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        體外模擬消化篩選抗消化降糖肽及降糖活性研究

        2023-04-19 13:29:10田曉閩張學(xué)軍張西平孫琳琳龔魁杰郭玉秋劉開昌陳利容
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2023年5期
        關(guān)鍵詞:糖肽乳清糖苷酶

        韓 迪,蘇 情,田曉閩,3,張學(xué)軍,張西平,孫琳琳,龔魁杰,郭玉秋,劉開昌,陳利容

        (1. 煙臺(tái)大學(xué),山東 煙臺(tái) 264000;2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所,山東 濟(jì)南 250100;3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東 青島 266000;4. 山東天久生物技術(shù)有限公司,山東 菏澤 274108;5. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 濟(jì)南 250100)

        高血糖是糖尿病的主要特征,長期的高血糖癥狀會(huì)引發(fā)眼病、心血管病、腦血管病等各種慢性并發(fā)癥,嚴(yán)重者危及生命[1]。目前,包括阿卡波糖、二甲雙胍在內(nèi)的治療T2DM 的6 類長效或短效藥物都有一定的副作用,會(huì)對(duì)患者的身體造成不同程度的損害,且合成藥物成本高、價(jià)格昂貴[2]。因此,具有良好降低血糖功效的天然產(chǎn)物受到了廣泛關(guān)注。

        生物活性肽是一類對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物,其中具有降血糖功能的肽類多用于開發(fā)預(yù)防和治療糖尿病或肥胖癥的藥物[3]。降糖肽一般是由2~15 個(gè)氨基酸殘基組成的短肽,其降血糖能力也與降糖肽的含量及氨基酸組成有關(guān)[4]。降血糖原理主要分為2 種,一是驅(qū)動(dòng)胰島β 細(xì)胞分泌胰島素,增強(qiáng)胰島素敏感性;二是競爭性抑制α - 葡萄糖苷酶活性,阻斷α-1,4 糖苷鍵水解,延緩淀粉在小腸分解為葡萄糖,抑制餐后血糖快速上升。

        降糖肽通常通過口服的方式進(jìn)入人體,在胃和腸道中進(jìn)行消化吸收。有研究表明[5],胃和腸道中的蛋白酶、pH 值等均會(huì)影響生物活性肽在人體胃腸道中的吸收與釋放。馮曉文等人[6]通過體外模擬消化試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),消化后的乳清肽ORAC 值明顯提高。王倩等人[7]則發(fā)現(xiàn)海地瓜多肽體外模擬消化后,降糖活性下降。目前,對(duì)模擬消化后降糖肽的生物活性研究,已經(jīng)成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)。因此,經(jīng)體外模擬消化方法,篩選獲得具有高活性的降糖肽,并開展人體餐后血糖試驗(yàn)驗(yàn)證,為降糖肽產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        海洋魚肽、螺旋藻肽、豌豆肽、牡蠣肽、大豆肽、小麥肽、乳清肽;胃蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司提供;胰酶、DPP-IV 酶,美國Sigma 公司提供;α - 葡萄糖苷酶,上海源葉生物科技有限公司提供;對(duì)硝基苯-α-D- 葡萄糖苷(99%),上海麥克林生化科技有限公司提供,其余試劑均為分析純。

        SQP 型電子分析天平,上海賽多利斯產(chǎn)品;Sorvall ST 8R 型離心機(jī),美國賽默飛產(chǎn)品;SHA-B型恒溫振蕩器,常州國華產(chǎn)品;DK-98-IIA 型電熱恒溫水浴鍋,天津泰斯特產(chǎn)品;FE28 型pH 計(jì),瑞士梅特勒- 托利多產(chǎn)品;Varioskan LUX 型酶標(biāo)儀,美國賽默飛產(chǎn)品;Onetouch 血糖儀,深圳強(qiáng)生產(chǎn)品。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 消化前后降糖肽α - 葡萄糖苷酶抑制率測定

        (1) 消化前降糖肽α - 葡萄糖苷酶抑制率測定。將樣品用0.1 mol/L(pH 值6.8) 磷酸鉀緩沖液(PBS) 配置成4 mg/mL 的溶液,在96 孔酶標(biāo)板中加入樣品液40 μL,1 U/mL α- 葡萄糖苷酶溶液20 μL,于37 ℃下保溫10 min,再加入1×10-3mol/L 對(duì)硝基苯-α-D- 葡萄糖苷(PNPG) 溶液40 μL,于37 ℃下保溫10 min,最后加入1 mol/L Na2CO3溶液100 μL 終止反應(yīng),于波長405 nm 處測定樣品組吸光度(A樣品),用PBS 代替PNPG 作為樣品背景組(A樣品背景),用PBS 代替樣品作為空白組(A空白),用PBS 代替樣品和PNPG 作為空白背景組(A空白背景) α - 葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算見公式(1):

        (2) 消化后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率測定。制備人工胃液:取240 mL HCl 溶液(pH 值2),胃蛋白酶(3 000~3 500 U/g) 1.8 g,搖勻后,加水稀釋至300 mL,置于4 ℃冰箱備用。制備人工小腸液:取磷酸二氫鉀2 g,加水150 mL 使其溶解,用0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8,取胰酶3 g,加水適量使溶解,將以上配制的溶液混合后,加水稀釋至300 mL,置于4 ℃冰箱中備用。

        以人工胃液和腸液為溶劑,添加樣品質(zhì)量濃度控制為4 mg/mL。取1 mg 樣品,加入20 mL 人工胃液,溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速100 r/min 震蕩2 h 后,pH 值調(diào)至6.8,移入20 mL 人工小腸液搖勻,溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速100 r/min 振蕩3 h,最后85 ℃滅酶10 min,降至室溫后進(jìn)行超濾離心處理,保留濾出液,根據(jù)1.2.1(1) 方法測定消化后降糖肽的α- 葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.2 降糖肽抗氧化活性的測定

        (1) 降糖肽羥基自由基清除率測定。參考龐忠莉[8]的方法,將樣品配制成溶液,稀釋至0.2,1.0,5.0,10.0,20.0 mg/mL 的梯度溶液,向其中分別加入0.009 mol/L 的FeSO4溶液1 mL,0.009 mol/L 的水楊酸- 乙醇溶液(50%乙醇溶液) 1 mL,用漩渦振蕩器混合均勻,加入H2O2(0.03%) 溶液1 mL 啟動(dòng)反應(yīng)。將混合液置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min,若有沉淀產(chǎn)生,以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心5 min,上清液于波長510 nm 處測得樣品吸光度(A1),用1 mL蒸餾水代替樣品,其他條件不變作為對(duì)照組(A2),用50%乙醇代替水楊酸- 乙醇溶液1 mL,其他條件不變作為空白組(A0),羥基自由基的清除率計(jì)算見公式(2):

        計(jì)算羥基自由基清除率半數(shù)抑制濃度IC50。

        (2) 降糖肽DPPH 自由基清除率測定。參考馮曉文等人[6]的方法。將活性肽分別配置成1,2,5,10,20 mg/mL 的溶液,取0.2 mmol/L DPPH(95%乙醇溶解) 0.5 mL 與降糖肽溶液0.5 mL,混勻,避光反應(yīng)30 min,于波長517 nm 處測定樣品吸光度(A樣品),同時(shí)以95 %乙醇加樣品作空白組(A空白),DPPH 溶液加上95%乙醇為對(duì)照組(A對(duì)照),DPPH自由基清除率計(jì)算見公式(3):

        計(jì)算DPPH 自由基清除率半數(shù)抑制濃度IC50。

        (3) 降糖肽總還原能力測定。參考趙紅星[9]的方法,取1 mL 不同濃度的樣品溶液(1,2,5,10,20 mg/mL),與0.2 mol/L 磷酸鈉緩沖液2.5 mL(pH=6.6) 和1% (W/V) 鐵氰化鉀水溶液2.5 mL 混合,50 ℃保溫30 min,迅速冷卻,再加入10% (V/V)的三氯乙酸水溶液2.5 mL,以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10 min,取2.5 mL 上清液,加蒸餾水2.5 mL 和0.1%(W/V) 的氯化鐵水溶液0.5 mL,混合均勻。反應(yīng)10 min 后于波長700 nm 處測吸光度,用吸光值大小代表總還原能力。

        1.2.3 降糖肽對(duì)餐后血糖濃度的影響測定

        選取男女各5 名空腹血糖和糖耐量正常,無代謝性疾病,消化系統(tǒng)疾病,內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及家族糖尿病史,身體健康,近期內(nèi)未服用可能影響糖代謝藥物的成年人,平均年齡在25.17±1.17 歲,所有研究對(duì)象年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),被試者在試驗(yàn)前均已簽署知情同意書。測定試驗(yàn)對(duì)象餐后240 min 內(nèi)血糖濃度變化。

        GI 測定按照WS/T 652—2019《食物血糖生成指數(shù)測定方法》:Wolever 法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 消化前后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率

        消化前后降糖肽的α- 葡萄糖苷酶抑制率見圖1。

        圖1 消化前后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率

        由圖1 可知,未經(jīng)過體外模擬消化的蛋白短肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率差異不大,均在31.5%以下,但是經(jīng)體外模擬消化后的不同降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率均發(fā)生不同程度的變化,其中豌豆肽、小麥肽、大豆肽、牡蠣肽、乳清肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率較消化前高,且牡蠣肽和乳清肽的增加為原來的2.5 倍,分別為72.09%和69.91%。根據(jù)張廷新等人[10]的研究,降糖肽的生物活性主要取決于其含量和氨基酸序列組成,因此,降糖肽體外消化前后α - 葡萄糖苷酶抑制率變化有2 種原因:第1 種是由于體外消化酶對(duì)不同降糖肽的水解程度不同導(dǎo)致的,根據(jù)Yao R 等人[11]研究,生物活性肽對(duì)α -葡萄糖苷酶的抑制活性在一定范圍內(nèi)隨水解度增加而增加;第2 種是由于酶解后降糖短肽的氨基酸組成不同導(dǎo)致的,根據(jù)Hatanaka T 等人[12]的研究,通過切割不同部位的肽鍵,產(chǎn)生不同氨基酸組成的二肽基肽酶抑制肽,對(duì)二肽基肽酶抑制率的IC50值相差11 倍以上。結(jié)果表明,牡蠣肽和乳清肽最適合用作人體降糖肽。

        2.2 降糖肽的抗氧化活性

        降糖肽的抗氧化活性見圖2。

        圖2 降糖肽的抗氧化活性

        由圖2(a) 可知,乳清肽和牡蠣肽的羥基自由基清除率都隨樣品濃度增加而增強(qiáng),乳清肽和牡蠣肽的羥基自由基清除率IC50值分別為5.40,7.32 mg/mL,與龐忠莉[8]的研究一致。因此,乳清肽和牡蠣肽對(duì)于羥自由基具有良好的清除效果。由圖2(b) 可知,乳清肽和牡蠣肽的DPPH 自由基清除率都隨樣品質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng),乳清肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)和乳清肽質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時(shí),DPPH 自由基清除率超過90%,IC50值分別為6.66,2.53 mg/mL,與馮曉文等人[6]的研究一致。因此,乳清肽和牡蠣肽對(duì)于DPPH 自由基具有良好的清除效果。由圖2(c)可知,乳清肽和牡蠣肽在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),A700顯示的吸光度與質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)性,即總還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而升高[9],當(dāng)乳清肽和牡蠣肽質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL 時(shí),A700值接近于0.4,均顯示出較高的還原能力。結(jié)果表明,乳清肽和牡蠣肽均具有良好的抗氧化性。

        2.3 降糖肽對(duì)人體餐后血糖濃度的影響

        降糖肽對(duì)人體餐后血糖濃度的影響見圖3。

        圖3 降糖肽對(duì)人體餐后血糖濃度的影響

        由圖3 可知,人體餐后血糖濃度呈現(xiàn)先增加后降低趨勢,進(jìn)食120 min 之后血糖濃度基本趨于穩(wěn)定,進(jìn)食饅頭后再服用乳清肽和牡蠣肽,血糖濃度增加速率變緩,另外,進(jìn)食饅頭血糖濃度峰值在進(jìn)食后30 min,為9.13±0.15 mmol/L,在服用乳清肽和牡蠣肽后,血糖濃度峰值延后,為進(jìn)食后45 min,分別為8.23±0.15 mmol/L 和8.63±0.15 mmol/L,且乳清肽組血糖濃度峰值低于牡蠣肽。根據(jù)2.1 結(jié)果,乳清肽和牡蠣肽被人體消化后,仍能夠有效抑制α -葡萄糖苷酶活性,抑制淀粉在小腸分解為葡萄糖,從而降低餐后血糖濃度升高速率。有研究表明,降低血糖濃度的另一個(gè)途徑是,通過刺激胰島素分泌來增加葡萄糖消化。因此,圖3 中服用乳清肽后血糖濃度峰值低于牡蠣肽,可能是乳清肽對(duì)胰島素產(chǎn)生的促進(jìn)作用高于牡蠣肽。

        根據(jù)人體餐后血糖濃度變化結(jié)果,以葡萄糖GI值為參照,計(jì)算饅頭GI 值為79.09,食用饅頭后,再分別食用乳清肽或牡蠣肽,測得饅頭的GI 值分別為63.14 和67.44,分別降低為饅頭本身GI 值的79.83%和85.26%,降糖效果明顯。因此,乳清肽和牡蠣肽均能減少人體餐后血糖上升,適合用作人體降糖肽。

        3 結(jié)論

        對(duì)豌豆肽、螺旋藻肽、海洋魚肽、小麥肽、大豆肽、牡蠣肽和乳清肽7 種降糖肽進(jìn)行體外模擬消化篩選,α - 葡萄糖苷酶抑制率試驗(yàn)篩選出牡蠣肽和乳清肽是適合用作人體食用的降糖肽,羥基自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總還原能力結(jié)果得出乳清肽和牡蠣肽具有良好的抗氧化活性,人體餐后血糖濃度變化和GI 值結(jié)果得出,牡蠣肽和乳清肽均能夠明顯降低人體餐后血糖水平。

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