杜 琪 廖月琴 吳盈茹 水珊珊，2，* 張 賓，*

（1浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021）

細(xì)點(diǎn)圓趾蟹（Ovalipes punctatus）屬十足目梭子蟹科圓趾蟹屬，為廣溫廣鹽性世界廣布種，俗稱沙蟹或花蟹，廣泛分布于東亞、大洋洲、南非及南美洲的東西海岸，國(guó)內(nèi)主要分布于黃海、東海和南海。細(xì)點(diǎn)圓趾蟹作為一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類，在東海捕撈量占該海域海蟹總捕撈量的70%以上［1-3］。細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，張小軍等［4］對(duì)比鋸緣青蟹和細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的營(yíng)養(yǎng)組成，發(fā)現(xiàn)細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中鋅、單不飽和脂肪酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量均顯著高于鋸緣青蟹，且其氨基酸組成更接近人體所需氨基酸的比例，是一種有益于人體心腦血管健康，富含優(yōu)質(zhì)蛋白的水產(chǎn)品。

細(xì)點(diǎn)圓趾蟹捕撈后不易存活，肌肉中水分活度高，蛋白質(zhì)含量豐富及組織內(nèi)源酶系發(fā)達(dá)，致使其在運(yùn)輸和銷售過程中肌肉品質(zhì)劣變十分迅速［5］。研究表明，蟹類產(chǎn)品貯藏品質(zhì)劣變，主要由其內(nèi)源性蛋白酶及微生物代謝作用所致，如肌肉中絲氨酸蛋白酶破壞蟹肌肉組織結(jié)構(gòu)，肌肉和肝胰腺中內(nèi)源性蛋白酶加速蟹肌肉軟化［6-8］。目前，關(guān)于細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的相關(guān)研究主要集中于加工工藝［1］、生物學(xué)特性［2-3］、下腳料開發(fā)及產(chǎn)組胺菌檢測(cè)［5，9］等方面，缺乏針對(duì)細(xì)點(diǎn)圓趾蟹捕后貯藏品質(zhì)及肌肉中肌原纖維蛋白生化特性等研究。因此，本試驗(yàn)通過冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的不同部位肌肉感官評(píng)價(jià)、肌原纖維蛋白功能特性等研究，旨在探究細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的貯藏品質(zhì)變化規(guī)律，為高品質(zhì)細(xì)點(diǎn)圓趾蟹類產(chǎn)品加工及貯藏提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

活體細(xì)點(diǎn)圓趾蟹樣品在舟山市老街菜市場(chǎng)購(gòu)入，體質(zhì)量（120±15）g，用純水洗刷蟹殼表面及蟹臍后，用解剖針插入神經(jīng)中樞致死，用食品聚乙烯（polyethylene，PE）自封袋簡(jiǎn)單包裝后放入4 ℃冰箱中冷藏。每24 h取8～10只樣品，掀開蟹蓋，剪去蟹鰓，在30 min內(nèi)用手術(shù)刀和鑷子分別剔取胸部和螯足部位的肌肉，進(jìn)行定量描述分析及理化指標(biāo)測(cè)試，其中采用的試劑盒包括三甲胺（trimethylamine，TMA）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）、超微量ATP 酶（Ca2+）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）、分型巰基（-SH）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），試驗(yàn)周期為5 d。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-286WNQISS1 家用冷藏冷凍箱，蘇州三星電子有限公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾（中國(guó)）科技有限公司；KDN 520全自動(dòng)凱氏定氮儀，邦億精密量?jī)x（上海）有限公司；JC-HD 型智能水分活度測(cè)量?jī)x，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；FE-28 型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；iMark 酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD 有限公司；U-2800 紫外可見分光光度計(jì)，日立（中國(guó)）有限公司；EDS 300 瓊脂凝膠電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 感官評(píng)價(jià)測(cè)定 隨機(jī)選取細(xì)點(diǎn)圓趾蟹樣品，記錄其在冷藏期間的形態(tài)變化，在固定光源和固定攝影參數(shù)下記錄蟹殼正面和蟹腹的變化。參考Yang 等［10］的方法，利用定量描述分析法，對(duì)新鮮和冷藏1～5 d 后的細(xì)點(diǎn)圓趾蟹進(jìn)行感官評(píng)定。參考《GB/T 16291.2-2010感官分析 選拔、培訓(xùn)和管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則 第2部分：專家評(píng)價(jià)員》［11］組成包含12 名（4 名男性，8 名女性）成員的感官評(píng)定小組。評(píng)價(jià)小組根據(jù)實(shí)際感官特性描述感官屬性并經(jīng)全體討論、篩查、定義選定如表1中的描述詞。選用15 cm 線條作為標(biāo)度，從0～10 分別代表每一個(gè)屬性從低到高的評(píng)分（0：察覺不到；1：剛察覺；2：非常輕；3：輕微；4：有點(diǎn)輕；5：中等；6：有點(diǎn)強(qiáng)；7：強(qiáng)；8：很強(qiáng)；9：非常強(qiáng)；10：極強(qiáng)），評(píng)價(jià)小組成員針對(duì)8個(gè)描述詞對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)定，在標(biāo)度上標(biāo)識(shí)出來(lái)后，收集數(shù)據(jù)并分析。

表1 細(xì)點(diǎn)圓趾蟹感官特性描述詞及定義Table 1 The definition of main sensory properties of sand crab

1.3.2 肌肉持水力測(cè)定 使用離心力分離重量法，精確稱量3.00 g 已吸去表面水分的蟹肉，用5 cm×5 cm單層尼龍過濾網(wǎng)包裹蟹肉，記錄尼龍網(wǎng)和蟹肉的重量，下層以濾紙和棉花鋪墊，8 500 r·min-1離心10 min 后（4 ℃），迅速取出尼龍網(wǎng)包裹的蟹肉并稱重。蟹肉持水力（water holding capacity，WHC）用離心后的重量占總原重量的百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.3 水分含量和水分活度（water activity，Aw）測(cè)定 按照《GB 5009.3-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》［12］中的直接干燥法，測(cè)定樣品中水分含量；水分活度采用水分活度測(cè)量?jī)x測(cè)定。

1.3.4 肌肉pH 值測(cè)定 精確稱量3.00 g 蟹肉樣品，加入27 mL 生理鹽水并高速勻漿30 s，置于室溫靜置20 min后，于5 310 r·min-1條件下離心10 min，取10 mL上層清液用pH 計(jì)測(cè)定pH 值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3 次取其平均值。

1.3.5 肌肉揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和三甲胺含量測(cè)定 按照《GB 5009.228-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮》［13］中的自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定樣品中TVB-N 含量；采用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中TMA含量。

1.3.6 肌肉水溶性蛋白和鹽溶性蛋白含量測(cè)定 參考沈妮等［14］的方法并稍作改動(dòng)，提取肌肉水溶性和鹽溶性蛋白，并用雙縮脲法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 肌原纖維蛋白鈣離子ATP 酶（Ca2+-ATPase）活性測(cè)定 采用Ca2+-ATPase 活性試劑盒法測(cè)定肌原纖維蛋白中的Ca2+-ATPase活性。

1.3.8 肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量測(cè)定采用分型巰基測(cè)定試劑盒法測(cè)定肌原纖維蛋白中的總巰基和活性巰基含量。

1.3.9 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析 參考李志鵬等［15］的方法并稍作改動(dòng)。取3.00 g 肌肉加入27 mL 5%十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液，于85 ℃水浴1 h，10 000 r·min-1離心30 min，收集上清液為全蛋白稀釋液。全蛋白稀釋液、制備的肌原纖維蛋白溶液，均以體積比為4∶1 的比例加入蛋白上樣緩沖液共300 μL，渦旋振蕩15 s，使其混合均勻，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液作為蛋白電泳樣品。電泳上樣量為10 μL，初始電泳為40 V，樣品進(jìn)入分離膠后改為140 V。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)染色45 min，然后用不同比例的甲醇/冰醋酸脫色液脫至底色透明。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

以上測(cè)定試驗(yàn)均平行重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進(jìn)行Analysis of Variance（ANOVA）分析、Waller-Duncan分析、多重分析和差異顯著性分析（P＜0.05），使用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹感官評(píng)價(jià)分析

細(xì)點(diǎn)圓趾蟹在冷藏過程中，蟹殼正面、蟹腹背面和內(nèi)腔的形態(tài)變化情況如圖1 所示?？梢悦黠@看出，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹在4 ℃冷藏過程中迅速發(fā)生腐敗變質(zhì)。新鮮細(xì)點(diǎn)圓趾蟹蟹身（0 d）呈紅橙色，蟹鰓為有透明感的米黃色，螯足和步足連接完好，內(nèi)臟邊界清晰完整，蟹殼堅(jiān)硬而厚，肉與蟹殼連接緊實(shí)。此外，新鮮蟹肉為半透明感啫喱狀，富有彈性，肌肉間纖維束清晰，有螃蟹特有的海鮮香氣，無(wú)明顯的腥臭味。冷藏2 d后，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹蟹鰓有零星黑變，蟹殼變薄且較脆，內(nèi)部滲出少量黑綠色液體，透過蟹殼能明顯看見黑色斑塊，同時(shí)伴隨輕微腥臭味。冷藏4 d后，大部分細(xì)點(diǎn)圓趾蟹蟹殼內(nèi)兩側(cè)均黑變，步足和趾開始松動(dòng)，部分肢節(jié)已脫落，蟹鰓完全黑變，黑水滲透入蟹內(nèi)，內(nèi)臟呈現(xiàn)糜爛狀，蟹肉呈現(xiàn)水樣狀，大部分樣品已有空殼現(xiàn)象，同時(shí)伴隨有劇烈的腐敗和腥咸等惡臭氣味。

圖1 細(xì)點(diǎn)圓趾蟹冷藏過程中的形態(tài)變化Fig.1 The change of the appearance of sand crab during chilled storage

在以上感官特性分析基礎(chǔ)上，采用定量描述分析法（quantitative descriptive analysis，QDA）對(duì)冷藏細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉進(jìn)行評(píng)價(jià)。為獲得最佳呈現(xiàn)效果，選取冷藏1、3、5 d后的細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的肌肉感官評(píng)分進(jìn)行分析并繪制雷達(dá)網(wǎng)圖，如圖2 所示。隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹螯足和胸部肌肉的總體感官評(píng)分均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，蟹肉黃棕色屬性不斷加深，米白色或乳白色屬性特征則逐漸降低。在氣味方面，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的蟹鮮味在冷藏后下降，逐漸出現(xiàn)刺激性氣味；蟹肉黏性降低，呈現(xiàn)滑膩的形態(tài)，有液體滲出，不再緊實(shí)。冷藏3 d后，胸部肌肉各項(xiàng)特性感官分?jǐn)?shù)均降至5 或以下，表明肌肉品質(zhì)已發(fā)生嚴(yán)重劣變，其黃棕色屬性分?jǐn)?shù)降至2.81，同時(shí)刺激性氣味嚴(yán)重，已不適宜加工或食用。在冷藏5 d后，螯足部位肌肉除了黏性和米白色屬性降低外，其余感官特性較為穩(wěn)定，表明細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的鰲足肌肉貯藏品質(zhì)較為穩(wěn)定。

圖2 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部（A）和螯足（B）肌肉的QDA雷達(dá)網(wǎng)圖Fig.2 Radar chart of QDA data of cephalothorax （A）and pincer （B）muscle of sand crab during chilled storage

2.2 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉的持水力變化情況

持水力（WHC）主要表征肌肉樣品保持其自身水分的能力。由圖3可知，在冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和鰲足肌肉組織的WHC 均呈不斷下降的趨勢(shì)。螯足部位肌肉WHC總體高于胸部肌肉，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其下降幅度也低于胸部，冷藏5 d 后仍能保持在69.19%，此時(shí)胸部肌肉的WHC已降至57.86%。

圖3 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉的WHC變化情況Fig.3 Changes in WHC of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage （4 ℃）

2.3 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中水分含量和水分活度（Aw）變化情況

水分含量對(duì)水產(chǎn)品肌肉品質(zhì)的保持具有重要影響。由圖4-A可知，在冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足部位肌肉的水分含量均呈不斷下降趨勢(shì)，胸部肌肉的水分含量在冷藏前中期（0～4 d）的下降幅度較低，冷藏5 d 后水分含量大幅度降低。在4 ℃冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉水分含量下降的幅度較低，且螯足和胸部?jī)蓚€(gè)部位中水分含量整體差異不大。水分活度可以表征肌肉中的水分與其他分子之間的結(jié)合程度。由圖4-B可知，在冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹不同肌肉部位的Aw 呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明蟹肉中水分與其他分子的結(jié)合程度在逐漸下降。

圖4 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中水分含量（A）和水分活度（B）變化情況Fig.4 Changes in water content （A）and water activity （B）of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage（4 ℃）

2.4 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉pH值變化情況

肌肉pH 值的變化與其鮮活狀態(tài)及貯藏條件密切相關(guān)。細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足部位肌肉pH 值的變化情況如圖5所示。新鮮（0 d）細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉初始pH 值分別為6.79和6.70。由于蟹肉中組織蛋白酶和水分含量很高，在其離水死亡后體內(nèi)仍發(fā)生著復(fù)雜的生化反應(yīng)，如ATP 和磷酸肌酸等分解產(chǎn)生磷酸等酸性物質(zhì)、體內(nèi)糖原被糖原酶酶解產(chǎn)生乳酸等，造成肌肉pH 值有所降低或保持穩(wěn)定［16-18］。冷藏4 d 時(shí)，以上兩部分肌肉pH 值分別達(dá)到7.93 和7.64，胸部肌肉pH 值顯著高于螯足部位肌肉（P＜0.05）。冷藏5 d 時(shí)，兩部分肌肉pH 值均超過8.00。在冷藏全過程中，胸部肌肉pH值始終高于螯足肌肉，且上升幅度明顯高于螯足部位，表明胸部肌肉中堿性物質(zhì)積累的速度快于螯足部位，其貯藏穩(wěn)定性也相對(duì)較差。

圖5 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉pH值變化情況Fig.5 Changes in pH value of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage （4 ℃）

2.5 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和三甲胺（TMA）含量變化情況

TVB-N 含量是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品質(zhì)量的最常見指標(biāo)，其含量的增加一般是由于不適當(dāng)?shù)馁A藏條件導(dǎo)致水產(chǎn)品肌肉中核苷酸和含氮化合物發(fā)生自溶反應(yīng)，氨基酸也會(huì)發(fā)生脫氨作用［18］。由圖6-A 可知，在冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中TVB-N 含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與Arulkumar 等［19］在4 ℃冷藏梭子蟹（Portunus pelagicus）的研究結(jié)果相近。TVB-N 含量在冷藏后期（4～5 d）迅速上升，可能主要是貯藏后期微生物的繁殖速率上升，使得非蛋白含氮物質(zhì)脫氫脫羧能力增強(qiáng)，促使TVB-N含 量 顯 著 增 加［20］。Laly 等［21］對(duì) 冷 藏 紅 星 梭 子 蟹（Portunus sanguinolentus）的研究中，也發(fā)現(xiàn)類似的TVB-N含量變化趨勢(shì)。

圖6 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中TVB-N（A）和TMA（B）含量變化情況Fig.6 Changes in TVB-N （A）and TMA （B）content of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage （4 ℃）

圖6-B 為4 ℃冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中TMA含量的變化。結(jié)果顯示，新鮮細(xì)點(diǎn)圓趾蟹兩部分肌肉中TMA 含量較低，在冷藏中后期（3～5 d），肌肉中TMA含量隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，且胸部肌肉中TMA含量高于螯足部位。肌肉中的核苷酸及含氮化合物發(fā)生自溶反應(yīng)所生成的堿性揮發(fā)性物質(zhì)中包括TMA 這種具有惡臭氣味的揮發(fā)性胺類。此外，蟹類肌肉中含有豐富的氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO），易與腐敗菌產(chǎn)生的氧化三甲胺還原酶相互作用而還原生成大量TMA［22-23］。相比于三疣梭子蟹和中華絨螯蟹［19，24］，本研究中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中的TMA 含量較低，可能主要是由于品種及其肌肉組成存在較大差異所致。

2.6 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中水溶性和鹽溶性蛋白含量變化情況

肌肉中的水溶性蛋白主要為肌漿蛋白，存在于肌肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其中含有很多與代謝相關(guān)的酶類［25］。由圖7-A可知，在4 ℃冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中水溶性蛋白含量均呈快速下降的趨勢(shì)。冷藏至第5 天時(shí)，胸部和螯足肌肉中的水溶性蛋白含量分別下降了60.03%和57.13%。

圖7 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中水溶性蛋白（A）和鹽溶性蛋白含量（B）變化情況Fig.7 Changes in water-soluble protein （A）and salt-soluble protein （B）content of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage （4 ℃）

由圖7-B 可知，在4 ℃冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中鹽溶性蛋白含量總體也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。鹽溶性蛋白質(zhì)主要為肌原纖維蛋白，內(nèi)源蛋白酶、微生物代謝以及pH值升高均會(huì)對(duì)肌原纖維的完整性造成破壞，致使肌原纖維蛋白發(fā)生變性及降解。新鮮蟹胸部和螯足肌肉中，鹽溶性蛋白含量分別為85.55 和88.01 mg·g-1，二者無(wú)顯著差異（P＞ 0.05）。冷藏1 d 后，蟹肉中鹽溶性蛋白含量小幅度上升，可能是因?yàn)榛铙w蟹肌肉中肌動(dòng)球蛋白的形成被腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP）所抑制，而機(jī)體死后ATP含量下降導(dǎo)致肌動(dòng)球蛋白含量小幅升高［26］。冷藏5 d 后，二者分別下降至38.39 和49.94 mg·g-1，其中鰲足部位中鹽溶性蛋白含量顯著高于胸部（P＜ 0.05）。

2.7 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中Ca2+-ATPase 活性變化情況

肌球蛋白的球狀頭部是Ca2+-ATPase的活性中心，肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化會(huì)導(dǎo)致Ca2+-ATPase 活性的變化，可以用作判斷肌原纖維蛋白（尤其是肌球蛋白）的完整性及變性程度［27］。如圖8所示，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹不同部位肌肉中的Ca2+-ATPase 活性均隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。冷藏至第3 天時(shí)，胸部和螯足部位肌肉中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性分別下降了60.02%和42.56%，表明兩部分肌肉中肌原纖維蛋白（肌球蛋白）已發(fā)生變性。

圖8 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中Ca2+-ATPase活性變化情況Fig.8 Changes in Ca2+-ATPase activity of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage （4 ℃）

2.8 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹肌肉中總巰基和活性巰基含量變化情況

圖9 為細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的變化情況。巰基（-SH）是肌原纖維蛋白中活性最強(qiáng)的功能基團(tuán)，影響肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)與功能［28］。在冷藏過程中，兩部分肌肉中總巰基含量均呈下降趨勢(shì)。冷藏1 d后，蟹肉中肌原纖維蛋白總巰基含量下降較快，冷藏中期（2～3 d），肌肉中總巰基含量下降速率有所降低。

總巰基包括活性巰基和蛋白質(zhì)內(nèi)部巰基兩部分，活性巰基主要位于肌球蛋白頭部的疏水基團(tuán)中［29］。在冷藏5 d后，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中活性巰基含量分別下降了81.50%和76.11%（圖9-B）。對(duì)比總巰基和活性巰基含量的變化趨勢(shì)可知，在冷藏初期（0～2 d）中，胸部和螯足部位肌肉的總巰基含量下降幅度較大，原因可能是處于僵直期的機(jī)體內(nèi)肌動(dòng)球蛋白頭部的活性巰基在活性氧等自由基作用下迅速被氧化；冷藏中期（2～3 d）總巰基含量下降幅度較小，此時(shí)被氧化的巰基可能主要為肌原纖維蛋白變性后暴露出來(lái)的少量巰基；冷藏后期（4～5 d），肌肉中總巰基含量下降的速率再次提高，可能是此時(shí)被氧化的巰基主要為肌原纖維蛋白被分解后暴露出來(lái)的巰基，間接說(shuō)明冷藏中后期（3～5 d）非活性巰基被逐漸大量氧化［30］。

圖9 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中總巰基（A）和活性巰基（B）含量變化情況Fig.9 Changes in total sulthydryls （A）and active sulthydryls （B）content of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage （4 ℃）

2.9 冷藏過程中全蛋白和肌原纖維蛋白變化情況

由圖10-A 可知，在4 ℃冷藏過程中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉蛋白質(zhì)組成及其變化趨勢(shì)大致相同。兩個(gè)部位肌肉中蛋白質(zhì)主要分布在11～245 kDa 之間，主要包含肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，約200 kDa）、α-輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin，約100 kDa）、肌動(dòng)蛋白（actin，45～48 kDa）、原肌球蛋白（tropomyosin，約35 kDa）和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC，17～23 kDa）。在細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的全蛋白電泳圖譜中，MHC、α-actinin、條帶Ⅰ、條帶Ⅱ、肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白均呈現(xiàn)逐漸變淺變窄的趨勢(shì)，可能是MHC及α-actinin等蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶破壞，其中胸部肌肉的MHC 條帶在冷藏后迅速消失，可能與酶的作用有關(guān)，也可能與SDS溶液對(duì)于鹽溶性蛋白的提取率有關(guān)。在冷藏過程中，螯足肌肉中條帶Ⅱ逐漸變細(xì)變淡，而胸部肌肉中并沒有顯示出這條蛋白帶，推測(cè)在50 kDa 附近的這類蛋白質(zhì)在螯足肌肉中含量較高，并在冷藏過程中逐步被降解。條帶Ⅲ和MLC 蛋白在冷藏過程中逐漸變深，可能是MHC在變性或降解過程中生成了20～30 kDa蛋白條帶［30］。冷藏4 d 后，各蛋白條帶邊緣逐漸模糊拖尾，尤其是低于25 kDa 的蛋白條帶顏色逐漸加深且變粗，推測(cè)原因可能是內(nèi)源蛋白酶催化大分子蛋白質(zhì)的水解，產(chǎn)生了系列小分子質(zhì)量的蛋白條帶。

圖10 冷藏（4 ℃）過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中全蛋白（A）和鹽溶性蛋白（B）SDS-PAGE凝膠電泳圖譜Fig.10 SDS-PAGE patterns of total protein （A）and MPs （B）of the cephalothorax and pincer muscle of sand crab during chilled storage （4 ℃）

細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足肌肉中鹽溶性蛋白的電泳圖譜如圖10-B 所示。結(jié)果顯示，MHC、肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白條帶清晰。新鮮細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足部位肌肉的鹽溶性蛋白組成基本相似，但在75～185 kDa 之間有一定區(qū)別，這種差異可能與兩部分肌肉的不同生理功能相關(guān)。在冷藏過程中，兩個(gè)部位的MHC蛋白條帶均逐漸變淺變細(xì)，α-輔肌動(dòng)蛋白條帶也出現(xiàn)一定的變淡的情況。對(duì)比螯足部位，胸部肌肉的條帶Ⅰ降解更為迅速，在冷藏4 d 后，胸部肌肉中蛋白條帶Ⅰ基本消失，表明胸部肌肉中鹽溶性蛋白穩(wěn)定性相對(duì)較差。此外，蛋白條帶Ⅲ、MLC 和條帶Ⅳ顏色逐漸加深，表明肌肉中肌原纖維蛋白逐漸降解，導(dǎo)致小分子量蛋白條帶強(qiáng)度逐漸增加。此外，在SDS-PAGE 凝膠上部（＞ 200 kDa）有條帶變深的情況出現(xiàn)，推測(cè)主要是蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的形成而生成蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集體所致［31-32］。

3 討論

3.1 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹品質(zhì)變化

細(xì)點(diǎn)圓趾蟹水分含量高，肌肉中85%水分位于肌原纖維的細(xì)絲和粗絲之間［33］，在冷藏過程中，肌肉蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致肌絲的聚集，促使細(xì)胞收縮以及胞間隙增大，致使蟹胸部和鰲足肌肉WHC和水分含量不斷下降，水分析出，影響肌肉的顏色和質(zhì)地等物理特性，進(jìn)而影響肌肉的外觀、適口性和加工性能［34-35］。Wu等［16］認(rèn)為肌肉蛋白質(zhì)變性和聚集作用可促使蟹肉中三種形式的水分發(fā)生轉(zhuǎn)移變化，加上內(nèi)源酶蛋白質(zhì)的水解作用，導(dǎo)致肌肉中Aw 快速升高［36］。本研究中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹蟹肉的pH 值、TVB-N 含量和TMA 含量隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，蟹肉中溶酶體破裂使得組織蛋白酶被釋放，組織蛋白酶作用于肌肉蛋白質(zhì)，經(jīng)由含氮物質(zhì)再降解生成氨和三甲胺等堿性物質(zhì)，致使肌肉pH值快速升高［24］。此外，蟹類肌肉pH值的增加也可能與K+內(nèi)流引起離子-蛋白相互作用的改變有關(guān)［37］。而水溶性蛋白、鹽溶性蛋白含量在冷藏后逐漸下降，表明蟹肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在此過程中發(fā)生降解，而肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性降低、巰基含量下降，與pH值變化、肌原纖維蛋白與水分子間的相互作用等有關(guān)［23，38］，表明肌肉中肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性及功能受到影響，導(dǎo)致蟹肉品質(zhì)下降。結(jié)合全蛋白和鹽溶性蛋白譜圖分析發(fā)現(xiàn)，在4 ℃冷藏3 d 后，部分標(biāo)志性蛋白條帶迅速變淺變細(xì)，蟹肉蛋白質(zhì)在冷藏過程中迅速降解，這可能是內(nèi)源性蛋白酶所致，例如肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶與MHC和α-輔肌動(dòng)蛋白的變化有關(guān)［39］；組織蛋白酶能破壞肌原纖維蛋白的完整性，嚴(yán)重影響肌肉的凝膠特性，導(dǎo)致蟹肉在冷藏過程中逐漸軟化及水樣化［14］，與上述各項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢(shì)相符。

3.2 冷藏過程中細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的胸部肌肉和螯足部位肌肉品質(zhì)變化差異

在對(duì)細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的感官評(píng)價(jià)分析中發(fā)現(xiàn)，新鮮細(xì)點(diǎn)圓趾蟹（0 d）螯足肌肉的質(zhì)地和外觀特性均優(yōu)于胸部肌肉，可能是因?yàn)轵悴课坏募∪饨Y(jié)構(gòu)與胸部肌肉不同，具有更好的彈性和更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；而胸部肌肉的蟹鮮味優(yōu)于螯足部位，可能是蟹胸部的性腺富含脂肪和呈味物質(zhì)，對(duì)胸部肌肉的風(fēng)味產(chǎn)生了較大影響。并且胸部肌肉更接近螃蟹的消化腺（含大量蛋白酶類），更易受到酶系水解作用的影響。本研究中，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹螯足部位肌肉顯示出更好的維持組織間水分的趨勢(shì)。細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部和螯足部位肌肉的鹽溶性蛋白差異與張龍［24］對(duì)中華絨螯蟹不同部位中鹽溶性蛋白含量的測(cè)定結(jié)果一致，可能是螯足部位的特殊生理功能要求所致，即需要具有相對(duì)較高的鹽溶性蛋白含量來(lái)維持其較高的抗拉強(qiáng)度。而胸部肌肉和螯足部位的巰基含量變化可能受到兩個(gè)部位肌肉中蛋白質(zhì)組成、氨基酸種類和含量及不同生理功能所影響，例如螯足部位的肌肉可能承擔(dān)了更多維持機(jī)體活動(dòng)等功能，而胸部肌肉可能富含更多免疫、能量運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)功能的酶［40］。在蛋白質(zhì)降解和變性方面，聯(lián)合水溶性和鹽溶性蛋白質(zhì)含量、肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性、巰基和活性巰基含量以及電泳譜圖分析發(fā)現(xiàn)，相較于胸部肌肉，螯足部位肌肉中蛋白質(zhì)降解較慢，且降解程度相對(duì)較輕，可能是螯足部位的肌肉在冷藏過程中，由于本身結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異及內(nèi)源酶遷移效應(yīng)的先后順序?qū)е聝刹课患∪獾牡鞍酌缸饔贸潭炔煌?/p>

4 結(jié)論

本研究以細(xì)點(diǎn)圓趾蟹為研究對(duì)象，通過感官分析發(fā)現(xiàn)，新鮮蟹胸部肌肉在風(fēng)味感官屬性上整體優(yōu)于螯足肌肉，而螯足肌肉質(zhì)地和色澤感官屬性優(yōu)于胸部肌肉。隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹感官特性、水分含量、持水力、水溶性和鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATP 酶活性等均呈逐漸下降趨勢(shì)。冷藏3 d后，細(xì)點(diǎn)圓趾蟹胸部肌肉感官評(píng)分已超出可接受范圍，pH 值接近8.0，TVB-N含量超過25 mg·100 g-1，品質(zhì)已發(fā)生腐敗變質(zhì)，而鰲足肌肉整體感官特性優(yōu)于胸部肌肉。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在冷藏過程中，蟹肉蛋白質(zhì)逐漸出現(xiàn)不同程度的降解，相比于胸部肌肉，螯足肌肉蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更為穩(wěn)定的貯藏性。