黃 婷,閔 清,2*

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.鄂南特色中藥湖北省工程研究中心)

肝臟是機體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化最主要的器官,參與人體的各項生命活動及物質(zhì)、能量代謝,持續(xù)性的肝損傷會導(dǎo)致肝纖維化及肝硬化,使肝功能衰竭,甚至可能發(fā)展為肝癌。隨著人們生活方式的改變,長期飲酒、熬夜、過勞等不良習(xí)慣使得患有肝臟損傷的人群比例不斷提高,肝損傷成了當(dāng)前肝臟疾病研究的熱點問題之一[1]。動物模型的建立是疾病研究與藥物研發(fā)過程中的重要環(huán)節(jié),建立與臨床肝損傷相似病理機制的實驗性動物模型,有利于進(jìn)一步的深入研究免疫性肝損傷的發(fā)病機制,篩選保肝的臨床藥物,探索有效治療手段。本文介紹了免疫性肝損傷的特點及機制,闡述免疫性肝損傷的造模方法及機制,旨在更深入了解免疫性肝損傷模型的研究進(jìn)展,為免疫性肝損傷的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 免疫性肝損傷

免疫性肝損傷(immune liver injury,ILI)是一種進(jìn)行性的、慢性炎癥性肝病,與界面性肝炎、血漿肝酶升高、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、自身抗體的存在和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)功能障礙有關(guān)[2]。ILI波及各個年齡階段與種族,常見于中老年女性[3]。由于其呈現(xiàn)的炎癥以多個效應(yīng)免疫細(xì)胞的環(huán)境動態(tài)變化為特征,所以病程表現(xiàn)有急有緩,最終發(fā)展為肝纖維化與肝硬化。

ILI是一種復(fù)雜的多因素、多基因疾病,由遺傳易感的觸發(fā)因素和環(huán)境之間互相作用引起。其免疫發(fā)病機制依賴于自身反應(yīng)性的CD4+和CD8+T細(xì)胞,在環(huán)境的刺激下,自身肝臟抗原的耐受性喪失[4],誘發(fā)ILI。ILI又可以根據(jù)其血清特征分為兩種亞型:1型(AIH-1)以抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(SMA)、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體核周型(p-ANCA)為特征;2型(AIH-2)以抗肝腎微粒體抗體1型(anti-LKM1)、抗肝細(xì)胞質(zhì)抗體1型(anti-LC1)為特征[5]。AIH的診斷在臨床上無明確標(biāo)準(zhǔn),一般以肝臟活檢發(fā)生組織學(xué)異常、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)升高為依據(jù)。在治療上,采用類固醇等免疫療法緩解癥狀,控制生化指標(biāo),阻止疾病的繼續(xù)發(fā)展。

2 ILI動物模型的建立

2.1 刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)

Con A是一種從矮刀豆中提取出來的凝集素,被廣泛應(yīng)用于建立免疫介導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中。采用Con A建立ILI動物模型的方法簡單、方便,重復(fù)性好,且建立的動物模型在組織學(xué)特征與血清特征上與人類ILI患者具有很高的相似性[6]。

Con A誘導(dǎo)ILI的機制與T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[6],Con A的誘導(dǎo)可以激活Kuffer細(xì)胞(KC)分泌大量的IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-2等炎性細(xì)胞因子,激活CD4+T淋巴細(xì)胞(Th)。同時,還與其他多種免疫細(xì)胞、肝非核細(xì)胞與肝細(xì)胞損傷的發(fā)展有關(guān),包括CD8+T淋巴細(xì)胞(CTL)[7]、自然殺傷T淋巴細(xì)胞(NKT)[8]、中性粒細(xì)胞[9]和竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)[10]。Con A不僅能夠附著在KC上表達(dá)主要組織相容性Ⅱ類復(fù)合物(MHC),還可以與SEC、KC、中性粒細(xì)胞表面的甘露糖受體(MRs)相結(jié)合[11]。Con A通過MRs激活巨噬細(xì)胞,增加超氧陰離子的釋放,誘導(dǎo)細(xì)胞因子的合成,這些細(xì)胞因子以直接或間接的方式參與肝臟損傷。

在建立Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中,一次性尾靜脈注射Con A 1.5～40mg/只,在8h內(nèi)就可以觀察到血清肝功能指標(biāo)AST、ALT、細(xì)胞因子水平及組織學(xué)上會出現(xiàn)不同程度的特異性肝損傷,而且呈劑量依賴性,當(dāng)劑量大于50mg/kg時,會使實驗小鼠發(fā)生死亡,腹腔注射無法建立肝損傷模型[12]。

2.2 脂多糖(LPS)

脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)又名內(nèi)毒素,是大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的磷脂成分,同時也是免疫系統(tǒng)中最有效的誘導(dǎo)劑之一。完整的LPS分子由O-特異性側(cè)鏈(O-specificside chain)、核心多糖(core polysaccharide)、脂質(zhì)A(lipid A)三部分組成,其中脂質(zhì)A是LPS中刺激免疫系統(tǒng)最核心的部分[13]。當(dāng)LPS進(jìn)入血液時可能誘發(fā)內(nèi)毒素血癥[14],造成多器官功能衰竭;LPS刺激免疫系統(tǒng)時造成免疫失調(diào),產(chǎn)生炎癥損傷的同時,還會誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)退行性疾病[15]、代謝性疾病[16]和心血管疾病[17]等慢性、進(jìn)行性疾病。

LPS主要通過Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)依賴性和非TLR4依賴性兩種途徑誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。在TLR4依賴途徑中,LPS先與脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)結(jié)合后再與CD14受體結(jié)合,轉(zhuǎn)移到TLR4-MD2復(fù)合物上后被識別,隨后TLR4-MD2復(fù)合物二聚化引起MYDD88、NF-κB、TRIF等信號表達(dá),刺激白細(xì)胞釋放IL-1β、TNF-α、IL-6等[18]。除激活白細(xì)胞釋放各種炎癥介質(zhì)外,LPS還參與免疫反應(yīng)的其他方面,例如促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟和遷移,將自然免疫與適應(yīng)性免疫相結(jié)合[19],并通過p38 MAPK依賴性TLR4信號傳導(dǎo)在巨噬細(xì)胞中促進(jìn)自噬[20]。LPS通過TLR4介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NADPH氧化酶激活[21],導(dǎo)致活性氧(ROS)和氮(如NO)的產(chǎn)生,誘導(dǎo)炎癥損傷的發(fā)生。

利用LPS建立自身免疫性肝損傷動物模型時,可以單獨注射LPS或與卡介苗(bacillus calmette,BCG)、D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal N)、死亡菌體聯(lián)合。

2.2.1 單獨使用LPS

單獨使用LPS建立免疫性肝損傷模型時可以采用腹腔注射與尾靜脈注射兩種方式。腹腔注射時一般采用一次性大劑量注射的方式,給予4～10mg/kg LPS在24h后可以觀察到組織學(xué)及組織中炎癥因子的變化[22]。腹腔注射的方法簡單方便,但死亡率高,一般作為急性肝損傷模型的建立方式。間斷小劑量尾靜脈注射的方式死亡率低,連續(xù)給予尾靜脈注射0.2mg/kg LPS,4周即可建立慢性損傷模型[23]。

2.2.2 BCG+LPS

卡介苗(BCG)具有免疫調(diào)節(jié)作用,感染小鼠后能夠激活肝臟中的T淋巴細(xì)胞。BCG進(jìn)入血液后會引起大量致敏KC及巨噬細(xì)胞聚集到肝臟,同時抗原被提呈給特異性T淋巴細(xì)胞,肉芽腫形成,肝實質(zhì)被破壞,再次注射小劑量的LPS時,LPS會進(jìn)一步刺激巨噬細(xì)胞和KC,引起大量的ROS,細(xì)胞毒性因子NO,炎性因子TNF-α、IL-1β釋放,肝細(xì)胞受到急性損傷[23]。

BCG+LPS誘導(dǎo)肝損傷模型需要先尾靜脈注射2.5mg BCG,約含5.0×107活菌,11或12d后尾靜脈注射LPS 80μg,8～12h后可見血清ALT、AST和白介素等炎癥因子水平上升,組織觀察肝臟炎性浸潤[24]。模型中的病理過程類似于人類肝中KC等非特異性免疫細(xì)胞浸潤,釋放炎癥因子損肝臟的過程,更加適用于人類免疫性肝損傷的研究。

2.2.3 D-Gal N+LPS

D-Gal N又稱半乳糖胺或軟骨糖胺,廣泛存在于糖、糖蛋白和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)中。D-Gal N對細(xì)胞有毒性作用,主要通過奪獲尿苷三磷酸(UTP)、抑制蛋白質(zhì)的合成損傷肝細(xì)胞。與LPS合用時,D-Gal N可以提高小鼠對LPS的敏感性,從而降低脂多糖的使用量,誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡損傷,而不產(chǎn)生全身性的炎癥。建立D-Gal N+LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型時,采用腹腔注射的方法,注射LPS 0.4～50mg/kg、D-Gal N 400～800mg/kg,6h后可以觀察到肝損傷有關(guān)指標(biāo)的變化[25]。

2.2.4 死亡菌體聯(lián)合LPS

Ferluga和Allison在1978年發(fā)現(xiàn)了小鼠在注射了加熱的短棒桿菌(corynebacteriumparvum)后,可以引起肝小葉浸潤大量的單核吞噬細(xì)胞,再次注射脂多糖后會導(dǎo)致致命性的肝炎[26]。該模型病理機制與人體的重癥肝炎類似,但由于死亡率較高,在21世紀(jì)后已較少使用。

短棒桿菌與LPS合用時,首先注射短棒桿菌,引起肝臟中大量單核吞噬細(xì)胞浸潤,巨噬細(xì)胞增生、活化、吞噬功能增強;再次注射LPS后,進(jìn)一步激活肝竇中的枯否細(xì)胞,誘導(dǎo)釋放大量的細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ等,從而誘發(fā)急性肝炎[27]。

2.3 異種血清

異種血清作為異體抗原刺激實驗動物后,激活體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生免疫應(yīng)答,形成免疫復(fù)合物(IC),而后激活相應(yīng)抗體來進(jìn)行免疫清除。若異種血清沒有被及時清除,一直刺激機體,則會在模型動物體內(nèi)的肝小葉動脈中產(chǎn)生纖維素樣壞死,匯管、肝竇、血管壁上均有IC沉著,繼而引起Ⅲ型變態(tài)反應(yīng),異種白蛋白會激發(fā)靜止的貯脂細(xì)胞增生,并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死及組織損傷,進(jìn)而分泌膠原,最后形成肝纖維化[28]。

采用異種血清建立肝損傷動物模型時,常選用人血清白蛋白、牛血清等,通過腹腔、皮下或尾靜脈多次注射制備模型。將人血清白蛋白用生理鹽水稀釋,與等量的完全弗氏佐劑乳化后進(jìn)行皮下多點注射,每次注射白蛋白4mg,共4次,然后尾靜脈注射白蛋白。在電鏡下觀察,早期可見貯脂細(xì)胞增生、活躍,后期見肌成纖維細(xì)胞形成,分布于匯管區(qū),周圍沉積大量膠原[29]。該模型制備簡單、經(jīng)濟,模型穩(wěn)定,肝細(xì)胞損傷較輕,無碎屑狀或橋狀壞死,可為各種慢性免疫性肝損傷相關(guān)疾病的研究提供實驗動物模型。

2.4 聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinicpolycytidylicacid,PoliI:C)

聚肌苷酸胞苷酸是Toll樣受體3(toll like receptor3,TLR3)的配體,能夠通過激活TLR3分子相關(guān)的信號通路來引發(fā)下游的免疫應(yīng)答[30],在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。PoliI:C的結(jié)構(gòu)與雙鏈病毒RNA類似,所以由其引起的免疫反應(yīng)相似于病毒感染[41]。PoliI:C是肝臟NK細(xì)胞強有力的激活劑,可以募集大量的肝臟NK細(xì)胞遷移至肝臟內(nèi),高度活化并增強其免疫功能。PoliI:C通過激活并增強NK細(xì)胞的殺傷作用,在腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)及誘生的α干擾素(INF-α)、γ干擾素(INF-γ)和白細(xì)胞介素12(IL-12)等細(xì)胞因子介導(dǎo)下,可以誘發(fā)肝臟輕度的炎癥反應(yīng),引起肝細(xì)胞的實質(zhì)損傷[42]。

PoliI:C誘導(dǎo)肝損傷模型需要通過腹腔注射5～20μg/g的PoliI:C,注射后18～24h內(nèi)血清ALT和AST明顯升高[33]。也可選用C57BL/6小鼠同時注射PoliI:C和D-Gal N,建立免疫性肝損傷的模型,給藥時尾靜脈注射poliI:C(75μg/kg),腹腔注射D-Gal N(500mg/kg),12h后可見血清ALT、AST水平上升,顯微鏡下可觀察到肝臟組織肝小葉壞死、免疫細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞膨脹、壞死和裂解等現(xiàn)象[34]。

2.5 基因工程改造

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,特定基因敲除小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠、人源化小鼠等經(jīng)過基因修飾、改造的小鼠模型,已經(jīng)成為建立免疫性肝損傷模型,研究肝病發(fā)生發(fā)展、藥物篩選與評價研究的重要的重要工具[35]。

目前,有幾種轉(zhuǎn)基因小鼠模型其發(fā)病癥狀與人類ILI非常相似[36]。將白蛋白(Alb)-cre轉(zhuǎn)基因小鼠、誘導(dǎo)型白喉毒素受體(DTR)轉(zhuǎn)基因小鼠和嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)-小鼠雜交,建立Alb-cre/DTR/SCID-beige(ADSB)轉(zhuǎn)基因小鼠,腹腔注射白喉毒素(DT)4d后出現(xiàn)肝損傷,移植人肝細(xì)胞30d后小鼠肝臟出現(xiàn)了Kupffer細(xì)胞[37]。NTxPD-1/-轉(zhuǎn)基因小鼠模型則是另一類轉(zhuǎn)基因小鼠,該小鼠基于編碼程序性死亡受體1(PD-1)的基因被敲除,新生小鼠接受胸腺切除術(shù),以顯著減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量實質(zhì)被CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤,出現(xiàn)小葉壞死,并在出生后第3周左右發(fā)生致命的肝炎[38]。此外,還有不表達(dá)Tyro3、Axl和Mer酪氨酸激酶基因的TAM-/-模型小鼠[30],對TLR3的細(xì)胞內(nèi)信號通路進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié),TLR3途徑被過度激活,隨后釋放促炎癥細(xì)胞因子,TAM-/-小鼠出現(xiàn)肝炎、血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高、門靜脈炎癥和壞死。

2.6 其他

隨著對ILI的研究不斷深入,建立ILI小鼠模型的方法也不斷更新,除以上常見方法外,還可以通過注射三氯乙烯[39]、半乳糖凝集素等建立ILI小鼠模型;三氯乙烯通過誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞依賴的ILI[40];半乳糖凝集素是一種從茶樹菇中提取的化合物,其作用機制與Con A類似;酒精也可以通過誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激損傷,增加腸源性內(nèi)毒素,從而通過多種途徑激活KC誘發(fā)ILI。

3 小結(jié)與展望

不同的ILI模型建立方法具有不同的損傷特點,也為當(dāng)前不同發(fā)病機制、癥狀以及相關(guān)藥物的研究與篩選提供重要工具。其中,Con A與BCG+LPS誘導(dǎo)的ILI模型建立簡單、穩(wěn)定,發(fā)病機制與人類ILI最為相似,是最常見、應(yīng)用最多的損傷模型。尾靜脈注射LPS誘導(dǎo)的模型死亡率低,發(fā)病機制與慢性炎癥損傷相似,為慢性免疫性炎癥損傷的相關(guān)研究提供了較好的實驗動物模型,但由于時間長,當(dāng)前應(yīng)用較少。異種血清、PoliI:C誘導(dǎo)的小鼠模型簡便易行,應(yīng)用于自身免疫性肝病與病毒性肝炎的相關(guān)研究?；蚬こ谈脑斓男∈笈c人類相似性最大,還可以建立人源性模型,為深入研究免疫性肝病的病理機制提供了新途徑,也是今后動物模型研究和發(fā)展的重要方向。

疾病的發(fā)生、發(fā)展都具有復(fù)雜性,人與動物之間也存在種屬差別,所以當(dāng)前單一化的動物實驗?zāi)Ｐ蜔o法完全模擬人體中肝臟損傷完整的病理過程。在今后更應(yīng)該從人類肝損傷的免疫病理機制出發(fā),同時,充分考慮模型的重現(xiàn)性以及穩(wěn)定性、經(jīng)濟成本等因素,建立與人類發(fā)病機制更加相似、具有階段性與靶點性的動物模型,為今后免疫性肝損傷的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。