陳紫玉,高文科,李明海,何弟南,龍藝丹,黃 蕾,王梓然

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,昆明 650201)

【研究意義】無花果(FicuscaricaL.)是世界上最古老、栽培最早的果樹之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),無花果共有1000多個(gè)品種,以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主。作為高原特色水果,無花果富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及礦質(zhì)元素,是礦物質(zhì)[2]、甾醇[3]、類胡蘿卜素[4]、花青素和多酚[5]較好的來源,具有廣闊的發(fā)展前景。無花果味道甘甜、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,深受廣大消費(fèi)者的喜歡。近年來,與藍(lán)莓等水果共同成為發(fā)達(dá)國(guó)家新興的“超級(jí)水果”。果實(shí)色澤作為重要的外觀品質(zhì),在一定程度上決定其商品價(jià)值。無花果果實(shí)色澤多樣,成熟時(shí)呈黃色、黃綠色、綠色、紅色或深紫色等顏色。就育種前景而言,無花果紫皮品種相比青皮品種,具有外觀品質(zhì)好、保健價(jià)值高、商品價(jià)值高等優(yōu)勢(shì),是目前無花果育種的主要方向。因此,對(duì)調(diào)控果實(shí)顏色的基因進(jìn)行功能性研究對(duì)于選育不同皮色的無花果品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)在關(guān)于花青素的生物合成途徑已有詳細(xì)研究,尤其是在玉米、擬南芥、金魚草和矮牽牛等模式作物中[6]。這些研究揭示了某些結(jié)構(gòu)基因如查爾酮合酶(Chalcone synthase, CHS)、花青素合酶(Anthocyanin synthase, ANS)和黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose:flavonoid-3-O-glucosyltransferase, UFGT)[7]以及轉(zhuǎn)錄因子如MYB、bHLH、WD40等的重要性[8]?；ㄉ蘸铣山Y(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受多種轉(zhuǎn)錄因子(TFs)調(diào)控,根據(jù)TFs所含保守結(jié)構(gòu)域的不同,大致分為MYB、bHLH、WD40、MADS box和bZIP家族,其中研究最多的是MYB家族[9]。MYB是最具特征的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,廣泛分布于動(dòng)物、植物和真菌中?；贛YB重復(fù)的數(shù)目,可將MYB蛋白分為4類:1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[10]。目前花色苷生物合成調(diào)控的研究主要集中在MYB家族中的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。2009年Espley等[11]在蘋果中發(fā)現(xiàn)受光照誘導(dǎo)的促花色苷合成基因MdMYB1,隨后又發(fā)現(xiàn)兩類調(diào)控果肉花青苷生物合成的基因MdMYB10和MdMYB110a[12]。隨著蘋果中花色苷關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1和MdMYB10的分離與功能驗(yàn)證,其同源基因在草莓、桃、梨、甜櫻桃和石榴等植物中相繼被分離出來[13]。R2R3-MYB調(diào)控可分為激活和抑制兩類,如草莓中的FaMYB1[14]、擬南芥中的AtMYBL2[15]和葡萄中的VvMYBC等會(huì)抑制花色苷的合成[16]。病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(Virus-induced gene silencing,VIGS)作為一種驗(yàn)證基因功能的方法在園藝作物上得到廣泛的應(yīng)用[17],包括矮牽牛[18]、月季[19]和番茄[20]等。【本研究切入點(diǎn)】利用VIGS 技術(shù)建立無花果基因沉默的技術(shù)體系,完善無花果的遺傳轉(zhuǎn)化體系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用同源克隆技術(shù)對(duì)無花果果皮類黃酮生物合成調(diào)控基因FcMYB114的保守域進(jìn)行克隆,利用TRV2 載體構(gòu)建 VIGS 沉默體系,旨在探索無花果類黃酮生物合成途徑中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的分子調(diào)控機(jī)理,為創(chuàng)制不同色澤的無花果奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以栽種于云南省昆明市盤龍區(qū)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)滇臺(tái)中心的普通型無花果品種‘紫寶’為試驗(yàn)材料,其2年生,自然開心形樹形,樹勢(shì)中庸,東西走向。隨機(jī)采取30個(gè)III期的果實(shí),每10個(gè)為1個(gè)生物學(xué)重復(fù),用裝有生物冰的保溫箱保存,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。用手術(shù)刀片將果皮與雌花剝離,果皮厚度為2 mm,雌花重量為10 g,經(jīng)液氮分別冷凍后,存于-80 ℃冰箱,用于基因組DNA的提取和VIGS試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 VIGS技術(shù)載體構(gòu)建 TRV1和TRV2都具有Kan抗性。TRV1包含病毒在植物體內(nèi)復(fù)制酶基因引發(fā)沉默機(jī)制;TRV2包含病毒蛋白質(zhì)外殼、35S啟動(dòng)子和限制性酶切位點(diǎn),用于插入基因片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒。構(gòu)建方法:將含有FcMYB114基因T1質(zhì)粒及TRV2質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α菌液置于冰上融化,取10 μL菌液于10 mL離心管中,加入3 mL含有Kan 100 mg/L的液體LB培養(yǎng)基,將離心管置于搖床中,37 ℃,180 r/min,過夜培養(yǎng);分別取200 μL活化好的各菌液于10 mL離心管中,加入5 mL含有Kan 100 mg/L 的液體LB培養(yǎng)基,置于搖床中,37 ℃,180 r/min,過夜培養(yǎng);使用Axgen高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒提取各原始質(zhì)粒,其方法參照試劑盒說明書,將提取的質(zhì)粒存于-20 ℃冰箱。提取的基因原始質(zhì)粒用作后續(xù) PCR 擴(kuò)增模板,TRV2 質(zhì)粒用于構(gòu)建基因重組載體。在FcMYB114基因上下游引物兩端分別加上限制酶XbaI、XhoI的酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基,直接用擴(kuò)增片段進(jìn)行雙酶切反應(yīng),引物序列為:FcMYB114-F (5’-GCTCTAGAATGCAAAGCATA AACTGTGTTG),FcMYB114-R (5’-CCGCTCGAGTTAC CTGTTGCCTAAAAGCTTG)。

1.2.2 VIGS技術(shù)基因片段擴(kuò)增 以原始T1質(zhì)粒為模板,使用擎科Q5?Fast PCR Kit,分別克隆用于VIGS 載體構(gòu)建的基因片段。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離,用刀片將含有目的DNA的瓊脂糖凝膠切下,盡量切除含目的條帶的凝膠。使用Axgen脂糖電泳膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收,獲得的基因片段用于后續(xù)雙酶切試驗(yàn)。

50 μL VIGS技術(shù)基因片段PCR擴(kuò)增體系:10 μL 5×Buffer;2.5 μL dNTP Enhancer Buffer;2 μL PrimerFcMYB114-F(10 μmol/L);2 μL PrimerFcMYB114-R(10 μmol/L);1 μL cDNA;1 μL Pfu (1 U/μL);31.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min(1個(gè)循環(huán)); 95 ℃ 2 min,60 ℃ 10 s,67 ℃ 20 s(35個(gè)循環(huán));68 ℃ 5 min(1個(gè)循環(huán))。

1.2.3 雙酶切反應(yīng) 用Axgen?PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收各基因擴(kuò)增片段,并對(duì)回收產(chǎn)物和 TRV2 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。在200 μL離心管中分別配制20 μL各基因片段的雙酶切體系和50 μL TRV2質(zhì)粒雙酶切體系,37 ℃水浴,過夜反應(yīng)12 h。將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳處理,對(duì)目的基因片段條帶和載體條帶進(jìn)行回收。雙酶切反應(yīng)體系:5 μL 5×Buffer;20 μLFcMYB114-PCR產(chǎn)物/質(zhì)粒;2 μLXbaI;2 μLXhoI;21 μL ddH2O。目的片段和目的載體的連接:4 μL 5×Buffer、5 μL質(zhì)粒、5 μL基因片段、6 μL ddH2O。

1.2.4 轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及載體測(cè)序分析 ①將雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌;②挑取LB平板上的單菌落進(jìn)行搖菌,作為待測(cè)菌液;③利用菌液PCR進(jìn)行菌落鑒定;④根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,選取2～3個(gè)陽性克隆送至擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序;⑤利用DNAMAN等軟件分析測(cè)序結(jié)果;⑥將測(cè)序正確的質(zhì)粒根據(jù)Axgen質(zhì)粒小量提取試劑盒的說明書進(jìn)行提取,將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.5 鹽酸-甲醇法提取花青素 取0.5 g無花果果皮加液氮研磨成細(xì)粉后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中,加入5 mL含有0.1%鹽酸的甲醇溶液,超聲處理1 h后置于室內(nèi)進(jìn)行避光,震蕩(120 r/min)過夜。室溫下2500 r/min 離心10 min,取1 mL上清液與1 mL ddH2O、1 mL氯仿混合,離心(2500 r/min)10 min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定530 nm處上清液的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花青苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FcMYB114的篩選與進(jìn)化樹分析

通過云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院果樹生理與品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室前期完成的‘青皮’與‘紫寶’轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,c42269_g1基因表達(dá)量(FPKM)在‘紫寶’成熟期果皮(PM)中最高,為448.95,相比‘紫寶’幼果期果皮(PY)基因表達(dá)量增加9.49倍;遮光處理后的‘紫寶’成熟果皮中c42269_g1基因表達(dá)量相比‘紫寶’幼果期果皮(PY)顯著下調(diào)1.59倍(圖1-A)。將FcMYB114(c42269_g1)基因序列的OPF區(qū)域與其他果樹中R2R3-MYB家族基因的蛋白序列進(jìn)行序列對(duì)比,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,c42269_g1基因序列與紅皮梨PyMYB114序列相似性達(dá)到83.12%;FcMYB114(c42269_g1)基因與擬南芥AtMYB114和碧桃PpMYB9聚類,表明其親緣關(guān)系較近(圖1-B)。多重序列比對(duì)顯示,c42269_g1基因與其他R2R3-MYBs基因在N-末端具有高度同源的R2-R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,以及高度可變的、截短的C-末端區(qū)域,進(jìn)一步證明無花果FcMYB114屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一(圖1-C)。

A:FcMYB114在不同階段的表達(dá)量;B:FcMYB114系統(tǒng)進(jìn)化樹分析;C:FcMYB114蛋白與其他 MYB 蛋白的同源性分析。A:The expression level of FcMYB114 in different stages; B:FcMYB114 phylogenetic tree analysis; C:Homology analysis of FcMYB114 protein and other MYB proteins.圖1 FcMYB114的篩選與進(jìn)化樹分析Fig.1 Screening and phylogenetic tree analysis of FcMYB114

2.2 VIGS技術(shù)沉默無花果FcMYB114體系建立

將獲得的重組質(zhì)粒、TRV1、TRV2空載分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(GV3101)菌株,通過抗性篩選(Kan)與菌液檢測(cè)確定陽性單克隆。以陽性單克隆及 TRV1單克隆制備實(shí)驗(yàn)組侵染液,以空載TRV1和TRV2 農(nóng)桿菌菌液制備對(duì)照組侵染液。用10 mL注射器將侵染液打入‘紫寶’無花果II期的果皮表層,生長(zhǎng)一段時(shí)間后可在果皮色澤上看到明顯的差異(圖2-A)。鹽酸-甲醇法提取花色苷的結(jié)果表明,VIGS技術(shù)沉默后的果皮花色苷含量約為CK的38.5%(圖2-B)。以處理組和對(duì)照組的cDNA為模板,利用花色苷合成途徑的結(jié)構(gòu)基因引物(表1)進(jìn)行PCR反應(yīng),每3個(gè)果為一組生物學(xué)重復(fù),根據(jù)1% 瓊脂糖電泳條帶的亮度初步判斷侵染效果。如圖2-C所示,沉默基因FcMYB114表達(dá)后,花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的下游基因以DFR、ANS和UFGT變化最為顯著。通過RT-qPCR的進(jìn)一步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)‘紫寶’成熟期果皮中花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量與對(duì)照(CK)相比顯著下調(diào),其中DFR和ANS下降趨勢(shì)與PCR反應(yīng)結(jié)果保持一致(圖2-D)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

A:VIGS處理組和空載的照片;B:處理組和對(duì)照組果皮中花色苷含量;C:在對(duì)照和處理組中花色苷合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的PCR結(jié)果;D:在對(duì)照和處理組中花色苷合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的RT-qPCR驗(yàn)證。A:VIGS treatment group and empty photos; B:Anthocyanin content in the peel of the treated group and the control group; C:PCR of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway in the control and treatment groups; D:RT-qPCR verification of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway in the control and treatment groups.圖2 FcMYB114在‘紫寶’無花果果皮上的VIGS侵染體系Fig.2 The results of VIGS infection system for FcMYB114 in ‘Zibao’ fig

3 討 論

花色苷存在于花、果皮、果肉、營(yíng)養(yǎng)組織、塊莖和其他器官中,在促進(jìn)植物繁殖和抗逆性中起重要作用。MYBs被認(rèn)為是花色苷生物合成調(diào)節(jié)的主要因素,是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子之一。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院果樹生理與品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室之前的轉(zhuǎn)錄組研究表明,FcMYB114(c42269_g1)是所有被注釋為MYB基因中FPKM值最高的。通過遮光試驗(yàn)顯示,FcMYB114的FPKM顯著下調(diào),可推測(cè)其是無花果果皮顏色發(fā)育中起決定因素的R2R3-MYB家族基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,無花果FcMYB114與紅皮梨PyMYB114親緣關(guān)系最近,與擬南芥(AtMYB114)和碧桃(PpMYB9)的親緣關(guān)系也相對(duì)較近,表明FcMYB114基因在進(jìn)化過程中高度保守。FcMYB114N-末端具有保守的R2-R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,C-末端為調(diào)節(jié)區(qū)域,進(jìn)一步證明該基因是MYB家族成員之一。

研究發(fā)現(xiàn),‘紅陽’獼猴桃中AcMYB的表達(dá)量與花青素含量呈現(xiàn)正相關(guān)[21]。歐洲葡萄VvMYB6基因的過表達(dá)導(dǎo)致參與類黃酮類物質(zhì)合成的結(jié)構(gòu)基因顯著上調(diào),促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株花色素的增加[22]。擬南芥中MYB11、MYB12和MYB111通過對(duì)早期基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)一步促進(jìn)類黃酮物質(zhì)的合成[23]。蘋果MdMYB308L基因與MdDFR結(jié)合,可促進(jìn)花青素的積累[24]。甜櫻桃PaMYB10.1通過激活PaANS和PaUFGT基因的表達(dá)來調(diào)控花青素的合成[25]。以上研究表明,R2R3-MYB家族轉(zhuǎn)錄因子可正向調(diào)控花青素合成。本試驗(yàn)對(duì)無花果FcMYB114進(jìn)行沉默處理,轉(zhuǎn)錄組與qRT-PCR結(jié)果顯示,FcMYB114對(duì)類黃酮的生物合成起正調(diào)控作用,與前人研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

通過本研究的結(jié)果與分析得出,在pTRV2-FcMYB114介導(dǎo)的無花果果皮中,花青素含量降低;FcMYB114基因沉默處理之后,無花果果皮中類黃酮生物合成代謝途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量均發(fā)生改變,其中FcCHS、FcDFR和FcANS表達(dá)量顯著下調(diào)。研究結(jié)果進(jìn)一步證明FcMYB114轉(zhuǎn)錄因子對(duì)無花果果皮類黃酮生物合成代謝途徑中的花色苷的合成起到正調(diào)控作用。