郭海霞,黃雯瀾,,王 謝,李謹(jǐn)宵,王 銳,楊育林,向成華,張建華

(1.特色園藝生物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/成都師范學(xué)院,成都 613000;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,成都 610066;3. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院,成都 712100)

【研究意義】油橄欖(Oleaeuropaea)是木犀科木本果用兼油料作物,因其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、果實(shí)含油量高、油品質(zhì)好、經(jīng)濟(jì)效益高,越來(lái)越受種植者和消費(fèi)者歡迎[1-2]。全球油橄欖的生產(chǎn)地主要集中在地中海沿岸,主要生產(chǎn)國(guó)家為西班牙和意大利。2011年全球油橄欖種植面積為1.01×107hm2,橄欖油消費(fèi)量達(dá)3.09×107t,呈逐年上升趨勢(shì)[3]。油橄欖最早于1907年由法國(guó)傳教士引入我國(guó),1956—1962年由中國(guó)科學(xué)院等正式引入試種[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2021年我國(guó)油橄欖產(chǎn)量為7.29×104t,油橄欖主要種植區(qū)在甘肅和四川[5]。兩省總產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的94%左右。其中,甘肅產(chǎn)量約4.1×104t,四川約2.6×104t。炭疽病是制約我國(guó)南方地區(qū)油橄欖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害。該病主要危害果實(shí)、嫩芽、嫩葉及嫩梢,引起大量落果、落葉、枯梢,果實(shí)品質(zhì)下降。病斑初為褐色小點(diǎn),圓形,后擴(kuò)大,中心略凹陷,可造成油橄欖大面積減產(chǎn)。Juan等[6]在測(cè)試了來(lái)自科爾多瓦世界橄欖種質(zhì)庫(kù)384個(gè)橄欖品種的炭疽病易感性后指出,幾乎所有西班牙油橄欖品種都可歸類為極易感染、容易感染或較易感染三類。而我國(guó)大多數(shù)推廣栽培品種來(lái)源于西班牙。因此,掌握感染炭疽病油橄欖果的真菌區(qū)系變化特征對(duì)我國(guó)油橄欖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】炭疽病是一種危害性較強(qiáng)的真菌性病害,主要危害葉片和果實(shí),常引起大量落葉、落果和枯梢,以及果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量降低[7]。炭疽病的病原菌主要為刺盤孢屬(Colletotrichum)真菌,可侵染草莓、茶樹、辣椒、油橄欖等30多種植物,嚴(yán)重?fù)p害植物品質(zhì),造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[8-11]。時(shí)全昌[12]1979年研究指出油橄欖炭疽病是由刺盤孢菌屬(Colletotrichumsp.)侵染所致。2018年,張知曉等[11]對(duì)云南永仁油橄欖炭疽病病原菌進(jìn)行了分離鑒定,進(jìn)一步確定了我國(guó)油橄欖炭疽病的主要病原菌為盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(C.gloeosporioides)。同時(shí),王敬文[13]研究發(fā)現(xiàn),盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢主要以孢子侵染果實(shí),侵染后能分泌對(duì)油橄欖組織發(fā)生毒害的化合物,該毒素對(duì)油橄欖原生質(zhì)體具有毒害作用,能使最敏感的愈傷組織在短時(shí)間內(nèi)壞死,從而毒害油橄欖。【本研究切入點(diǎn)】雖然當(dāng)前研究已經(jīng)分離鑒定出油橄欖炭疽病的病原菌,并形成一定的防治技術(shù)[14],但對(duì)炭疽病病原菌與健康果實(shí)原有微生物之間的互作關(guān)系尚不知曉?？蓮奈⑸锷鷳B(tài)學(xué)角度,進(jìn)一步探明感染炭疽病后油橄欖果實(shí)內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)和多樣性變化,為全面解析感染炭疽病后油橄欖果實(shí)各部位微環(huán)境和生理變化提供依據(jù)[15]。另外,日益成熟的高通量測(cè)序技術(shù)[16]為微生物多樣性研究提供了更加可靠的技術(shù)支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用高通量測(cè)序技術(shù),探究炭疽病油橄欖果實(shí)和健康果實(shí)的真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的差異,為油橄欖炭疽病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于四川省成都市金堂縣淮口產(chǎn)業(yè)科技綜合示范園油橄欖種植區(qū)(104°08′ E,30°11′ N,海拔432 m),屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。種植區(qū)于2009年開始種植油橄欖,栽培密度4 m×4 m,主要栽培品種有阿貝基娜、皮瓜爾和萊星,種植面積約5153.33 hm2。區(qū)內(nèi)氣候條件、栽培管理措施和水肥用量基本一致,年平均氣溫16.9 ℃,年均降水量760 mm,濕度大,年平均日照1295.5 h,土壤類型為黃壤。研究區(qū)內(nèi)油橄欖炭疽病在各品種上均有發(fā)生。油橄欖炭疽病主要影響果實(shí),對(duì)樹木生長(zhǎng)無(wú)影響。

1.2 樣品采集

2020年12月10日,于研究區(qū)內(nèi)選擇3塊空間位置相對(duì)獨(dú)立、種植面積不小于300 m2且有油橄欖炭疽病發(fā)生的橄欖種植田塊進(jìn)行調(diào)查。每個(gè)田塊上不分品種隨機(jī)采集健康果實(shí)和發(fā)病果實(shí),按照發(fā)病程度分為健康果實(shí)(CK)、發(fā)病前期果實(shí)(MP)和發(fā)病后期果實(shí)(SP)。果實(shí)未變質(zhì)為健康果實(shí),果實(shí)變質(zhì)部分少于1/2為發(fā)病初期,果實(shí)整個(gè)部分全部變質(zhì)為染病發(fā)病后期(圖1)。每個(gè)園區(qū)CK、MP和SP的樣品采集量不低于100 g。采集后當(dāng)日帶回實(shí)驗(yàn)室,按照無(wú)菌棉花富集法[17]采集果皮(Peel)上的真菌群落,然后果實(shí)表面消毒后在無(wú)菌條件下將果皮、果肉、種子完全分離開來(lái)。將無(wú)菌分離的果皮放入棉花富集法獲得的樣品中合為1個(gè)果皮真菌檢測(cè)的總樣品,將無(wú)菌分離的果肉(Flesh)作為1個(gè)果肉真菌檢測(cè)的總樣品。采集后的樣品按照發(fā)病程度、果實(shí)部位、來(lái)自第i個(gè)試驗(yàn)區(qū)分別編號(hào)為SP_peel_i、SP_flesh_i、MP_peel_i、MP_flesh_i、CK_peel_i和CK_flesh_i,編號(hào)后立即放入-80 ℃冰箱,用于DNA提取。

圖1 健康油橄欖果實(shí)、發(fā)病初期油橄欖果實(shí)和發(fā)病后期油橄欖果實(shí)對(duì)比Fig.1 Comparison of healthy fruits,mildly anthracnose diseased fruits and severe anthracnose diseased fruits

1.3 高通量測(cè)序分析

所有樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA提取和ITS1-2高通量測(cè)序。試劑盒擴(kuò)增引物為Read1 3′端和Read2 3′端。測(cè)序引物接頭分別為AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCC AGTCA和AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA GAGTGT,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300 bp[18]。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

為揭示真菌分類單元(Operational taxonomic units,OTU),本研究將序列進(jìn)行歸類操作(Cluster)。通過(guò)歸類操作,將序列按照彼此的相似性分為許多小組,1個(gè)小組就是1個(gè)OTU。通常按97%的相似度,對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

為揭示處理間真菌物種組成的差異性,本研究基于ImageGP平臺(tái)(http://www.ehbio.com/ImageGP/)開展韋恩(Venn)分析和群落結(jié)構(gòu)分析。為比較不同組間標(biāo)志性物種差異,本研究基于微科盟生科云平臺(tái)(https://bioincloud.tech/)平臺(tái),開展了線性判別分析(Linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe)。真菌功能類群利用第三方工具FUNGuild v1.0 完成。為揭示處理間物種的多樣性,本研究采用ACE指數(shù)[19](Abundance-based coverage estimators)和Chao指數(shù)[20](Chao’s index)表征物種的豐富度,用Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon evenness指數(shù)代表群落內(nèi)物種的多樣性。Shannon指數(shù)是物種豐富度和分布均勻度的綜合度量,Shannon指數(shù)越大則群落多樣性越高。Simpson指數(shù)反映了群落中個(gè)體數(shù)量分布的集中度,Simpson指數(shù)越高表明群落中個(gè)體越集中在少量?jī)?yōu)勢(shì)物種上,群落優(yōu)勢(shì)度越大,群落分布不均勻,多樣性低。Shannon evenness指數(shù)描述群落均勻性,Shannon evenness指數(shù)越高,代表群落分布越均勻,多樣性越高。本研究基于SPSS 23.0軟件,采用單因素(One-way ANOVA)和Duncan法多重比較(α=0.05)分析了發(fā)病程度和果實(shí)部位對(duì)群落多樣性指數(shù)、相對(duì)豐富度的影響(P<0.05)。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌分類單元結(jié)構(gòu)特征

測(cè)序結(jié)果顯示,6個(gè)處理測(cè)出真菌覆蓋率均大于99%,檢測(cè)結(jié)果有效(表1)。由表2可知,油橄欖果實(shí)的18個(gè)樣本中共獲得有效真菌序列80 182條。堿基數(shù)在10 396 294～28 667 930 bp,平均堿基數(shù)為19 637 830 bp,堿基長(zhǎng)度在42～490 bp,真菌序列長(zhǎng)度高度集中于200～300 bp,平均有效長(zhǎng)度245 bp。將有效序列在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類,分別獲得有效真菌分類單元(OTU)1596個(gè)。其中果皮有真菌OTU 939個(gè),果肉有真菌OTU 921個(gè)。

表1 采集樣品真菌檢測(cè)覆蓋率

表2 各樣本有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

由圖2可知,6個(gè)分組的全部OTU為1022個(gè)。其中,共有OTU為317個(gè),占全部OTU的34.64%。SP_peel組特有的OTU數(shù)為46,占全部OTU的4.50%;SP_flesh組特有的OTU數(shù)為18,占全部OTU的1.76%;MP_peel組特有的OTU數(shù)為31,占全部OTU的3.03%;MP_flesh組特有的OTU數(shù)為48,占全部OTU的4.70%;CK_peel組特有的OTU數(shù)為68,占全部OTU的6.65%;CK_flesh組特有的OTU數(shù)為46,占全部OTU的4.50%。綜上可知,6個(gè)分組中真菌的共有菌較多,各組中特有菌占比均不高,其中CK_peel組特有菌數(shù)最多,說(shuō)明健康果皮的特有真菌物種最豐富。

圖2 六組樣品中真菌韋恩圖Fig.2 Venn diagram on fungi identified in six sample groups

2.2 真菌類群多樣性變化分析

由表3可知,Chao指數(shù)對(duì)發(fā)病程度和果實(shí)部位均無(wú)明顯響應(yīng);Ace指數(shù)對(duì)發(fā)病程度無(wú)顯著響應(yīng),差異主要是由果實(shí)部位所決定,結(jié)合表4可知,果肉的Ace指數(shù)顯著高于果皮。由此推斷,果肉真菌的種類數(shù)高于果皮。

由表3可知,發(fā)病程度顯著影響了果皮和果肉中真菌群落的多樣性。由表4可知,染病后,果皮和果肉上真菌群落的Shannon和Shannon evenness指數(shù)均顯著降低。隨著染病程度的加重,果皮真菌的Shannon和Shannon evenness指數(shù)呈先降低后升高趨勢(shì),果肉部位則隨著病情的加重呈持續(xù)降低趨勢(shì)。染病后,果皮和果肉上真菌群落的Simpson指數(shù)顯著升高,果肉部位隨著病情的加重而持續(xù)升高,果皮部位呈先升高后降低趨勢(shì)。

表3 發(fā)病程度和果實(shí)部位對(duì)油橄欖果實(shí)真菌群落多樣性指數(shù)的影響

表4 油橄欖果實(shí)真菌群落多樣性指數(shù)

以上結(jié)果表明,炭疽病感染顯著降低了油橄欖果真菌群落的多樣性,且其主要通過(guò)改變?nèi)郝渲袀€(gè)體數(shù)量在種間的分布來(lái)影響群落多樣性。感染炭疽病后,真菌群落種類豐富度指數(shù)變化不明顯,但優(yōu)勢(shì)物種數(shù)量增加顯著,導(dǎo)致群落優(yōu)勢(shì)度增加,均勻度下降,多樣性降低。另外,真菌群落多樣性在果皮和果肉的變化趨勢(shì)表現(xiàn)出差異,染病后期果皮真菌多樣性呈回升趨勢(shì)。

2.3 不同分類水平上真菌相對(duì)豐度的響應(yīng)

樣品檢測(cè)出的真菌分屬于2門9綱17目21科25屬。其中,健康的果皮中有2門6綱12目11科12屬13種,患病果皮中有2門5綱7目7科8屬11種;健康果肉中有2門5綱10目12科13屬16種,患病果肉中有2門5綱10目7科4屬7種。各時(shí)期和各部位的優(yōu)勢(shì)菌門均為子囊菌門(Ascomycota)。

由表5可知,排名前5的真菌類群均對(duì)發(fā)病程度有顯著響應(yīng)。在不同分類水平上,對(duì)果實(shí)部位有顯著響應(yīng)的包括門水平下的子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota),綱水平下的銀耳綱(Tremellomycetes),目水平下的座囊菌目(Dothideales)和煤炱目(Capnodiales),科水平下的短梗霉科(Aureobasidiaceae)、錐梗菌科(Dissoconiaceae),屬水平下的短梗霉屬(Aureobasidium)、烏氏霉屬(Uwebraunia),以及種水平下的黑酵母菌(AureobasidiumpullulansSH1515141.08FU)和UwebrauniaaustraliensisSH1930250.08FU。此外,除擲孢酵母屬(Sporobolomyces)及其下的Sporobolomycessymmetricus外,在門、綱、目、科、屬、種水平上排名前5的真菌類群均對(duì)發(fā)病程度與果實(shí)部位的交互作用具有顯著響應(yīng)。表明炭疽病的發(fā)生顯著改變了真菌群落結(jié)構(gòu),且不同菌群在果皮、果肉的變化存在一定差異。

表5 不同分類水平上真菌相對(duì)豐度對(duì)發(fā)病程度和果實(shí)部位的響應(yīng)

2.3.1 果皮真菌相對(duì)豐度對(duì)發(fā)病程度的響應(yīng) 從門水平上看,在健康果實(shí)果皮上,子囊菌門占比84.71%,染病初期上升至94.93%,染病后期又下降至86.03%。與之相反,健康果皮中擔(dān)子菌門占比15.03%,染病初期下降為4.63%,染病后期增加至13.47%(圖3-A)。

從屬水平上看,健康果皮中排名前5的優(yōu)勢(shì)菌屬分別是假尾孢屬(Pseudocercospora)、核盤菌屬(Sclerotinia)、烏氏霉屬、Symmetrospora、刺盤孢屬,占比分別為33.97%、16.74%、10.67%、10.62%、9.39%。發(fā)病后假尾孢屬和核盤菌屬占比均小于0.01%,說(shuō)明炭疽病對(duì)其具有明顯的抑制作用。病原菌刺盤孢屬在健康果皮中占比僅為9.39%,在發(fā)病后相對(duì)豐度迅速升高,達(dá)到86.97%,但到發(fā)病后期,下降到70.02%。此外,在健康和初病油橄欖果果皮中占比均較少的Bisifusarium屬、漢納酵母屬(Hannaella)、鐮刀菌屬(Fusarium)真菌在染病后期數(shù)量大量增加,其相對(duì)豐度增長(zhǎng)超過(guò)10倍(圖3-B)。

2.3.2 果肉真菌相對(duì)豐度對(duì)發(fā)病程度的響應(yīng) 在果肉中,健康組子囊菌門占比89.85%,發(fā)病初期為91.09%,發(fā)病后期為97.41%,呈隨炭疽病加重而占比增加趨勢(shì)。而擔(dān)子菌門在健康果實(shí)果皮中占比9.67%,染病初期為8.46%,染病后期為2.14%,呈隨炭疽病加重而占比降低趨勢(shì)。此外,子囊菌門在各個(gè)時(shí)期均為占比約90%的優(yōu)勢(shì)菌門(圖4-A)。

在屬水平上,健康果肉中排名前5的優(yōu)勢(shì)菌屬分別是黑孢霉屬(Nigrospora)、短梗霉屬、刺盤孢屬、unclassified_Pleosporales屬、藍(lán)盤伯菌屬(Lambertella),占比分別為30.28%、21.13%、12.28%、7.10%、6.91%。發(fā)病后,黑孢霉屬占比小于0.50%,說(shuō)明炭疽病對(duì)其有明顯的抑制作用。短梗霉屬占比也明顯降低,發(fā)病初期下降至10.6%,染病后期占比僅1.59%,下降92.47%。而刺盤孢屬在發(fā)病中期占比上升至72.31%,在發(fā)病后期占比增加至91.38%。說(shuō)明炭疽病病原菌刺盤孢屬在發(fā)病后迅速成為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群。此外,在健康果肉中占比較少的假絲酵母菌屬(Candida)在發(fā)病初期增加最迅速,相對(duì)豐度增長(zhǎng)超過(guò)30倍(圖4-B)。

2.4 真菌群落的LEfSe差異分析

采用LEfSe[21]分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物(Biomarker),不同樣本中的生物標(biāo)志物通過(guò)線性判別分析效應(yīng)大小,LDA score大于3.0的為顯著差異物種。分析結(jié)果(圖5)顯示,炭疽病感染降低了油橄欖果的標(biāo)志真菌種類的數(shù)量,改變了標(biāo)志真菌的種類。健康果皮的差異真菌有2綱5目7科9屬,染病初期、后期均僅有1綱1目1科1屬;健康果肉的差異真菌有3綱8目12科14屬,CK和SP處理也僅有1綱1目1科1屬。果皮上,健康果皮的差異指示菌屬為假尾孢屬和核盤菌屬在內(nèi)的9個(gè)屬;MP處理的差異指示菌屬為刺盤孢屬,染病后期的差異指示菌屬則為漢納酵母屬;果肉上,健康果肉的差異指示菌屬為短梗霉屬和黑孢霉屬在內(nèi)的14個(gè)屬,染病中期的差異指示菌屬為假絲酵母菌屬,染病后期的的差異指示菌屬為刺盤孢屬。

圖3 果皮真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of fungi community in peel

圖4 果肉真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of fungi community in flesh

2.5 真菌的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)分析

從表6可以看出,在果皮部位,各營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的真菌豐富度在不同患病期的數(shù)量呈4種變化趨勢(shì)。首先,除了兼共營(yíng)養(yǎng)和腐生病理型、腐生共生型外,其余幾類真菌在健康果皮上的豐富度均與患病時(shí)存在顯著差異。其中,病理營(yíng)養(yǎng)型、腐生病理型、腐生營(yíng)養(yǎng)型CK均顯著高于SP和MP,共生病理型CK顯著低于SP和MP,而健康果皮上(CK)共生營(yíng)養(yǎng)型真菌顯著低于患病后期(SP)但顯著高于患病初期(MP)。

在果肉部位,僅共生病理型真菌在患病后相對(duì)豐度顯著升高,CK顯著低于SP和MP。其余6類真菌的相對(duì)豐度在患病后均表現(xiàn)為顯著降低,CK顯著高于SP和MP。

圖5 基于LEfSe分析的各處理的指數(shù)物種Fig.5 Indicator species for each treatment based on LEfSe analysis

從以上結(jié)果可知,共生病理型是油橄欖果實(shí)感染炭疽病菌后的優(yōu)勢(shì)菌群;除共生營(yíng)養(yǎng)型真菌外,其他營(yíng)養(yǎng)型的真菌在感染炭疽病后,果皮和果實(shí)部位的變化都較一致,患病后共生病理型真菌數(shù)量均呈上升趨勢(shì),病理營(yíng)養(yǎng)型、腐生營(yíng)養(yǎng)型、兼共營(yíng)養(yǎng)和腐生病理型、腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌均呈下降趨勢(shì)。

3 討 論

內(nèi)生菌是植物與微生物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化形成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜并處于動(dòng)態(tài)變化的功能體,廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等各個(gè)器官中,對(duì)植物的生長(zhǎng)、繁殖和健康發(fā)揮著重要作用[22-24]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序手段研究了炭疽病感染對(duì)油橄欖果實(shí)內(nèi)生真菌群落的影響。結(jié)果表明,油橄欖果感染炭疽病后,真菌群落多樣性顯著降低。這與預(yù)期及已有的諸多研究結(jié)果相似,已有的研究表明,植物染病后,病原菌的侵染往往會(huì)打破植物體內(nèi)微生物群原有的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)[22]。彭芳芳等[25]對(duì)桑果內(nèi)生菌的研究發(fā)現(xiàn),感染菌核病的桑果,其果實(shí)內(nèi)生真菌多樣性遠(yuǎn)小于健康果實(shí)。與之相似,劉曉菲等[26]對(duì)黃龍病罹病柑橘葉片的研究,以及謝憲等[27]對(duì)感染枯梢病赤松針葉的研究,也證實(shí)病原菌侵染會(huì)降低植物內(nèi)生真菌群落的多樣性。這可能是因?yàn)椴≡拇罅糠敝?一方面改變了內(nèi)生真菌的生態(tài)環(huán)境,使之不利于原有菌群的生長(zhǎng),另一方面大量的病原菌通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)空間、資源或分泌有害物質(zhì),抑制原生真菌的生長(zhǎng)。金勤[28]研究指出,炭疽病主要通過(guò)產(chǎn)生侵入釘侵入寄主細(xì)胞,侵入后從表皮細(xì)胞逐漸擴(kuò)展到柵欄組織,然后進(jìn)入到海綿組織中,逐漸殺死周圍細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示,炭疽病病原菌的擴(kuò)張是導(dǎo)致油橄欖果真菌群落多樣性降低的重要因素。多樣性和豐富度指數(shù)的變化也顯示,染病后油橄欖果中真菌種類數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定,但是優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量擴(kuò)張,顯著抑制了其他菌群的生長(zhǎng),改變了群落內(nèi)部結(jié)構(gòu),導(dǎo)致真菌群落的多樣性顯著降低,而最大的優(yōu)勢(shì)菌群則是炭疽病病原菌。各分類水平上各菌群相對(duì)豐度的分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。在門水平上,果皮和果肉的優(yōu)勢(shì)菌門在各個(gè)時(shí)期都為子囊菌門,在屬水平上,染病后刺盤孢屬迅速成為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群,占比始終高于70%。

表6 各處理真菌的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)差異

植物抗病性與植物內(nèi)生真菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。生態(tài)系統(tǒng)微生物群落多樣性越低,植株抵抗病原菌侵害的能力越低[29-31]。感染炭疽病后油橄欖果真菌多樣性降低,暗示其抗病能力可能降低。而研究結(jié)果顯示,油橄欖果感染炭疽病后期,除了炭疽病病原菌,果皮中其它病原菌菌屬,如Bisifusarium屬、漢納酵母屬、鐮刀菌屬在重病時(shí)期也明顯增加。這一結(jié)果說(shuō)明,炭疽病發(fā)病后期,油橄欖果可能會(huì)并發(fā)多種病害。姜莉莉等[32]對(duì)染病“香玲”核桃果的研究也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。感染炭疽病后,核桃果中其他病原菌,如赤霉菌屬、葡萄座腔菌屬(干腐病菌)等病原菌的相對(duì)豐度也明顯提高。由此可見(jiàn),炭疽病防治不僅要防治炭疽病,還要全面考慮其他病原菌的發(fā)生情況,進(jìn)行綜合防治。

本研究還發(fā)現(xiàn),在炭疽病侵染過(guò)程中,油橄欖果皮、果實(shí)真菌群落多樣性變化趨勢(shì)呈現(xiàn)差異性。果皮真菌群落的多樣性在染病后期有所回升,這可能是由于果皮啟動(dòng)了對(duì)病菌的防御機(jī)制。已有的研究發(fā)現(xiàn)[7,33],感染炭疽病后,植物果皮中抗真菌二烯、酚類物質(zhì)等濃度升高,可有效抑制炭疽病病原菌的生長(zhǎng)。此外,植物內(nèi)生菌中有一些是天然的生防菌,能抑制病原菌的生長(zhǎng),并且在與病原菌共處的過(guò)程中種群及其抗菌能力得到強(qiáng)化[30-32]。本研究中,染病后期果皮上共生營(yíng)養(yǎng)型真菌數(shù)量顯著回升,且顯著高于健康果實(shí),雙胞雙鐮孢(Bisifusariumdimerum)、Peniophorarufomarginata、Fusicollaviolacea這些共生營(yíng)養(yǎng)型真菌有可能就是油橄欖果潛在的抗炭疽病生防菌。其中Fusicollaviolacea被研究證明對(duì)引發(fā)獼猴桃軟腐病的交鏈孢霉屬具有拮抗作用,有一定生防效果[34]。

本研究中,部分真菌對(duì)炭疽病感染較敏感。果皮中假尾孢屬和核盤菌屬對(duì)炭疽病病原菌的響應(yīng)最明顯,為炭疽病病原菌敏感菌。LEFse分析結(jié)果顯示,假尾孢屬和核盤菌屬為健康果皮差異的指示菌群。在果肉中,發(fā)病后黑孢霉屬和短梗霉屬兩種優(yōu)勢(shì)菌屬均明顯降低,LEFse分析結(jié)果顯示它們?yōu)榻】倒庵械闹甘揪褐?。由此可?jiàn),假尾孢屬和核盤菌屬可作為油橄欖果炭疽病感染早期的指示菌,黑孢霉屬和短梗霉屬則可作為炭疽病病原菌入侵果肉的指示菌群。

4 結(jié) 論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù),分析了感染炭疽病對(duì)油橄欖果真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。研究得出:①炭疽病感染顯著改變了油橄欖果果皮和果實(shí)中真菌群落的結(jié)構(gòu)。感染炭疽病后,油橄欖果真菌豐富度指數(shù)變化不顯著,但各分類水平上各類群間的相對(duì)豐富度明顯改變,群落的多樣性顯著降低,表明感染炭疽病后,由于病原菌數(shù)量的增長(zhǎng),改變了菌群間個(gè)體數(shù)量的分布,降低了真菌群落多樣性;②果皮中的假尾孢屬和核盤菌屬,果肉中的黑孢霉屬和短梗霉屬為炭疽病病原菌敏感菌,可作為油橄欖果炭疽病感染早期的指示菌;③染病后期果皮上共生營(yíng)養(yǎng)型真菌數(shù)量顯著回升,可能是抗炭疽病生防菌菌群來(lái)源,可作進(jìn)一步篩選;④油橄欖果感染炭疽病后期,除了炭疽病病原菌,果皮中其它病原菌菌屬,如Bisifusarium屬、漢納酵母屬、鐮刀菌屬在重病時(shí)期也明顯增加,提示炭疽病防治需要針對(duì)這些菌群進(jìn)行綜合防治。