潘叢彬,王思琪,趙寶清,堯 青,郭西英,歐陽昌漢,任展宏**,劉 超**

(1.湖北科技學院醫(yī)學部藥學院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室)

目前,細胞免疫熒光染色是鑒別心肌細胞類型的常用方法[1-2],然而,此方法對抗體的要求較高,并且具有操作復雜和用時長等較多缺點。因此,摸索出一種簡單、快速及有效的區(qū)分和鑒別心肌細胞的方法對于心血管疾病研究極為重要。心肌細胞有一個規(guī)律排列的細胞骨架網(wǎng)絡,以執(zhí)行心臟收縮功能。這些執(zhí)行收縮功能的肌原纖維和閏盤都是多蛋白復合物,必須在發(fā)育過程中以有規(guī)律的方式組裝,以保證心臟的功能完整性[3]。而心肌成纖維細胞位于結締組織網(wǎng)絡中,呈細長狀,可分泌包括多種膠原在內的大量細胞外基質成分[4]。我們通過使用熒光標記染料Phalloidin(鬼筆環(huán)肽)與Tubulin Tracker分別標記微絲和微管,首次發(fā)現(xiàn)心肌細胞能被標記,而心肌成纖維細胞不能被標記?；诖?我們?yōu)殍b定心肌細胞純度提供了一種新的方法,可以簡便及快速區(qū)分心肌細胞與成纖維細胞,并為心血管疾病研究提供了細胞學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

Sprague-Dawley(SD)大鼠(出生1～3d,SPF級),雌雄不限,由湖北科技學院醫(yī)藥研究院SPF級動物實驗室提供。H9c2與MCFs細胞系購于北納生物。

1.2 試劑耗材

試劑耗材見表1。

表1 主要試劑與耗材

1.3 主要儀器設備

FV3000激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(OLYMPUS),CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher),倒置顯微鏡(Nikon)。

1.4 方法

1.4.1 與原代細胞的分離和細胞培養(yǎng)

原代細胞的分離培養(yǎng)參考實驗室指南[2],有細微修改,具體操作如下:乳鼠全身75%乙醇消毒,開胸取出心臟,置于4℃預冷的PBS中清洗殘余血液。將心臟轉移至含有冷的PBS無菌安瓿瓶中,取心尖部位并剪碎成約1mm3的碎片。棄去PBS,加入約10倍體積的0.1%Ⅱ型膠原酶消化液,輕柔吹打后靜置,待組織塊自然沉降后,棄去上清液。重復上述消化過程,每次消化后的上清液收集于37℃等體積的含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,終止膠原酶消化到組織消化完全。將收集到的細胞懸液在室溫條件下以1000rpm,5min離心,棄去上清液。加入完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,用40μm細胞過濾網(wǎng)過濾細胞懸液。將細胞接種于100mm培養(yǎng)皿中進行差速貼壁90min。收集上層未貼壁的原代大鼠心肌細胞(neonatal rat primary cardiomyocytes,NRCM)于50mL無菌離心管中,加入終濃度為0.1mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶,并接種于28.2mm玻底培養(yǎng)皿中,37℃,5% CO2培養(yǎng)48h。更換含0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h后用于后續(xù)實驗。差速貼壁后,貼壁的細胞主要是原代大鼠心肌成纖維細胞(neonatal rat cardiac fibroblasts,NRCF),向NRCF中加入適量完全培養(yǎng)基,將這兩種細胞放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,48h更換一次培養(yǎng)基。待NRCF培養(yǎng)至約90%融合度時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代(1∶2)進一步純化。將第二代NRCF接種于28.2mm玻底培養(yǎng)皿中用于后續(xù)實驗。H9c2細胞系(北納生物,BNCC340098)在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Mouse cardiac fibroblasts細胞系(MCFs,北納生物,BNCC340098)在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4.2 細胞存活率鑒定

取0.2mL第二次差速貼壁的心肌細胞懸液,加入0.5mL 0.4%臺盼藍染色液和0.3mL PBS,混勻后靜置5min。取適量混合液與細胞計數(shù)板,顯微鏡下計數(shù)活細胞數(shù)。死細胞為藍色,活細胞透明。細胞成活率(%)=(總細胞數(shù)-藍色死細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%。

1.4.3 免疫熒光染色

棄去玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基,PBS洗滌2次。用4%多聚甲醛室溫固定15min,PBS洗滌3次。加入0.1% Triton X-100室溫穿透20min,PBS洗滌1次。10%BSA室溫封閉1h,PBS洗滌3次,每次5min。滴加適宜稀釋比的一抗室溫孵育1h,PBS洗滌3次,每次5min。滴加適宜稀釋比的帶熒光基團偶聯(lián)的山羊抗兔IgG避光室溫孵育1h,PBS洗滌3次,每次5min(若一抗帶有熒光基團偶聯(lián),此步可省略)。滴加適量體積ProlongTMGold antifade reagent with DAPI封片,共聚焦熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.4.4 Phalloidin固定染色

棄去玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基,PBS洗滌2次。用4%多聚甲醛室溫固定15min,PBS洗滌3次。加入0.1% TritonX-100室溫穿透20min,PBS洗滌1次。滴加適量體積100nM Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin室溫染色30min,PBS洗滌3次,滴加適量體積ProlongTMGold antifade reagent with DAPI封片,共聚焦熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.4.5 Tubulin Tracker 活細胞染色

棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌2次。加入適量體積的10μg/mL的Hoechst 33342染色液,37℃,5%CO2孵育20min,棄去染色液,用PBS洗滌3次。加入適量體積1×Tubulin TrackerTMDeep Red(用基礎培養(yǎng)基配制),37℃ 5% CO2孵育30min,棄去染色液,用含1%丙磺舒的PBS洗滌3次。共聚焦熒光顯微鏡觀察和拍照。

2 結 果

2.1 細胞存活率鑒定和形態(tài)觀察

臺盼藍染色法鑒定NRCM存活率達85%以上。NRCM分離培養(yǎng)72h,通過顯微鏡觀察到心肌細胞相互連接形成片狀或細胞簇,且有搏動(圖1A)。NRCF分離培養(yǎng)48h后,通過顯微鏡觀察到細胞伸展呈細長梭形且排列緊密,偶見混有少量心肌細胞形成的可搏動細胞簇(圖1B),傳代后簇狀細胞團消失(圖1C)。

A:培養(yǎng)72h的原代大鼠心肌細胞,可見搏動細胞簇(箭頭所指);B: 培養(yǎng)48h的NRCF;C:第二次傳代后的NRCM圖1 NRCM與NRCF的形態(tài)圖(比例尺=100 μm)

2.2 傳統(tǒng)免疫染色法鑒定NRCM與NRCF

為了鑒定所提的原代心肌細胞類型,我們采用傳統(tǒng)的免疫熒光染色法進行鑒定,即用與中間絲起反應的抗波形蛋白(Vimentin)抗體特異性標記NRCF和抗α-actinin抗體標記NRCM。結果表明,NRCM能夠被抗α-actinin抗體所標記,而不能被抗Vimentin抗體所標記。NRCF可以被抗Vimentin抗體所標記,而不能被抗α-actinin抗體所標記(圖2)。此實驗結果顯示本研究中所提純的NRCM與NRCF純度較高。

藍色為細胞核,紅色為α- actitinin,綠色為Vimentin圖2 免疫熒光染色NRCM和NRCF的鑒定(比例尺= 20 μm)

2.3 Phalloidin固定染色鑒定NRCM與NRCF

我們使用微絲的特異性標記物Phalloidin對NRCM與NRCF進行染色標記。結果發(fā)現(xiàn),在NRCM中存在微絲骨架網(wǎng)絡,微絲排列整齊且分布均勻,而NRCF未能被Phalloidin染色標記(圖3)。此實驗結果直觀揭示了NRCM和NRCF的微絲骨架差異。

藍色為細胞核,紅色為α- actitinin (NRCM) 或Vimentin (NRCF) 特異性染色,綠色為微絲圖3 phalloidin固定染色鑒定NRCM和NRCF(比例尺= 20 μm)

2.4 Tubulin Tracker染色鑒定NRCM與NRCF

我們使用微管的特異性標記物Tubulin Tracker對NRCM與NRCF進行染色標記。結果顯示,NRCM內存在微管骨架網(wǎng)絡,而NRCF未能被Tubulin Tracker標記(圖4)。微管染色的結果與微絲類似,進一步證實基于細胞骨架差異的染色方法可用于鑒定NRCM與NRCF。

藍色為細胞核,紅色為微管圖4 Tubulin Tracker染色鑒定NRCM和NRCF(比例尺= 20 μm)

2.5 Phalloidin固定染色鑒定H9c2和MCFs細胞系

為了驗證此方法是否適用于心肌細胞系的鑒定,我們使用Phalloidin對H9c2和MCFs進行染色標記。實驗結果顯示,H9c2可被Phalloidin染色標記,細胞內呈現(xiàn)清晰可見的微絲骨架網(wǎng)絡,MCFs無法被Phalloidin染色(圖5)。本實驗結果表明基于微絲骨架差異的鑒定方法也適用于MCFs與H9c2的鑒定。

藍色為細胞核,紅色為α- actitinin (H9c2) 或Vimentin (MCFs),綠色為微絲圖5 Phalloidin固定染色鑒定H9c2和MCFs(比例尺= 20 μm)

2.6 Tubulin Tracker染色鑒定H9c2和MCFs細胞系

我們使用Tubulin Tracker對H9c2細胞系和MCFs細胞系進行標記,結果顯示,H9c2細胞系能被Tubulin Tracker標記,呈現(xiàn)出清晰可見的微管骨架網(wǎng)絡,而MCFs細胞系被Tubulin Tracker標記的微管骨架較少且暗淡,絕大多數(shù)細胞未觀察到微管骨架網(wǎng)絡(圖6)。本實驗結果進一步證實,通過觀察微管骨架的差異可應用于H9c2與MCFs的鑒定。

藍色為細胞核,紅色為微管圖6 Tubulin Tracker染色鑒定H9c2和MCFs(比例尺= 20 μm)

2.7 三種鑒定方法的比較

免疫熒光染色法操作過程需6步,耗時245.5min,Phalloidin固定染色法操作過程需4步,耗時65.5min,Tubulin Tracker染色法操作過程需2步,耗時50min。Phalloidin標記微絲或Tubulin Tracker標記微管的實驗方法具有實驗步驟簡便及耗時較短等優(yōu)點 (見表2)。

表2 三種鑒定方法的比較

3 討 論

自1963年Harary和Farley等人在體外首次成功分離和培養(yǎng)心肌細胞之后,心肌細胞分離培養(yǎng)技術得到不斷發(fā)展與完善[1,5-7]。因為心肌細胞培養(yǎng)具有可視化、精確靶向、簡單、經濟、自發(fā)搏動性、不受神經和體液因素影響等優(yōu)點[6],所以,體外分離和培養(yǎng)的心肌細胞與心肌成纖維細胞在心血管疾病的研究中被廣泛應用[8-9]。由于心臟主要是由心肌細胞與成纖維細胞組成[10],因此,在分離培養(yǎng)心肌細胞的過程中常常會出現(xiàn)成纖維細胞的污染,最終影響實驗結果的可信度。有研究表明[1,6],在提取原代心肌細胞和心肌成纖維細胞的過程中,通過梯度濃度的percoll液離心,以及添加5-溴脫氧尿嘧啶有利于提高心肌細胞的純度,而針對心肌成纖維細胞可通過傳代進行純化[2]。

近年來,體外培養(yǎng)心肌細胞和心肌成纖維細胞已成為心血管疾病研究過程中至關重要的一環(huán)[8-9]。在細胞的分離提純過程中,常常出現(xiàn)這兩種細胞的交叉污染,因此,需要對細胞進行純度鑒定。傳統(tǒng)的心肌細胞鑒定方法主要針對心肌細胞內特異性蛋白進行免疫熒光標記,進而達到鑒定效果。但是,傳統(tǒng)鑒定方法存在操作過程繁鎖以及用時較長等缺點。

在本項研究中,我們采用Phalloidin固定染色和Tubulin Tracker活細胞染色分別對心肌細胞與心肌成纖維細胞的微絲和微管進行標記。結果發(fā)現(xiàn)心肌細胞既能被Phalloidin標記,也能被Tubulin Tracker標記;相比較之下,心肌成纖維細胞既不能被Phalloidin標記,也不能被Tubulin Tracker標記。這可能是由于兩種行使不同功能的細胞存在細胞骨架結構的差異。基于此,我們首次提出并確定鬼筆環(huán)肽固定染色法和Tubulin Tracker活細胞染色作為心肌細胞鑒定的方法。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色法比較,新鑒定方法具有實驗步驟簡便及耗時較短等優(yōu)點,大幅度節(jié)約實驗時間以及提高工作效率。另外,Tubulin Tracker可滿足活細胞的實驗需求,使用Phalloidin標記微絲或Tubulin Tracker標記微管的實驗方法可快速鑒定和區(qū)分心肌細胞與心肌成纖維細胞,將有助于心血管疾病的細胞學研究。