梁 穎, 張澤錦, 王力明, 唐 麗, 高 佳

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室, 成都 610066; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室, 成都 610066; 3.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工所, 成都 610066)

【研究意義】黃瓜(CucumissativusL.)是中國設施蔬菜的主要栽培作物,在全國各地廣泛種植。黃瓜幼苗在定植后容易受到干旱[1-2]、高溫[2-3]等脅迫,其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重影響,因此在黃瓜生長過程中常通過外源添加植物生長調(diào)節(jié)劑,如脫落酸(ABA),來改善植物的抗逆性[3-4]。ABA是調(diào)控植物生長發(fā)育過程的重要內(nèi)源性激素,也是調(diào)控植物響應外源脅迫的關鍵因子,ABA能夠通過提高抗氧化酶類活性緩解脅迫效應,促進植物對外源環(huán)境的抗逆性,同時也能夠通過內(nèi)源合成、信號轉導以及和其他激素互作等多種途徑調(diào)控次生代謝物質(zhì)的合成[5-6]。此外,成熟果實中也會產(chǎn)生大量ABA,對果實發(fā)育成熟有重要的作用[7]?！厩叭搜芯窟M展】近年來,國內(nèi)外關于外源ABA對果實品質(zhì)影響的研究日益深入。研究發(fā)現(xiàn),外源ABA對果實發(fā)育成熟過程中多個方面起調(diào)控作用。在葡萄、蘋果、蜜柚以及番茄等相關研究中發(fā)現(xiàn),外源施用ABA可以顯著提高果實重量、可溶性糖含量及果實硬度等,增加色素物質(zhì)如花色苷的累積,但是會減少類胡蘿卜素的合成[8-13]。對西瓜中的研究發(fā)現(xiàn),外源施用ABA提高果實可溶性固形物含量,果實硬度卻顯著降低[7]。在歐李中的研究發(fā)現(xiàn),采前噴施ABA對歐李果實品質(zhì)的調(diào)控作用不僅受到ABA濃度和噴施次數(shù)的影響,不同品種間也存在顯著差異[14]。在葡萄中利用轉錄組測序發(fā)現(xiàn)ABA通過調(diào)控花青苷合成和轉運相關基因來促進葡萄花青苷的積累,同時篩選出可能參與調(diào)控這個過程的15個關鍵轉錄因子[15]。在藍莓中通過轉錄組測序技術篩選獲得參與藍莓成熟著色的關鍵轉錄組因子VcMYBA[16]。在番茄中發(fā)現(xiàn)外源ABA可能通過誘導芳香物質(zhì)次生代謝途徑中關鍵基因的表達促進番茄果實中芳香物質(zhì)的合成[17]。Chen等[18]通過轉錄組分析揭示了外源生長素和外源ABA通過RLKs激酶以及相關的激素信號轉導途徑調(diào)控草莓成熟的機理。以上結果表明,通過轉錄組測序分析不同外源ABA處理條件下果實基因表達差異及調(diào)控模式差異,可以篩選關鍵調(diào)控基因,挖掘ABA調(diào)控果實發(fā)育的深層機理[19]。【本研究切入點】 黃瓜的特征風味物質(zhì)主要為2E,6Z-壬二烯醛和2,6-壬二烯醇,2E,6Z-壬二烯醛是主要的特征風味物質(zhì)[19],是影響黃瓜品質(zhì)的重要指標。目前關于黃瓜施用外源脫落酸的報道大多集中在ABA對黃瓜抗逆性的影響[20-21],很少有研究關注葉片噴施ABA對黃瓜果實品質(zhì)的變化。【擬解決的關鍵問題】本研究以華北型黃瓜‘川翠13號’為研究對象,通過葉面噴施ABA,測定黃瓜果實品質(zhì),并通過轉錄組測序揭示調(diào)控黃瓜果實相關基因表達的變化,為外源噴施ABA影響黃瓜果實品質(zhì)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為‘川翠13號’黃瓜品種,購自成都好特園藝有限公司。ABA為分析純,購自飛凈生物科技有限公司。

1.2 試驗處理

試驗于2021年3—5月在四川省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園(四川省,成都市)大棚內(nèi)進行。2021年3月,挑選籽粒飽滿的黃瓜種子進行催芽,待露白后播種于32孔穴盤中,自然光條件下育苗3周后,選擇整齊一致的黃瓜幼苗移栽至塑料大棚中進行水培,營養(yǎng)液采用山崎營養(yǎng)液配方[22]。當黃瓜果實長度約為10 cm時(開花后1～2 d),以第3節(jié)黃瓜果實為試驗對象,用塑封袋套住果實進行遮擋,對黃瓜第3節(jié)瓜處以及上下各1片葉(共3片葉)進行ABA處理。試驗共設5個處理,分別噴施0(CK)、50(T1)、100(T2)、200(T3)和400 μmol/L(T4)的ABA溶液,以滴水為度,正反兩面噴施。每個處理4株黃瓜植物,重復3次。處理后1周采取果實并保存于液氮中用于轉錄組測序和后續(xù)品質(zhì)測定。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 品質(zhì)指標測定 黃瓜品質(zhì)指標參照李合生[23]的方法進行測定,其中可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定,抗壞血酸含量采用二氯酚靛酚滴定法測定。

黃瓜風味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛含量參考劉春香等[24]的方法稍作改進進行測定。稱取5 g凍樣黃瓜粉末到頂空瓶中,采用頂空微固相萃取與氣質(zhì)聯(lián)用儀,利用選擇離子掃描技術測定黃瓜中特征風味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛的含量。以反,順-2,6-壬二烯醛為標準品建立標準曲線,計算樣品中反,順-2,6-壬二烯醛的含量。75 μm聚二甲基硅氧烷(Polydim ethylsiloxane,PDMS)萃取頭。色譜條件:色譜柱HP-5MS(30 m0 mls mmmmlsi,μm);進樣口溫度250 ℃,接口溫度250 ℃;分流比12∶1;載氣為高純氦氣,恒流流速1.0 mL/min;升溫程序:起始溫度36 ℃,然后以12 ℃/min的速率升至60 ℃,再以6℃/min升至140 ℃,最后以20 ℃/min升至240 ℃,保持10 min。質(zhì)譜條件:離子源溫度200 ℃,電離方式EI,電子能量70 eV。

1.3.2 黃瓜果實總RNA提取、文庫構建、轉錄組測序以及差異表達基因篩選 黃瓜果實的總RNA提取方法參照RNAplant Plus Reagent DP437(天根,北京,中國)方法進行,采用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)檢測RNA濃度及純度,采用試劑盒VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina(Vazyme,北京,中國)構建cDNA文庫。由派諾森公司(http://www.personalbio.cn/)完成測序,測序平臺為illumina Novaseq 6000。樣品上機測序獲得的原始數(shù)據(jù)(RAW reads)進一步過濾,去除一些帶接頭、低質(zhì)量的reads從而獲得Clean reads。利用HISAT v2.0.4將Clean reads與對黃瓜的參考基因組進行序列對比[25]]。利用BLAST進行基因功能注釋[16-17,26-27]。利用DESeq軟件獲得差異表達基因(FDR<0.05, |log2FC| >2)。GO(Gene ontology)功能富集分析采用topGO進行[28],KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析使用OmicShare tools (www.omicshare.com/tools)完成。

1.3.3 qRT-PCR方法驗證RNA-seq結果 隨機選取10個差異表達基因進行qRT-PCR分析,用于驗證RNA-seq結果。使用微孔板紫外分光光度計(TECAN,infinite M200 Pro,Switzerland)檢測RNA濃度和質(zhì)量,然后對總RNA進行反轉錄,反轉錄使用cDNA合成試劑盒(Tiangen)。以CsEF1A為看家基因(Csa_2G139820),使用熒光定量PCR儀(Bio-Rad,CA,USA)檢測基因相對表達量。PCR反應包括95 ℃ 3 min以及40個循環(huán)95 ℃ 15 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s。特異性引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和方差分析,使用Sigmaplot 14以及Adobe Illustrator 6.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 葉片噴施不同濃度ABA處理對黃瓜果實品質(zhì)的影響

從表2可知,葉面噴施ABA可顯著提升黃瓜果實可溶性糖含量。與CK相比,葉面噴施不同濃度ABA,黃瓜果實可溶性糖含量分別增加47.35%、16.50%、4.16%和5.79%。黃瓜果實抗壞血酸含量則隨著ABA濃度增加呈先增加后降低趨勢,T1、T2、T3處理的抗壞血酸含量較CK分別增加60.49%、63.49%和65.08%,而T4處理的抗壞血酸含量較CK下降62.08%。但是噴施不同濃度的ABA均可降低黃瓜風味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛含量,與CK相比,T1、T2、T3和T4處理分別下降44.24%、30.09%、26.67%、42.58%。說明,葉面噴施ABA可以促進黃瓜可溶性糖和抗壞血酸含量的積累,但是降低黃瓜風味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛的積累。T4處理中黃瓜的風味物質(zhì)和抗壞血酸含量都顯著降低,為了進一步解析外源ABA對黃瓜果實營養(yǎng)品質(zhì)的影響,選擇T4處理作為研究對象進行下一步分析。

表2 葉片噴施ABA對黃瓜品質(zhì)的影響Table 2 Effect of foliar ABA application on qualities of cucumber

2.2 黃瓜果實的轉錄組分析概況

從表3可知,經(jīng)過測序,黃瓜果實獲得共計261 364 680條原始數(shù)據(jù),經(jīng)過質(zhì)量剪切過濾后獲得237 831 174條序列,占總reads數(shù)的91%。GC含量為42.23%～43.78%,Q20值和Q30值分別為97.44%～97.62%和92.94%～93.58%,說明測序質(zhì)量較好,可以用于后續(xù)分析。將過濾后數(shù)據(jù)與黃瓜的基因組進行比對,序列的匹配度為95.73%～96.25%,因此,測序結果可靠程度較高。

表3 轉錄組測序質(zhì)量Table 3 Qualities of the RNA-seq

2.3 黃瓜果實基因差異性表達分析

將CK和T4處理進行基因差異表達分析,從圖1A～B可知,葉片噴施ABA后,黃瓜果實共檢測到169個基因差異表達,其中有75個基因下調(diào)表達,占基因差異表達的44.38%,基因上調(diào)表達有94個,占基因差異表達的55.62%。從圖1-C可知,差異表達基因在3個重復之間的表達趨勢基本一致,說明葉面噴施ABA影響了黃瓜果實基因轉錄水平的表達。

A為差異表達基因的數(shù)量統(tǒng)計圖;B為差異表達基因的火山圖;C為差異表達基因相對表達量的熱圖。A showed the numbers of the DEGs numbers; B showed the volcano map of the DEGs; C is the normalized expression level of the DEGs.圖1 葉片噴施ABA黃瓜果實中的差異表達基因Fig.1 Differentially expressed genes of cucumber fruits in response to foliar ABA application

2.4 黃瓜果實差異表達基因的GO富集分析和KEGG通路分析

GO功能富集分析表明,CK和T4處理的黃瓜果實差異表達基因主要富集在轉錄調(diào)控過程(圖2-A)。此外,GO功能富集還包括一些生物合成過程,如調(diào)控大分子生物合成、芳香物質(zhì)合成以及雜環(huán)合成等。

為了進一步分析預測差異基因的生物功能,對CK和T4處理的黃瓜果實差異基因進行KEGG富集分析(圖2-B),發(fā)現(xiàn)差異表達基因富集的主要通路包括植物激素信號轉導、苯丙氨酸代謝、類胡蘿卜素代謝以及花生四烯酸代謝,說明葉面噴施ABA可能影響黃瓜果實的苯丙氨酸代謝、類胡蘿卜代謝和花生四烯酸代謝,并可能通過改變激素信號途徑調(diào)控黃瓜果實品質(zhì)。

圖2 黃瓜果實差異表達基因GO功能分析和KEGG通路富集分析Fig.2 Gene ontology (GO) enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment of the DEGs of cucumber fruits

2.5 黃瓜果實差異表達轉錄因子分析

GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn),黃瓜葉片噴施ABA后黃瓜果實的差異表達基因主要參與轉錄調(diào)控,因此對差異表達的轉錄因子進行分析(圖3)。黃瓜果實差異表達的基因中有44個基因(26%)功能注釋為轉錄因子,主要包括bHLH轉錄因子、bZIP轉錄因子、鋅指蛋白轉錄因子C2H2和C3H、MYB相關轉錄因子以及NAC轉錄因子。噴施ABA后黃瓜果實的bHLH轉錄因子、bZIP轉錄因子基因表達均上調(diào),鋅指蛋白轉錄因子C2H2和C3H中有3個基因表達上調(diào),3個基因表達下調(diào);MYB相關轉錄因子有3個基因表達上調(diào),2個基因表達下調(diào);而NAC轉錄因子有2個基因表達上調(diào),4個基因表達下調(diào)。這些轉錄因子的差異表達說明葉片噴施ABA影響黃瓜果實中轉錄因子的表達。

圖3 外源ABA處理黃瓜果實中差異表達轉錄因子匯總分析Fig.3 Expression profile of transcription factor in response to foliar ABA application

2.6 黃瓜果實差異表達基因的qRT-PCR分析

隨機選擇黃瓜果實10個差異顯著基因進行qRT-PCR分析,并與這些基因的RNA-seq結果進行比較(表4),選取的基因在2種分析方法下,表達趨勢一致,說明RNA-seq結果的可信度較高。

表4 差異表達基因qRT-PCR結果Table 4 qRT-PCR results of the differential expression genes

3 討 論

果實品質(zhì)是衡量園藝作物商品性最重要的指標之一,其主要包括可溶性糖、維生素C以及風味物質(zhì)等。ABA是一種重要的植物激素,在果實成熟過程中起重要作用。目前,關于外源ABA對植物果實品質(zhì)的影響研究較多,例如,曲文穎等[29]研究發(fā)現(xiàn),噴施ABA可以提高藍莓果實中的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、花色素苷含量,然而對藍莓維生素C含量影響不顯著。王星辰等[9]對著色期蘋果噴施ABA后,發(fā)現(xiàn)果實中可溶性糖含量顯著提高。Balate等[13]研究發(fā)現(xiàn),噴施和根灌ABA均能提高番茄果實可溶性固形物含量和固酸比。然而,噴施ABA后,歐李果實的可溶性固形物含量、可滴定酸含量、類黃酮含量、總酚含量以及抗氧化能力都顯著降低[14],說明ABA對果實品質(zhì)的影響具有物種差異性。本研究中葉面噴施一定量ABA可以提高黃瓜的可溶性糖含量以及抗壞血酸含量,這與曲文穎等[29]的研究結果相似,可能是因為外源施用ABA可以促進黃瓜果實內(nèi)源ABA的積累,從而增加了糖分的運輸和積累導致的[23],然而本研究發(fā)現(xiàn),ABA濃度高于400 μmol/L(T4)時,抗壞血酸含量反而降低。獨特的風味是黃瓜的重要特征之一。黃瓜風味品質(zhì)在很大程度上決定于黃瓜濃郁的清香氣息,其最重要的物質(zhì)是反,順-2,6-壬二烯醛,其含量越高,黃瓜風味越濃郁[30]。本研究發(fā)現(xiàn),噴施ABA抑制了黃瓜風味物質(zhì)反,順-2,6-壬二烯醛的累積。說明,葉片噴施一定濃度的ABA可促進可溶性糖和抗壞血酸含量的累積,但是會抑制風味物質(zhì)的累積。

ABA作為一種植物激素,可以用過調(diào)控轉錄因子的活性調(diào)控下游基因的表達[6]。轉錄因子通過與DNA特異性結合調(diào)控下游基因的表達,參與植物的生長發(fā)育過程。通過轉錄組分析發(fā)現(xiàn),黃瓜葉片噴施ABA后,黃瓜果實中大量轉錄因子轉錄水平的表達發(fā)生變化,包括鋅指蛋白轉錄因子(C2H2和C3H)、bHLH轉錄因子、MYB相關轉錄因子、bZIP轉錄因子以及NAC轉錄因子等。鋅指蛋白構成了最大的轉錄因子家族之一,根據(jù)保守區(qū)域可以分為9個亞家族,包括C2H2(Cys2/His2)、C3H、C3HC4、C2HC5、C4HC3、C2HC、C4、C6和C8。C2H2是研究最多的鋅指蛋白,C2H2鋅指蛋白在植物非生物脅迫中有著重要的作用,包括在鹽分脅迫、滲透勢脅迫、冷脅迫、干旱脅迫、氧化脅迫以及高光脅迫中都起重要作用,C2H2鋅指蛋白通過與ABA信號通路相互協(xié)調(diào)、相互促進來調(diào)控植物對非生物脅迫的響應[31]。C2H2和C3H轉錄因子中有3個基因表達上調(diào),3個基因表達下調(diào),說明外源ABA處理影響黃瓜果實脅迫響應基因的信號通路。此外,NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子家族,主要調(diào)控植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應[32]。堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)是一類廣泛存在于真核生物中的轉錄因子,主要參與了植物的生長發(fā)育、環(huán)境因子介導的信號轉導過程以及脅迫響應[33]。葉片噴施ABA后,這類轉錄因子的表達水平都發(fā)生顯著變化,進一步說明ABA對脅迫響應信號通路的調(diào)控作用。bHLH轉錄因子、MYB轉錄因子以及WD40蛋白構成MBW蛋白復合體,在植物生長發(fā)育以及次生代謝產(chǎn)物合成途徑的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用[34]。本研究中,bHLH轉錄因子表達量均上調(diào),MYB轉錄因子2個上調(diào),1個下調(diào)。轉錄因子的差異表達說明葉片噴施ABA可能通過調(diào)控黃瓜果實轉錄水平的表達,從而影響黃瓜代謝產(chǎn)物的合成。

4 結 論

外源噴施ABA后,通過調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物合成的相關因子,增加黃瓜果實可溶性糖含量的累積,但是風味物質(zhì)的累積顯著降低。此外,外源ABA濃度增加會引起黃瓜抗壞血酸含量降低。在生產(chǎn)中,通過外源噴施ABA提高黃瓜抗逆性需要選擇合適濃度,本研究結果表明,施用50 μmol/L的ABA對黃瓜品質(zhì)影響較小。