換含0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h后用于后續(xù)實驗。差速貼壁后,貼壁的細(xì)胞主要是原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞(neonatal rat cardiac fibroblasts,NRCF),向NRCF中加入適量完全培養(yǎng)基,將這兩種細(xì)胞放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,48h更換一次培養(yǎng)基。待NRCF培養(yǎng)至約90%融合度時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代(1∶2)進(jìn)一步純化。將第二代NRCF接種于28.2mm玻底培養(yǎng)皿中用于后續(xù)實驗。H9c2細(xì)胞系(北納生物,BNCC340098)在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Mouse cardiac fibroblasts細(xì)胞系(MCFs,北納生物,BNCC340098)在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞存活率鑒定

取0.2mL第二次差速貼壁的心肌細(xì)胞懸液,加入0.5mL 0.4%臺盼藍(lán)染色液和0.3mL PBS,混勻后靜置5min。取適量混合液與細(xì)胞計數(shù)板,顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。死細(xì)胞為藍(lán)色,活細(xì)胞透明。細(xì)胞成活率(%)=(總細(xì)胞數(shù)-藍(lán)色死細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.3 免疫熒光染色

棄去玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基,PBS洗滌2次。用4%多聚甲醛室溫固定15min,PBS洗滌3次。加入0.1% Triton X-100室溫穿透20min,PBS洗滌1次。10%BSA室溫封閉1h,PBS洗滌3次,每次5min。滴加適宜稀釋比的一抗室溫孵育1h,PBS洗滌3次,每次5min。滴加適宜稀釋比的帶熒光基團(tuán)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG避光室溫孵育1h,PBS洗滌3次,每次5min(若一抗帶有熒光基團(tuán)偶聯(lián),此步可省略)。滴加適量體積ProlongTMGold antifade reagent with DAPI封片,共聚焦熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.4.4 Phalloidin固定染色

棄去玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基,PBS洗滌2次。用4%多聚甲醛室溫固定15min,PBS洗滌3次。加入0.1% TritonX-100室溫穿透20min,PBS洗滌1次。滴加適量體積100nM Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin室溫染色30min,PBS洗滌3次,滴加適量體積ProlongTMGold antifade reagent with DAPI封片,共聚焦熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.4.5 Tubulin Tracker 活細(xì)胞染色

棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌2次。加入適量體積的10μg/mL的Hoechst 33342染色液,37℃,5%CO2孵育20min,棄去染色液,用PBS洗滌3次。加入適量體積1×Tubulin TrackerTMDeep Red(用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制),37℃ 5% CO2孵育30min,棄去染色液,用含1%丙磺舒的PBS洗滌3次。共聚焦熒光顯微鏡觀察和拍照。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞存活率鑒定和形態(tài)觀察

臺盼藍(lán)染色法鑒定NRCM存活率達(dá)85%以上。NRCM分離培養(yǎng)72h,通過顯微鏡觀察到心肌細(xì)胞相互連接形成片狀或細(xì)胞簇,且有搏動(圖1A)。NRCF分離培養(yǎng)48h后,通過顯微鏡觀察到細(xì)胞伸展呈細(xì)長梭形且排列緊密,偶見混有少量心肌細(xì)胞形成的可搏動細(xì)胞簇(圖1B),傳代后簇狀細(xì)胞團(tuán)消失(圖1C)。

A:培養(yǎng)72h的原代大鼠心肌細(xì)胞,可見搏動細(xì)胞簇(箭頭所指);B: 培養(yǎng)48h的NRCF;C:第二次傳代后的NRCM圖1 NRCM與NRCF的形態(tài)圖(比例尺=100 μm)

2.2 傳統(tǒng)免疫染色法鑒定NRCM與NRCF

為了鑒定所提的原代心肌細(xì)胞類型,我們采用傳統(tǒng)的免疫熒光染色法進(jìn)行鑒定,即用與中間絲起反應(yīng)的抗波形蛋白(Vimentin)抗體特異性標(biāo)記NRCF和抗α-actinin抗體標(biāo)記NRCM。結(jié)果表明,NRCM能夠被抗α-actinin抗體所標(biāo)記,而不能被抗Vimentin抗體所標(biāo)記。NRCF可以被抗Vimentin抗體所標(biāo)記,而不能被抗α-actinin抗體所標(biāo)記(圖2)。此實驗結(jié)果顯示本研究中所提純的NRCM與NRCF純度較高。

藍(lán)色為細(xì)胞核,紅色為α- actitinin,綠色為Vimentin圖2 免疫熒光染色NRCM和NRCF的鑒定(比例尺= 20 μm)

2.3 Phalloidin固定染色鑒定NRCM與NRCF

我們使用微絲的特異性標(biāo)記物Phalloidin對NRCM與NRCF進(jìn)行染色標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在NRCM中存在微絲骨架網(wǎng)絡(luò),微絲排列整齊且分布均勻,而NRCF未能被Phalloidin染色標(biāo)記(圖3)。此實驗結(jié)果直觀揭示了NRCM和NRCF的微絲骨架差異。

藍(lán)色為細(xì)胞核,紅色為α- actitinin (NRCM) 或Vimentin (NRCF) 特異性染色,綠色為微絲圖3 phalloidin固定染色鑒定NRCM和NRCF(比例尺= 20 μm)

2.4 Tubulin Tracker染色鑒定NRCM與NRCF

我們使用微管的特異性標(biāo)記物Tubulin Tracker對NRCM與NRCF進(jìn)行染色標(biāo)記。結(jié)果顯示,NRCM內(nèi)存在微管骨架網(wǎng)絡(luò),而NRCF未能被Tubulin Tracker標(biāo)記(圖4)。微管染色的結(jié)果與微絲類似,進(jìn)一步證實基于細(xì)胞骨架差異的染色方法可用于鑒定NRCM與NRCF。

藍(lán)色為細(xì)胞核,紅色為微管圖4 Tubulin Tracker染色鑒定NRCM和NRCF(比例尺= 20 μm)

2.5 Phalloidin固定染色鑒定H9c2和MCFs細(xì)胞系

為了驗證此方法是否適用于心肌細(xì)胞系的鑒定,我們使用Phalloidin對H9c2和MCFs進(jìn)行染色標(biāo)記。實驗結(jié)果顯示,H9c2可被Phalloidin染色標(biāo)記,細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)清晰可見的微絲骨架網(wǎng)絡(luò),MCFs無法被Phalloidin染色(圖5)。本實驗結(jié)果表明基于微絲骨架差異的鑒定方法也適用于MCFs與H9c2的鑒定。

藍(lán)色為細(xì)胞核,紅色為α- actitinin (H9c2) 或Vimentin (MCFs),綠色為微絲圖5 Phalloidin固定染色鑒定H9c2和MCFs(比例尺= 20 μm)

2.6 Tubulin Tracker染色鑒定H9c2和MCFs細(xì)胞系

我們使用Tubulin Tracker對H9c2細(xì)胞系和MCFs細(xì)胞系進(jìn)行標(biāo)記,結(jié)果顯示,H9c2細(xì)胞系能被Tubulin Tracker標(biāo)記,呈現(xiàn)出清晰可見的微管骨架網(wǎng)絡(luò),而MCFs細(xì)胞系被Tubulin Tracker標(biāo)記的微管骨架較少且暗淡,絕大多數(shù)細(xì)胞未觀察到微管骨架網(wǎng)絡(luò)(圖6)。本實驗結(jié)果進(jìn)一步證實,通過觀察微管骨架的差異可應(yīng)用于H9c2與MCFs的鑒定。

藍(lán)色為細(xì)胞核,紅色為微管圖6 Tubulin Tracker染色鑒定H9c2和MCFs(比例尺= 20 μm)

2.7 三種鑒定方法的比較

免疫熒光染色法操作過程需6步,耗時245.5min,Phalloidin固定染色法操作過程需4步,耗時65.5min,Tubulin Tracker染色法操作過程需2步,耗時50min。Phalloidin標(biāo)記微絲或Tubulin Tracker標(biāo)記微管的實驗方法具有實驗步驟簡便及耗時較短等優(yōu)點 (見表2)。

表2 三種鑒定方法的比較

3 討 論

自1963年Harary和Farley等人在體外首次成功分離和培養(yǎng)心肌細(xì)胞之后,心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)得到不斷發(fā)展與完善[1,5-7]。因為心肌細(xì)胞培養(yǎng)具有可視化、精確靶向、簡單、經(jīng)濟(jì)、自發(fā)搏動性、不受神經(jīng)和體液因素影響等優(yōu)點[6],所以,體外分離和培養(yǎng)的心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞在心血管疾病的研究中被廣泛應(yīng)用[8-9]。由于心臟主要是由心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞組成[10],因此,在分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞的過程中常常會出現(xiàn)成纖維細(xì)胞的污染,最終影響實驗結(jié)果的可信度。有研究表明[1,6],在提取原代心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的過程中,通過梯度濃度的percoll液離心,以及添加5-溴脫氧尿嘧啶有利于提高心肌細(xì)胞的純度,而針對心肌成纖維細(xì)胞可通過傳代進(jìn)行純化[2]。

近年來,體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞已成為心血管疾病研究過程中至關(guān)重要的一環(huán)[8-9]。在細(xì)胞的分離提純過程中,常常出現(xiàn)這兩種細(xì)胞的交叉污染,因此,需要對細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定。傳統(tǒng)的心肌細(xì)胞鑒定方法主要針對心肌細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,進(jìn)而達(dá)到鑒定效果。但是,傳統(tǒng)鑒定方法存在操作過程繁鎖以及用時較長等缺點。

在本項研究中,我們采用Phalloidin固定染色和Tubulin Tracker活細(xì)胞染色分別對心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞的微絲和微管進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞既能被Phalloidin標(biāo)記,也能被Tubulin Tracker標(biāo)記;相比較之下,心肌成纖維細(xì)胞既不能被Phalloidin標(biāo)記,也不能被Tubulin Tracker標(biāo)記。這可能是由于兩種行使不同功能的細(xì)胞存在細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的差異。基于此,我們首次提出并確定鬼筆環(huán)肽固定染色法和Tubulin Tracker活細(xì)胞染色作為心肌細(xì)胞鑒定的方法。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色法比較,新鑒定方法具有實驗步驟簡便及耗時較短等優(yōu)點,大幅度節(jié)約實驗時間以及提高工作效率。另外,Tubulin Tracker可滿足活細(xì)胞的實驗需求,使用Phalloidin標(biāo)記微絲或Tubulin Tracker標(biāo)記微管的實驗方法可快速鑒定和區(qū)分心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞,將有助于心血管疾病的細(xì)胞學(xué)研究。