[摘要]目的：探索銀耳子實體提取物在人體及體外的抗皺功效。方法：測量銀耳子實體提取物對成纖維細胞基質金屬蛋白酶-1（Matrix Metallopeptidase 1，MMP-1）、膠原蛋白-1（Collagen I，CoL I）、透明質酸（Hyaluronic acid，HA）表達含量的影響。通過受試者試用測試、抗皺功效測試檢驗含有銀耳子實體提取物的精華及眼膜對皮膚粗糙程度、皺紋參數(shù)（深度、長度、面積、數(shù)量）及眼角紋嚴重程度的影響，并調查受試者的產(chǎn)品滿意度。結果：在成纖維細胞抗皺指標測試中，UVA輻射建模會造成成纖維細胞HA含量降低（P＜0.01），銀耳子實體提取物能夠顯著提高成纖維細胞降低的HA含量（P＜0.001）。在銀耳子實體產(chǎn)品抗皺測試中，其產(chǎn)品可防止受試者皮膚粗糙度增加（P＜0.01）、降低眼周皺紋參數(shù)（P＜0.001），并且具有較高的受試者滿意度。結論：銀耳子實體提取物通過修復真皮HA流失等功效，在護膚品中發(fā)揮出抗皺能力，且安全性高，在抗皺抗衰護膚品開發(fā)中具有較好的應用前景。

[關鍵詞]銀耳子實體提取物；抗皺；皮膚衰老；化妝品原料；天然護膚；中醫(yī)美容

[中圖分類號]TS201.4" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2023）12-0060-05

Study on the Wrinkle Removal Effect of Termella Fuciformis Extract

WANG Siyi1，2，3，WANG Qianghua1，2，3，ZHOU Ming1，2，3，ZHAI Wenli1，2，3，LU Fazhan1，2，3，

LIU Pingping1，2，3，HUO Tong1，2，3

（1.Yunnan Baiyao Group Health Products Co.，Ltd.，Kunming 650000，Yunnan，China; 2.East Asia Skin Health Research Center，Beijing 100048，China;3.Peking REAL DermaSci amp; Biotech Co.， Ltd.，Beijing 100048，China）

Abstract： Objective" To explore the anti-wrinkle effect of Tremella fuciformis fruiting body extract in vivo and in vitro. Methods" The effects of Tremella fuciformis fruiting body extract on the expression of MMP-1， CoL I and HA were measured; The effects of the essence and eye mask containing Tremella fuciformis fruiting body extract on skin roughness， wrinkle parameters （depth， length， area and quantity） and severity of crow's feet wrinkles were tested through consumer in-use test and anti-wrinkle effect test. In addition， the product satisfaction of the subjects was surveyed. Results In the anti-wrinkle index test， UVA radiation reduced fibroblast HA content （P＜0.01）， while Tremella tremella fruit body extract significantly increased it （P＜0.001）. In wrinkle resistance testing of Tremella fruiting body products， they showed a preventive effect on skin roughness （P＜0.01） and periocular wrinkles （P＜0.001）， leading to high subject satisfaction. Conclusion" Tremella fruiting body extract can repair the loss of hyaluronic acid from the dermis and play an effective anti-wrinkle role in skin care products with high safety， demonstrating promising prospects for the development of anti-wrinkle and anti-aging skin care products.

Key words： tremella fuciformis extract; wrinkle removal; skin aging; ingredients of cosmetics; natural skin care; TCM cosmetology

銀耳（Tremella fuciformis）一種常見的食用真菌，也是中醫(yī)學中藥食同源的一味藥材，具有滋陰潤肺、健脾開胃的功效，其在營養(yǎng)學及藥學的研究中均表現(xiàn)出較大的應用前景[1]。銀耳含有豐富的蛋白質、氨基酸、糖類、礦物元素等營養(yǎng)成分，銀耳多糖為其重要的功效成分[2-3]。在臨床與基礎研究中銀耳多糖顯示出抗氧化、降血脂、保護營養(yǎng)神經(jīng)、調節(jié)免疫、炎癥、抗腫瘤、抗衰老等多種生物活性[4]。在美容護膚中銀耳具有保濕、抗氧化、抑制黑色素等功效[5]。皮膚衰老是美容研究中的重要議題，其表現(xiàn)較為多樣，皮膚的粗糙、松弛、色素異常以及皺紋都是皮膚衰老的表現(xiàn)，其中以色素以及皺紋的改變更加突出[6-7]。從微觀的改變而言皮膚的衰老是由DNA損傷、炎癥、糖基化、細胞功能下降，以及透明質酸、膠原蛋白和彈性蛋白的分解引起的，是一個相當復雜的生物過程[8-10]。鑒于銀耳的藥理學特性，其很可能表現(xiàn)出對皮膚衰老的預防或緩解作用，因此在本研究中對銀耳子實體提取物的抗皺功能在細胞以及臨床實驗中進行了探究。

1" 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料：銀耳子實體提取物（云南白藥集團健康產(chǎn)品有限公司提供），成纖維細胞（北京協(xié)和細胞資源中心提供），HaCat細胞（北京協(xié)和細胞資源中心提供），B16細胞（北京協(xié)和細胞資源中心提供），人基質金屬蛋白酶1（MMP-1）ELISA Kit（CSB-E04672h，CUSABIO），Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）測試盒（H142-1-1，NanjingjianchengBio），人透明質酸（HA）ELISA Kit（CSB-E04805h，CUSABIO），細胞增殖試劑盒Ⅰ（MTT）（11465007001，Merck Millipore）。

1.1.2 主要器材：細胞培養(yǎng)箱（BPN-50CH（UV），一恒科學儀器有限公司，中國），UV紫外燈箱（BLE-8T254，SPECTRONICS，美國），冷凍高速離心機（TGL-16，湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，中國），熒光酶標儀（Infinite M200 PRO，TECAN，美國），皮膚面部分析儀VISIA-CR（Canfield，美國），皮膚皺紋分析系統(tǒng) Primos （LMI Technologies Gmbh Canfield，加拿大），皮膚快速光學成像測試系統(tǒng) AEVA HE（Breuckmann，德國）。

1.1.3 含銀耳子實體提取物的護膚產(chǎn)品：含銀耳子實體提取物（2.46%）抗皺精華（云南白藥集團健康產(chǎn)品有限公司），含銀耳子實體提取物（2.53%）抗皺眼膜（云南白藥集團健康產(chǎn)品有限公司）。

1.2 細胞毒性檢驗：以DMSO將銀耳子實體提取物樣品溶解為16 mg/ml的母液，過膜后再稀釋，濃度從高到低分別為2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.1 mg/ml、0.05 mg/ml、0.01 mg/ml、0.005 mg/ml、0.001 mg/ml。將對數(shù)生長期狀態(tài)良好的成纖維細胞、HaCat細胞、B16細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)過夜。吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度樣品，每個樣品做五個平行，細胞對照組未做處理，培養(yǎng)24 h。加入100 μl MTT（1 mg/ml）溶液，放入37℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，4 h后終止培養(yǎng)；棄液后加入150 μl DMSO，緩慢震蕩10 min后于490 nm波長測定各孔吸光度值。細胞活率=（測定孔OD值-空白對照OD值）/（細胞對照組OD值-空白對照OD值）×100%。

1.3 成纖維細胞抗皺指標測試：成纖維設置空白對照組、模型組、陽性對照組和樣品組。控制每孔細胞數(shù)5×105個。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入少量的PBS（pH=7.4）以剛好覆蓋細胞為宜。使用UVA刺激細胞，UV輻射量為7 J/cm2，空白組不照射。吸棄PBS，加入不同濃度樣品，銀耳子實體提取物按細胞毒實驗結果添加濃度為6%，VC為80μg/ml，GSH為20μm/ml刺激細胞24 h。將細胞培養(yǎng)物上清液在4℃，1 000 g下離心15 min，取上清液，使用人基質金屬蛋白酶1（MMP-1）ELISA Kit測試MMP-1含量。用PBS（pH為7.2～7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到1×106個/毫升，反復凍融使細胞破，1 000 g離心20 min，取上清，使用Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）測試盒測試CoLⅠ含量，使用人透明質酸（HA）ELISA Kit測試HA含量，操作均按照試劑盒說明書進行。

1.4 受試者篩選與分組干預

1.4.1 納入標準：①年齡34～65歲，健康中國女性受試者；②“魚尾紋”等級≥2分，采用《Skin Aging Atlas volume 2 Asian Type》中標準[11]；③1個月內(nèi)未參加其他護膚品或臨床研究；④簽署知情同意書。

1.4.2 排除標準：①計劃懷孕或妊娠或哺乳期以及產(chǎn)后6個月內(nèi)的婦女；②患有嚴重系統(tǒng)疾病、免疫缺陷或自身免疫性疾病者；③患有過敏性疾病或最近1～2年有過化妝品過敏者；④現(xiàn)在或最近1個月受試部位使用抗皺產(chǎn)品及醫(yī)美治療或參加其它測試者；⑤測試區(qū)域患有皮膚科疾病或正在接受藥物治療者；⑥受試者患有可能影響測試的疾病，或正在進行可能影響測試的治療；⑦研究者認為不適合參加者。

1.5 分組處理：受試者試用試驗為臨床觀察試驗，受試者分為抗皺精華組及抗皺眼膜組兩組，抗皺精華組每日早晚在清潔面部后試用產(chǎn)品，抗皺眼膜組每日晚間在清潔面部后試用產(chǎn)品，連續(xù)使用4周?？拱櫣πг囼灋殡S機半側面部對照研究，測試期間，受試者隨機一側半臉使用測試產(chǎn)品，使用方式及時間同抗皺精華組，另一側不使用任何護膚品作為對照。測試期間測試區(qū)域不允許使用測試產(chǎn)品以外的護膚品，可以繼續(xù)按照日常習慣使用原有非抗皺功效的潔面和防曬產(chǎn)品。

1.6 面部皺紋指標檢測及受試者使用評價：受試者試用試驗中在第0、14、28天，使用皮膚皺紋分析系統(tǒng)Primos對受試者眼周皺紋進行測試，測試內(nèi)容包括皺紋數(shù)量、深度、面積、長度。在第28天向受試者發(fā)放產(chǎn)品滿意程度問卷，評價產(chǎn)品各項功效滿意程度?？拱櫣πг囼炛性诘?天及第28天試用皮膚快速光學成像測試（AEVA-HA）法，測量皮膚粗糙度參數(shù)Rz和Ra，并由3位有經(jīng)驗的評估人員依照采用《Skin Aging Atlas volume 2 Asian Type》[11]標準對VISIA CR拍攝的高清眼部皺紋圖像進行分級評估。受試者在第28天通過功效自我評價量表對眼部皺紋的改善情況進行自我評價。

1.7 統(tǒng)計學分析：應用 SPSS 21.0（SPSS Inc. Chicago，IL，USA）軟件對各個測量值進行描述性統(tǒng)計，用Shapiro-Wilk Test 進行數(shù)據(jù)改善值正態(tài)分布的顯著性檢驗，若Sig.（雙側）＞0.01，則呈正態(tài)分布，進行t檢驗，顯著性差異水平α取0.05；若Sig.（雙側）＜0.01，則呈非正態(tài)分布，進行Wilcoxon檢驗，顯著性差異水平α取0.05。皮膚快速光學成像數(shù)據(jù)應用方差分析（對數(shù)數(shù)據(jù)）檢驗的方法進行產(chǎn)品使用前后的比較，以及產(chǎn)品區(qū)與空白區(qū)間的比較。圖片評價和自我評價應用秩和檢驗進行產(chǎn)品使用前后的比較，以及產(chǎn)品區(qū)與空白區(qū)間的比較。

2" 結果

2.1 銀耳子實體提取物的細胞毒性：對生長狀態(tài)良好的細胞用不同濃度的銀耳子實體提取物進行細胞毒性檢測，各組結果見圖1。后續(xù)抗衰老實驗主要建立在成纖維細胞以中，當細胞存活率為80%時銀耳子實體提取物濃度約為6%，因此后續(xù)實驗中銀耳子實體提取物濃度設定為6%。

2.2 銀耳子實體提取物的抗皺功效：銀耳子實體提取物抗皺指標的測試結果顯示，銀耳子實體提取物具有減少成纖維細胞MMP-1表達（見圖2A），增加CoLⅠ表達的趨勢（見圖2B），并能夠顯著提高成纖維細胞HA含量（P＜0.001）逆轉了UVA輻射造成的HA的降低（P＜0.01）（見圖2C）。

2.3 含銀耳子實體提取物護膚品的抗皺功效

2.3.1 受試者基本信息：兩項測試在2021年6月23日-2021年8月18日共納入受試者127名女性受試者，年齡34～65歲，各項測試受試者基本信息見表1。

2.3.2 受試者試用試驗：受試者試用試驗結果顯示不論是精華還是眼膜劑型下，Primos測量的皺紋數(shù)量、面積、長度在第2周和第4周檢測時均顯著低于第0周的基線數(shù)據(jù)（均P＜0.001），深度數(shù)據(jù)中抗皺精華在第2周與基線相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），抗皺眼膜在第4周與基線相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖3A）。在受試者滿意度調查中兩種劑型均得到了較好的評價（見圖3B）。

2.3.3 抗皺功效試驗：抗皺功效實驗結果顯示使用兩種產(chǎn)品4周后，抗皺精華組與空白組皮膚粗糙度Rz以及Ra與第0周的初始值相比有所增加（P＜0.05），抗皺眼膜組則無明顯改變（P＞0.05），且兩組產(chǎn)品的增加量顯著低于空白組（P＜0.05）（見圖4A～B），因此可以認為產(chǎn)品能夠減輕皮膚粗糙的改變。在對VISIA CR圖像的皺紋嚴重程度評價中，兩組產(chǎn)品的眼部皺紋評價均顯著降低（P＜0.05），并且在變化量中顯著優(yōu)于空白組（P＜0.05）（見圖4C）。在受試者的自我評價中產(chǎn)品使用4周后眼下與眼角的皺紋均有顯著減輕（P＜0.05），（見圖4D）。

2.3.4 耐受性：研究中受試者對兩項產(chǎn)品耐受性較好，未出現(xiàn)產(chǎn)品相關的不良反應以及不耐受報告。

3" 討論

皮膚衰老包括內(nèi)源性與外源性兩個方面，與以組織退化為主的內(nèi)源性衰老不同，外源衰老的突出的表現(xiàn)之一便是皺紋的產(chǎn)生[12-13]。皮膚衰老表征一方面可以作為對壽命以及健康的預測指標[14]，另一方面由于其對外貌的改變也催生出相關美容需求。因此研究者們也著眼于皮膚衰老機制通過各種療法延緩其發(fā)生[15-17]。

銀耳，又名白木耳、雪耳，它既是營養(yǎng)滋補食品，又是一味扶正強壯的中藥[18]。其性平，味甘、淡、無毒，具有滋補生津、潤肺養(yǎng)胃、益氣安神、強心健腦等功效[19]。在中醫(yī)理論中皮膚的衰老與機體臟器的虛衰與瘀血阻滯有關，皮膚不能得到氣血的溫潤濡養(yǎng)而至容顏衰老[20]。肺與皮毛相表里，銀耳具潤肺生津之能，以滋養(yǎng)濡潤肌膚腠理，皮膚得濡養(yǎng)氣血充盛則可以延緩肌膚衰老，達到抗衰防皺、駐顏悅色和輔助治療損美性疾病的美容目的[21-22]。同樣在現(xiàn)代研究中銀耳主要成分銀耳多糖也顯示出其抗衰潛力，已有研究顯示銀耳多糖可以通過Nrf2/keap-1通路，減少細胞內(nèi)活性氧、丙二醛的含量，增加過氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性，以保護UV造成的皮膚細胞損傷[23]。并且也有研究顯示銀耳多糖具有降低黑色素和絡氨酸酶水平，促進HaCat細胞以及成纖維細胞活性的能力，這意味著銀耳多糖可有助于皮膚的修護且具有美白功效[24]。在本研究中體外實驗數(shù)據(jù)顯示，銀耳子實體提取物具有降低MMP-1含量、增加膠原蛋白含量的趨勢，并且具有明確的增加透明質酸含量的功能，并且在人群實驗中其表現(xiàn)出抗皺提高皮膚彈性以及緊致度的能力，這與其中醫(yī)學以及先代藥理研究結果具有一致性。

中醫(yī)藥在損容性皮膚問題中的現(xiàn)代化應用是中醫(yī)皮膚科近年來的研究重點，但是中藥傳統(tǒng)的外用劑型或多或少的有顏色深、氣味大或不易使用的弊端[25]，將中藥成分與現(xiàn)代化妝品生產(chǎn)工藝相結合是對中醫(yī)藥文化寶庫的新的應用開發(fā)方向。在本研究中，將銀耳子實體提取物制作成抗皺精華以及抗皺眼膜的新劑型，并結合國家藥監(jiān)局新發(fā)布的《化妝品功效宣稱評價規(guī)范》的評價方式[26]，通過人體功效試驗驗證了其抗皺功能，其結果顯示了銀耳子實體提取物在護膚領域較好的應用前景。

綜上所述，銀耳子實體提取物通過修復真皮HA流失等功效，在護膚品中發(fā)揮出抗皺能力，且安全性佳、人群接受度高，在抗皺抗衰護膚品開發(fā)中具有較好的應用前景。

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[收稿日期]2022-10-03

本文引用格式：王思藝，權強華，周明，等.銀耳子實體提取物抗皺功效研究[J].中國美容醫(yī)學，2023，32（12）：60-64.