侯 衛(wèi)，杜時(shí)雨，湯小虎△

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是常見的自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)是對稱性多關(guān)節(jié)炎，病變關(guān)節(jié)表現(xiàn)為腫脹、疼痛、僵硬等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和工作障礙等，并可伴有關(guān)節(jié)外多臟器的損害[1]。我國RA發(fā)病率在0.3%～0.6%[2]，可發(fā)生于任何年齡，女性發(fā)病率是男性2～3倍[3]。RA臨床常用改善病情抗風(fēng)濕藥、非甾體抗炎藥、生物制劑等，但需長期規(guī)范用藥，尚缺乏根治及預(yù)防本病的有效措施。

亙古通今，眾多中醫(yī)學(xué)家致力于RA診治，中醫(yī)藥在治療和改善癥狀等方面療效顯著且毒副作用小，目前已成為較為系統(tǒng)的理論、體系?，F(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)RA患者中晚期常出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)及合并動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎等，這些與痰瘀瘀阻密切相關(guān)，僅采用傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥、生物制劑等控制RA病情的發(fā)展，需長期用藥、易致患者依從性減低、自行停藥、減藥比例明顯提高，因此中醫(yī)藥在中晚期RA患者的診治中作用日益增長。本研究通過搜集近20年中醫(yī)藥治療痰瘀痹阻型RA的相關(guān)醫(yī)案、文獻(xiàn)，并運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)歸納、總結(jié)RA痰瘀痹阻證的用藥規(guī)律及對藥物組合的潛在作用機(jī)制進(jìn)行探索，為RA的防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 檢索方法 以“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎”“尪痹”“痰瘀痹阻”“中藥”等為檢索詞，檢索國家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(簡稱中國知網(wǎng)，CNKI)中收錄的文獻(xiàn)，時(shí)間為2000年1月至2020年12月。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)中醫(yī)診斷為“尪痹-痰瘀痹阻證”，西醫(yī)診斷為“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎”，醫(yī)案記錄完整。(2)病例采用中醫(yī)藥治療，可聯(lián)合其他中西醫(yī)治療方法，包括病案分析、臨床療效觀察、專家經(jīng)驗(yàn)方等。(3)方劑名稱、中藥名稱、用藥劑量明確完整。符合以上3條者，即可納入本研究。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)病例診斷不明確，病例重復(fù)者(僅納入時(shí)間早者)。(2)中藥劑量缺失、方劑重復(fù)及組成不完成整者。(3)綜述類文獻(xiàn)。(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。有上述任意一項(xiàng)者，不納入研究。

1.4 中藥規(guī)范 為避免處方中以別名、采集、炮制、地區(qū)差異等不同，造成藥物分析偏差，參照《中藥學(xué)》[4]、《中華人民共和國藥典》[5]對藥物名稱統(tǒng)一規(guī)范化，例炙細(xì)辛統(tǒng)一為細(xì)辛，生地統(tǒng)一為生地黃，元參統(tǒng)一為玄參，生甘草、炙甘草統(tǒng)一規(guī)范為甘草等。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理 將篩選符合納入標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)案錄入古今醫(yī)案云平臺(tái)(V 1.5.7)中醫(yī)案采集模塊，該軟件的算法經(jīng)實(shí)踐證實(shí)具有科學(xué)性、可靠性。錄入過程由兩位研究者共同完成，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行核查，以確保錄入數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

1.6 作用機(jī)制分析 將上述得到的核心藥對輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)檢索化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)，檢索條件“口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18”，得到有效成分與作用靶點(diǎn)，并對靶點(diǎn)以Uniport數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，篩選條件：口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18；在GeneCards數(shù)據(jù)庫以“Rheumatoid arthritis”為檢索詞，獲得RA的作用靶點(diǎn)，取RA和藥對的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，繪制蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用 Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建核心藥對-活性成分-靶點(diǎn)-RA網(wǎng)絡(luò)及篩選核心化合物，對共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 基于數(shù)據(jù)挖掘的文獻(xiàn)研究結(jié)果

2.1.1 藥物頻次統(tǒng)計(jì) 本研究共納入173篇文獻(xiàn)，193張?zhí)幏剑婕八幬?11味藥，總頻次2594次。其中使用頻次以當(dāng)歸109次，紅花88次，川芎86次，桃仁80次，白芥子73次排名較前，又以當(dāng)歸的使用頻次最高，頻率約為56.48%。使用頻次前10的藥物見表1。

表1 高頻中藥統(tǒng)計(jì)表

2.1.2 藥物功效統(tǒng)計(jì) 中藥的藥物功效進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以祛風(fēng)濕、潤腸通便、調(diào)經(jīng)止痛、祛風(fēng)止痛類排名較前。排名前10的見表2。

表2 中藥功效統(tǒng)計(jì)表(排名前10)

2.1.3 藥物藥性藥味統(tǒng)計(jì) 對納入的411味中藥進(jìn)行四氣統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示溫性藥使用最多，藥用頻次292次，頻率為33.42%，其次為平、寒，具體結(jié)果見圖1；五味統(tǒng)計(jì)以辛味藥使用最多，藥用頻次1074次，頻率41.40%，其次為苦、甘、咸，具體見圖2。

圖1 藥物四氣統(tǒng)計(jì)

圖2 藥物五味統(tǒng)計(jì)

2.1.4 藥物歸經(jīng)統(tǒng)計(jì) 對納入的中藥歸經(jīng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。在411味中藥里，共出現(xiàn)5074次歸經(jīng)。結(jié)果為肝經(jīng)(1440次，55.51%)，脾經(jīng)(908次，35.00%)，心經(jīng)(633次，24.40%)排名較前，具體見圖3。

圖3 藥物歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)圖

2.1.5 高頻藥物聚類分析 對193首中藥處方中頻次≥30的高頻藥物進(jìn)行聚類分析，距離類型為歐式距離，聚類方法為最長距離法，聚類分析結(jié)果見圖4。以距離>9進(jìn)行分組，可將藥物分為5組。第1組：地龍、甘草；第2組：紅花、桃仁、當(dāng)歸、川芎；第3組：白芥子、全蝎、僵蠶；第4組：威靈仙、桂枝。第5組：白芍、茯苓、陳皮、半夏、黃芪、雞血藤、青風(fēng)藤、羌活、牛膝、秦艽、沒藥。

圖4 中藥聚類分析圖

2.1.6 高頻中藥關(guān)聯(lián)分析 運(yùn)用古今醫(yī)案云平臺(tái)的數(shù)據(jù)挖掘中“關(guān)聯(lián)分析”模塊，以置信度>0.6，支持度>0.3，提升度>1.4為條件，對高頻中藥進(jìn)行分析，按照支持度高低進(jìn)行排序，具體見表3。并根據(jù)支持度、提升度得到核心藥對：川芎-當(dāng)歸。

表3 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.2 核心藥物組合“川芎-當(dāng)歸”抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制分析

2.2.1 川芎-當(dāng)歸的活性成分及對應(yīng)靶標(biāo) 從TCMSP中共獲取當(dāng)歸的化學(xué)成分125種，川芎的化學(xué)成分189種。篩選出當(dāng)歸的活性成分2種，川芎的活性成分7種，見表4。同時(shí)，在數(shù)據(jù)庫中獲取川芎-當(dāng)歸活性成分的對應(yīng)候選靶標(biāo)共91個(gè)。

表4 川芎-當(dāng)歸的活性成分

2.2.2 川芎-當(dāng)歸的活性成分治療RA的潛在作用靶標(biāo)預(yù)測 在Uniprots數(shù)據(jù)庫中輸入靶標(biāo)名稱，獲得91個(gè)候選靶標(biāo)的相應(yīng)基因。將其與GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到與RA疾病有關(guān)的靶基因相映射，用韋恩圖篩選出川芎-當(dāng)歸治療RA的潛在作用靶標(biāo)共35個(gè)。并導(dǎo)入cytoscape軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，并給予可視化展示見圖5。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)Degree值結(jié)果，位居前三的成分依次為β-谷甾醇(beta-sitosterol)、楊梅酮(myricanone)、豆甾醇(stigmasterol)等，表明這些化合物是川芎-當(dāng)歸治療RA的主要活性成分。

圖5 川芎-當(dāng)歸的關(guān)鍵活性成分與疾病靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)

2.2.3 川芎-當(dāng)歸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)蛋白互作分析 將得到的35個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用R軟件選取degree排名前20的靶點(diǎn)繪制條形圖，見圖6，圖中條形柱的長度代表degree的大小，由圖可CASP3、PTGS2、ESR1、JUN等基因排名較前。

圖6 川芎-當(dāng)歸治療RA可能的關(guān)鍵基因

2.2.4 KEGG功能富集分析 通過KEGG分析結(jié)果顯示共有96條KEGG代謝通路參與其中，篩選出富集基因數(shù)較多的前20條通路，主要涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、p53號信號通路(p53 signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、apoptosis-multiple species(細(xì)胞凋亡-多物種)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。見圖7。

圖7 川芎-當(dāng)歸治療RA潛在作用靶標(biāo)的GO富集分析

3 討論

查閱古書典籍中并無“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎”這一病名，根據(jù)癥狀將其歸為“痹證”“尪痹”等范疇，認(rèn)為其“正虛”為內(nèi)在因素，“邪侵”為外在因素。疾病后期往往出現(xiàn)“痰濁”“瘀血”等有形之邪搏結(jié)關(guān)節(jié)，正如《醫(yī)級》所云：“痹非三氣，患在痰瘀?！迸R床應(yīng)該加以重視。張金山等[6]研究發(fā)現(xiàn)痰瘀痹阻證RA較其它證型病程偏長，且疾病活動(dòng)和關(guān)節(jié)病變數(shù)目顯著升高。痰瘀痹阻證RA患者的RF、抗CCP等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)陽性率高于其它證型且骨破壞情況較嚴(yán)重[7]。將古今醫(yī)案云平臺(tái)數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法相結(jié)合，深入研究痰瘀痹阻證RA的用藥規(guī)律及作用機(jī)制，為臨床RA的治療提供參考。

本研究以RA痰瘀痹阻證為研究對象，通過搜集近20年的173篇相關(guān)文獻(xiàn)，193個(gè)處方，錄入古今醫(yī)案云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘、分析，總結(jié)出痰瘀痹阻型RA的用藥規(guī)律。藥物使用頻率統(tǒng)計(jì)得出，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛之效的紅花出現(xiàn)頻率最高，紅花富含紅花黃色素、紅花紅色素、紅花多糖等多種化合成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗缺氧、調(diào)節(jié)血液形態(tài)等多種作用[8]。川芎出現(xiàn)頻率僅次于紅花，其有活血行氣、祛瘀止痛、祛風(fēng)等功效，如《日華子本草》所言“治一切風(fēng)，一切氣，一切勞損，一切血，補(bǔ)五勞，壯筋骨”。其主要成分為生物堿、多糖類等，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等功效[9]。藥物的歸經(jīng)主要為祛風(fēng)濕藥，本質(zhì)為祛除風(fēng)寒濕邪，治療風(fēng)濕痹病，現(xiàn)代研究證實(shí)祛風(fēng)濕藥對細(xì)胞免疫、自然殺傷細(xì)胞及非特性免疫功能等均具有抑制作用，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等作用[10]。藥物歸經(jīng)頻率以肝經(jīng)、脾經(jīng)為主。

肝主疏泄，維持氣機(jī)疏通暢達(dá)，保障機(jī)體“通而不滯、散而不瘀”，肝氣瘀滯，則影響血運(yùn)受阻，不通則痛，可見肢體筋骨、肌肉疼痛等癥狀；肝血虧虛，筋骨失濡，可見肢體疼痛、屈伸受限。代雪雙等[11]研究發(fā)現(xiàn)《中華醫(yī)典》中“痹證”“尪痹”用藥規(guī)律中，歸肝經(jīng)藥物最多，并且治療RA應(yīng)從肝論治，以疏肝解郁法為主。RA患病日久、痰瘀痹阻，加之長期服藥可影響脾胃功能，臨證更應(yīng)注重顧護(hù)脾胃[12]。在關(guān)聯(lián)分析中，組合支持度、提升度排名前3依次為“川芎-當(dāng)歸”“桃仁-紅花”“紅花-當(dāng)歸”，以上藥物組合大多為活血通絡(luò)、化痰行瘀、祛風(fēng)止痛等功效，與痰瘀痹阻證RA的病因病機(jī)相符合。川芎-當(dāng)歸早在《太平惠民和劑局方》中就有詳細(xì)記錄，廣泛存在于四物湯、獨(dú)活寄生湯、當(dāng)歸四逆散、補(bǔ)陽還五湯等方藥中，芎歸配伍可以增強(qiáng)活血止痛、祛瘀通絡(luò)等功效。川芎與當(dāng)歸共有的有效成分為阿魏酸、綠原酸、藁本內(nèi)酯等，對免疫功能有良好的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究證實(shí)兩者1∶1配伍是抗炎、鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)[13]。

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇(beta-sitosterol)、楊梅酮(myricanone)、豆甾醇(stigmasterol)的Degree值位列前三，說明它們可能是治療RA的關(guān)節(jié)活性成分。β-谷甾醇和豆甾醇同為植物甾醇，具有抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。有研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可將M1極化骨髓源性巨噬細(xì)胞中IL-1β、CD86等分子表達(dá)降低，M2中IL-10、CD163等分子表達(dá)增加，使M1/M2平衡恢復(fù)，減緩類風(fēng)濕性炎癥表現(xiàn)[14]。楊梅酮的抗炎作用可以與抑制IL-1、IL-6、IL-4等多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)相關(guān)[15]。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，川芎-當(dāng)歸防治RA的核心Hub基因前三的依次為CASP3、PTGS2、ESR1?；ぜ?xì)胞的過度增生、活化和凋亡不及可導(dǎo)致RA的軟骨與骨組織的損傷，而誘導(dǎo)CASP3活化可促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡、抑制增生，減輕關(guān)節(jié)RA癥狀[16]。PTGS2是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶，對細(xì)胞的作用主要體現(xiàn)在保護(hù)方面，改善疾病的炎癥反應(yīng)主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)PTGS2靶點(diǎn)的水平[17]。ESR1依賴ERK信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、自噬和凋亡，促進(jìn)軟骨發(fā)育[18]，還可調(diào)控免疫反應(yīng)及炎癥細(xì)胞因子表達(dá)[19]。通過KEGG通路富集分析結(jié)果，顯示藥物活性成分主要通過炎癥等相關(guān)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)RA的作用。相關(guān)研究表明，“痰瘀互結(jié)”是RA與動(dòng)脈粥樣硬化共病機(jī)，痰瘀痹阻證RA患者合并動(dòng)脈粥樣硬化較其它證型較多[20-21]，炎癥反應(yīng)加速斑塊不穩(wěn)定化，同時(shí)可以加重炎癥反應(yīng)。張婷[22]研究發(fā)現(xiàn)抑制P53可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子分泌增加，引起滑膜成纖維細(xì)胞分泌增加，導(dǎo)致滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞。IL-17信號通路在RA病理過程中發(fā)揮中藥作用，IL-17為促炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥因子、趨化因子等，進(jìn)而激活NF-κB通路，促進(jìn)RA滑膜炎性反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷[23]。

綜上所述，本研究基于辨證為痰瘀痹阻型RA的基礎(chǔ)上進(jìn)行文獻(xiàn)匯總，分析臨床痰瘀痹阻型RA的用藥規(guī)律，并對核心藥物組合川芎-當(dāng)歸進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，初步探討可能的作用靶點(diǎn)、通路等。將數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法結(jié)合，為中醫(yī)藥治療RA提供參考。但研究結(jié)果與實(shí)驗(yàn)研究等仍存在一定差距，應(yīng)予進(jìn)一步的研究，為RA提供更精準(zhǔn)的治療方向。