[摘要]目的：確定SKH-1無毛小鼠光老化模型的造模方法，并將該模型用于點陣CO2激光治療效應(yīng)觀察。方法：將15只SKH-1無毛小鼠分為空白組、較低劑量紫外線組和較高劑量紫外線組，紫外線照射小鼠背部皮膚，通過觀察小鼠背部皮膚外觀、HE染色評估小鼠皮膚光老化程度，選定合適的紫外線照射劑量。10只光老化小鼠隨機分為對照組與點陣CO2激光治療組，治療前、治療后即刻、7 d、14 d及28 d檢測經(jīng)皮水分丟失（Trans-epidermal water loss， TEWL），治療前、治療后即刻、28 d、56 d行環(huán)鉆活檢取得皮膚組織，進行HE染色、Masson染色、阿新藍染色及Ⅰ型、Ⅲ型膠原免疫組化染色。結(jié)果：紫外線照射后SKH-1小鼠背部皮膚出現(xiàn)皮膚粗糙，橫向皺紋增加，膠原纖維含量顯著減少、疏松、斷裂，真皮變薄、表皮增厚等光老化表現(xiàn)，紫外線劑量過高可出現(xiàn)日光性角化甚至癌變。點陣CO2激光治療即刻皮膚組織內(nèi)可形成錐形的微小熱損傷區(qū)，TEWL即刻顯著升高7倍，1～2周恢復(fù)，逐漸出現(xiàn)膠原新生。結(jié)論：SKH-1無毛小鼠是較理想的光老化動物實驗?zāi)Ｐ?，且可用于點陣激光等美容治療后的生理與組織學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞]無毛小鼠；光老化；動物模型；點陣激光；組織學(xué)

[中圖分類號]R758.1" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2023）12-0056-04

Establishment of SKH-1 Hairless Mice Photoaging Model and Its Application in Observing the Effect of Fractional CO2 Laser

SUN Wenjia1，WU Jiaqiang2，Ma Wenjuan2，Ren Jie2

（1.Department of Dermatology， Shanghai United Family Xincheng Hospital，Shanghai 201206，China; 2.Department of Dermatology，Huashan Hospital of Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract： Objective" To determine the method of establishing SKH-1 hairless mouse photoaging model， and to use this model to observe the effect of fractional carbon dioxide laser treatment. Methods" Fifteen SKH-1 hairless mice were divided into a blank group， a low-dose-UV group and a high-dose-UV group. The dorsal skin of mice was assessed by observing the appearance and HE staining， and the appropriate UV irradiation dose was selected. Then， 10 photoaged mice were randomized into a control group and a fractional CO2 laser treatment group. Trans-epidermal water loss （TEWL） was measured before ， immediately， 7 d， 14 d and， 28 d after treatment. Punch biopsy was done before and immediately， 28 days， 56 days after treatment， for HE staining， Masson staining， Alcian blue staining and immunohistochemical staining for type I and type III collagen. Results" After UV irradiation， the dorsal skin of UV-irradiated SKH-1 mice showed roughness， increased transverse wrinkles， significantly reduced collagen fibers， loose and fractured collagen fibers， thinner dermis and thickened epidermis. Excessive UV dose could cause solar keratosis or even carcinoma. Fractional CO2 laser treatment formed conical microthermal zones， with an immediate 7-fold increase in TEWL and recovery in 1-2 weeks. New collagen emerged gradually. Conclusion" SKH-1 hairless mouse is an ideal experimental animal model of photoaging， and can be used for physiological and histological studies of cosmetic laser treatment.

Key words： hairless mice; photoaging; animal model; fractional laser; histology

隨著人民生活水平的提高，對于皮膚抗衰的需求逐年增加。皮膚老化分為自然老化和光老化，其中紫外線造成的皮膚光老化是主要原因，表現(xiàn)為皮膚干燥粗糙、皺紋、皮膚松弛、色素異常、血管擴張等，組織學(xué)上表現(xiàn)為日光彈性纖維變性、表皮增厚或萎縮、膠原纖維增粗且排列紊亂等[1]。對于光老化形成機制的研究一直是皮膚科學(xué)研究的重要話題，近二三十年也不斷涌現(xiàn)各類的光電設(shè)備、注射材料等抗衰手段。對于這類研究需要大量的組織學(xué)樣本提供更堅實的證據(jù)，而要在實驗中獲得較大量的人源皮膚組織標本是比較困難的，因此建立一個穩(wěn)定的光老化動物實驗?zāi)Ｐ陀兄匾饬x。光老化的動物模型選擇主要是嚙齒類的實驗鼠和小型豬[2]。但由于動物來源和成本等限制，以往國內(nèi)學(xué)者常常選擇使用人工脫毛后的小鼠、大鼠或者豚鼠制作光老化模型動物，然而反復(fù)多次人工脫毛會給皮膚帶來一定的刺激，影響實驗結(jié)果，并不適合作為光老化模型動物。SKH-1無毛小鼠因具有穩(wěn)定無毛基因，是國外常用的皮膚病、皮膚腫瘤及皮膚光老化損傷的動物模型[3]，目前在國內(nèi)也可以獲得。本研究將探討SKH-1無毛小鼠光老化模型建立的方法，并嘗試將該模型用于點陣CO2激光治療效應(yīng)的觀察，為光電治療皮膚光老化的研究提供參考。

1" 材料和方法

1.1 儀器和試劑：日光模擬器（上海Sigma公司，波長280～400 nm）；紫外線輻照計（美國Solar light公司）；點陣CO2激光器（美國科醫(yī)人公司，Ultrapulse）。

1.2 實驗動物：本實驗采用6～8周雌性SPF級SKH-1無毛小鼠，體重（30.38±1.96）g，該小鼠由上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物實驗室提供。飼養(yǎng)于SPF級動物飼養(yǎng)室，控制溫度（22±2）℃、濕度60%～70%，燈光12 h日夜交替，予標準飼料和水飼養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審批通過。

1.3 實驗方法

1.3.1 光老化模型建立

1.3.1.1 紫外線照射：光老化模型是通過用紫外線照射無毛小鼠背部皮膚形成，紫外線源采用日光模擬器（波長280～400 nm）。15只SKH-1無毛小鼠隨機分為三組，分別為空白組、紫外線低劑量照射組、紫外線高劑量照射組，每組5只。小鼠背部受試部位皮膚距光源10 cm，被限制于直徑12 cm的圓柱形無蓋容器中。試驗前首先測定小鼠皮膚的最小紅斑量，均值為154 mJ/cm2?？瞻讓φ战M不予紫外線照射；紫外線低劑量照射組取70% UVB-MED開始照射，每周3次，隔日照射，第2周起以最小紅斑量照射，每周增加30%最小紅斑量（Minimal erythema dose，MED），共照射10周，在試驗過程中小鼠皮膚無紅斑產(chǎn)生。UVB累積劑量為8.6 J/cm2，UVA累積劑量為184.3 J/cm2。紫外線高劑量照射組起始劑量與低劑量組相同，但每周劑量增加50% MED，每周照射3次，直至12周，UVB累積劑量為12.8 J/cm2，UVA累積劑量為273.7 J/cm2。

1.3.1.2 取材和組織學(xué)觀察：完成紫外線照射后，用4 mm環(huán)鉆切取小鼠背部皮膚組織，置于10%中性緩沖福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。切片厚度3 mm，用于HE染色觀察組織學(xué)變化。

1.4 點陣CO2激光治療效應(yīng)觀察

1.4.1 點陣CO2激光治療：取10只經(jīng)過光老化造模的SKH-1無毛小鼠，分為對照組和治療組，治療組小鼠背部皮膚接受點陣CO2激光治療。治療參數(shù)如下：選擇DeepFX模式，能量20 mJ，密度15%，1遍，沒有重疊。激光治療前小鼠背部皮膚予外涂復(fù)方利多卡因乳膏（紫光）20 min。術(shù)后未用藥物或修復(fù)產(chǎn)品。

1.4.2 經(jīng)皮水分丟失檢測：在激光治療前、治療后即刻、治療后7 d、14 d、28 d測定經(jīng)皮失水量（TEWL）（Tewameter TM300經(jīng)皮失水測試儀）。背部區(qū)域檢測6次，取6個值平均值，單位g/（h·m2）。

1.4.3 組織學(xué)及免疫組化觀察：10只小鼠在治療前、28 d和56 d環(huán)鉆活檢取小鼠背部皮膚組織，同一小鼠需先后取3次活檢，為保證可比性，每個時間點在相同部位取材且避開上一次取材部位，傷口壓迫止血，未給予其他藥物處理，2周內(nèi)愈合，最后一次活檢后處死小鼠。取得的皮膚組織樣本進行HE染色、Masson染色后、阿新藍染色以及Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原免疫組織化學(xué)染色。每張切片取10個視野，以相同條件拍攝照片。HE染色切片在Image Pro plus6.0軟件系統(tǒng)下測量真皮厚度，取10個數(shù)值的平均值作為該切片的真皮厚度，單位以μm計。免疫組化染色切片在真皮區(qū)域隨機選取5個120 μm×120 μm的方形區(qū)域，檢測該區(qū)域內(nèi)的累積光密度值，除以該區(qū)域的面積，得到平均光密度。以5個值取平均值作為該切片免疫組化染色強度進行統(tǒng)計比較。為了觀察激光治療即刻損傷，進行完上述的TEWL檢測后，對治療組的1只小鼠接進行活檢，取得皮膚組織進行HE染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 19.0軟件，TWEL、真皮厚度和免疫組化染色強度均以均值±標準差（xˉ±s）表示，行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 光老化模型建立：經(jīng)10周或12周UV照射后，肉眼觀察到小鼠背部皮膚粗糙，橫向皺紋增加，成羊皮紙樣外觀（見圖1B）。其中高劑量照射組有小鼠背部出現(xiàn)直徑1.0～1.5 mm淡紅色丘疹（見圖1C）。停止照射后隨訪，低劑量照射組小鼠背部皮膚仍保持粗糙的外觀，沒有明顯恢復(fù)，而高劑量照射組即使在停止照射后不斷有小鼠出現(xiàn)類似前述的丘疹性皮損，并逐漸增大、增多，表面粗糙，至停止照射后15周時，所有高劑量組小鼠背部均出現(xiàn)大小不一淡紅色或褐色丘疹，表面粗糙，部分皮疹出現(xiàn)破潰（見圖1D）。在顯微鏡下觀察，無論紫外線劑量高低，照射后小鼠表皮明顯增厚，棘層肥厚，真皮變薄，真皮膠原斷裂、排列紊亂，皮脂腺增生，高劑量UV照射組真皮內(nèi)炎癥細胞浸潤明顯增加，可見多核巨細胞（見圖2A～C）。另外，對上述增生性皮疹進行活檢，發(fā)現(xiàn)可見呈日光性角化樣改變，表皮中至重度不典型增生，部分突破基底膜，癌變，見圖2D。

2.2 點陣CO2激光治療后的即刻損傷和屏障功能修復(fù)：點陣CO2激光治療后即刻，SKH-1小鼠背部出現(xiàn)水腫性紅斑（見圖3A），環(huán)鉆取皮膚活檢，HE染色下可以看到窄而深的錐形熱損傷區(qū)域（Microscopic thermal zones，MTZ），中間為表皮和淺層真皮氣化剝脫，邊緣見V型的熱凝固帶（見圖3B）。治療前、治療后即刻、7 d、14 d、28 d檢測了背部皮膚的TEWL，顯示點陣CO2激光治療組TEWL較對照組顯著上升約7倍（P＜0.001），1周后，TEWL仍顯著高于對照組（P＜0.001）；術(shù)后2周TEWL恢復(fù)到基線水平，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3C）。

2.3 點陣CO2激光治療后小鼠皮膚組織學(xué)變化：治療后的28 d和56 d觀察組織學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)治療組較對照組真皮厚度有輕微增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖4A）。但是Masson染色可見膠原纖維更加致密（見圖5A2、B2），真皮內(nèi)阿新藍染色也明顯變深提示粘多糖沉積增多（見圖5A3、B3）。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)第28天Ⅲ型膠原明顯增加（P＜0.01），第56天Ⅰ型膠原顯著增加（P＜0.05），差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（見圖4 B～C）。

3" 討論

目前國內(nèi)常用的光老化動物模型仍以嚙齒類動物為主，如小鼠、大鼠、豚鼠等[4-5]，其中小鼠最為常用，既往文獻報道DBA/2小鼠、HosHRM小鼠、ICR小鼠、BALB/c裸鼠等均能復(fù)制光老化模型[4]。有研究曾比較不同品系的小鼠（C57BL/6J、SKH-1、BALB/c）對于UVB照射的不同反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)C57B/6J小鼠皮膚改變最接近人的皮膚，其次是SKH-1小鼠，BALB/c小鼠皮膚相對差異較大[6]。由于穩(wěn)定的無毛性狀，SKH-1無毛小鼠在實際運用中更有優(yōu)勢，是目前使用最廣泛的無毛小鼠光老化模型[7]，但在國內(nèi)應(yīng)用仍比較少。Kligman LH等[3]最早發(fā)現(xiàn)經(jīng)過一定量的UVB照射，SKH-1無毛小鼠的皮膚組織學(xué)改變與人類皮膚光損傷的變化很接近。目前在制作該模型的過程中，仍然以UVB光源為主，照射的間隔和周期不同，以隔日照射或每周5次照射為主，制作周期6～10周不等[8-11]。UVB和UVA在皮膚光老化中均有作用，UVB能量高，對DNA損傷大，但作用局限于表皮和淺層真皮，而UVA作用層次更深，因此UVA是真皮光老化的主要因素[12-13]。本研究中為了更好地模擬人的皮膚在自然光線下的老化過程，采用了包括UVA和UVB波段的日光模擬器（波長290～400 nm），觀察到經(jīng)過紫外線照射的小鼠背部皮膚變得粗糙，皮紋加深，組織學(xué)上見到表皮增厚，棘層肥厚，皮脂腺增生，膠原纖維斷裂、減少等現(xiàn)象，與之前Kligman得到的結(jié)果基本一致。除了波長以外，UV輻照的強度、時間、累積劑量均是影響模型制作的重要參數(shù)。參考過去文獻中照射的能量、能量增加、時間、間隔時間不盡相同。本研究采用隔日UV照射，從70% MED開始，每周逐漸增加劑量30%或50% MED，其過程中未發(fā)現(xiàn)過小鼠背部皮膚沒有出現(xiàn)顯著的紅斑、水腫、水皰等急性損傷表現(xiàn)。研究表明，接受相同累積劑量的UVA照射，每次使用低輻照強度比高輻照強度可能造成更顯著的光老化[12]，提示在光老化模型時不需要過高的輻照強度。在紫外線累積過程中，發(fā)現(xiàn)相對較低紫外線劑量（UVB累積劑量為8.6 J/cm2，UVA累積劑量為184.3 J/cm2）就能導(dǎo)致SKH-1小鼠顯著的光老化，而當劑量過高（UVB累積劑量12.8 J/cm2，UVA累積劑量為273.7 J/cm2）時可導(dǎo)致日光性角化，甚至癌變，在高劑量照射組，12周時小鼠背部已經(jīng)開始出現(xiàn)丘疹，即使停止UV照射后，丘疹仍不斷增加，且逐漸增大，甚至產(chǎn)生破潰、糜爛、結(jié)痂，與用SKH-1無毛小鼠制作皮膚鱗癌模型研究中觀察到的結(jié)果一致[14]?？梢姀墓饫匣桨┳兪且粋€量變引起質(zhì)變的過程，對于紫外線照射的劑量把握是成功建立光老化動物模型的關(guān)鍵。

SKH-1無毛小鼠光老化模型在大量的研究中被用于抗光老化外用制劑和口服制劑的效果評估[8-11]，近幾年來該模型越來越多地被用于光電、注射等醫(yī)美治療的觀察[15-17]。本研究首次嘗試將該光老化模型用于CO2點陣激光治療的研究。Hantash BM等[18]首次描述了剝脫性點陣CO2激光的組織學(xué)變化，可在皮膚中形成一個矩陣式排列的剝脫和凝固區(qū)域，通過免疫組織化學(xué)方法確認在治療后3個月內(nèi)有膠原重塑現(xiàn)象。在本次研究中，用點陣CO2激光作用于SKH-1無毛小鼠背部皮膚，組織學(xué)上可以觀察到非常相似的剝脫-熱凝固損傷區(qū)域，特殊染色和免疫組化染色也證實了治療后28～56 d有膠原新生，且Ⅲ型膠原的顯著增加早于Ⅰ型膠原，與前述人皮膚術(shù)后表現(xiàn)非常一致。光電術(shù)后的屏障修復(fù)一直是臨床工作中關(guān)注的重要問題，Hwang YJ等[19]的研究中，光老化皮膚在點陣CO2激光治療后TEWL升高變化較痤瘡瘢痕組皮膚顯著，且恢復(fù)時間超過一周。在本實驗中，點陣CO2激光治療后即刻TEWL升高約7倍，修復(fù)時間需要1～2周，與人皮膚也非常類似。所以，該模型能夠很好地模擬人皮膚在光電治療后的損傷和修復(fù)過程，為后續(xù)評估不同設(shè)備的治療效果、安全性及術(shù)后護理產(chǎn)品的效果評估提供了基礎(chǔ)。

SKH-1無毛小鼠皮膚光老化表現(xiàn)與人皮膚十分接近，制作時間周期相對較短，并且操作簡單易行，在實驗運用中有巨大優(yōu)勢。但小鼠體積小，不易固定，背部可以取材的皮膚面積較小，且皮膚比較薄[真皮（251.71±17.87）μm]，對于需要皮膚面積較大或一定厚度的實驗來說仍有一定局限性，價格也相對比較昂貴。另外，SKH-1小鼠是白化背景小鼠，不適用于光老化相關(guān)的色素研究。SKH小鼠有色素的變種，即SKH-2無毛小鼠，其表皮和真皮均存在黑素細胞，隨著紫外線照射劑量的增加，色素沉著增加，已被用于光老化相關(guān)色素研究[20]，但這個變種目前在國內(nèi)并沒有商品化?？傊?，在目前可得的資源范圍內(nèi)，SKH-1無毛小鼠是非常理想的光老化實驗動物模型，該模型在皮膚光電治療損傷和修復(fù)的研究中能發(fā)揮重要作用。

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[收稿日期]2022-08-23

本文引用格式：孫雯佳，吳家強，馬文涓，等.SKH-1無毛小鼠光老化模型的建立及點陣CO2激光治療效應(yīng)觀察[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（12）：56-60。