張蒙,王新東

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210028;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

心肌細胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡是心臟功能正常的關(guān)鍵因素。冠心病心肌缺血、缺氧狀態(tài)下發(fā)生脂肪酸代謝向糖酵解轉(zhuǎn)變[1],可產(chǎn)生過量乳酸引起細胞外和細胞內(nèi)pH值顯著下降,在急性心肌梗死患者中可降至6.0～6.5[2],導(dǎo)致心肌細胞外酸化,進而形成酸性微環(huán)境。細胞外酸化可誘導(dǎo)中性粒細胞活化而促進炎癥[3],在炎癥相關(guān)的心肌損傷中起到重要的作用。因此,闡明缺血缺氧心肌細胞外酸性微環(huán)境在心肌炎癥中的作用及其潛在的分子機制有助于臨床策略的制定和藥理學(xué)靶點的研究。

酸敏感離子通道(ASICs)是一類細胞外H+活化的陽離子通道,屬上皮鈉通道(ENaC)/降解蛋白(DEG)超家族[4]。心肌細胞主要表達ASICs亞基ASIC1a。作為細胞膜上的酸受體,ASICs將細胞外微環(huán)境的低pH信號傳遞到細胞中誘導(dǎo)一系列病理變化[5]。ASIC1a可介導(dǎo)細胞外Ca2+流入,Ca2+作為重要的第二信使,參與下游的炎癥等病理過程[6-7]。Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在缺血損傷的心肌細胞死亡反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[8],CaMKⅡδ是心臟中的主要亞型。細胞焦亡是由caspase-1、caspase-4、caspase-5及其效應(yīng)子gasdermin家族介導(dǎo)的一種的程序性炎癥死亡方式。NLRP3炎癥小體的激活是細胞焦亡的經(jīng)典途徑。CaMKⅡδ介導(dǎo)的心肌細胞炎癥基因表達和炎癥小體激活引發(fā)炎癥并誘導(dǎo)心肌纖維化重塑[9]。目前尚不清楚ASIC1a是否通過CaMKⅡδ-NLRP3信號參與心肌缺血缺氧后的炎癥損傷病理過程。

益氣活血是冠心病心肌缺血的經(jīng)典治法。補氣藥黃芪和活血藥丹參的配伍應(yīng)用是益氣活血法的代表性“藥對”,具有抗心肌缺血性重構(gòu)、調(diào)節(jié)缺血后能量代謝重編程、抗炎及Ca2+通道調(diào)控等效應(yīng)[10-13]。本研究擬對黃芪丹參配伍調(diào)控ASIC1a/CaMKⅡδ信號保護酸性微環(huán)境中心肌細胞焦亡的機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 細胞

H9c2大鼠心肌細胞(Procell公司,貨號:CL-0089)在專用培養(yǎng)基(Procell公司,貨號:CM-0089,主要成分DMEM+10% FBS+1% P/S)中，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

胎牛血清(Gibco,貨號:C0235),Lactate(邁瑞爾,貨號:50-21-5),NS383(MCE公司,貨號:HY-131879),Nocistatin Peptide(Abbiotec公司,貨號:350301),Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma公司,貨號：APOAF),Fluo 3-AM(Dojindo公司,貨號:JU887),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒(Takara公司,貨號:RR036A、RR820A),PVDF膜(Millipore公司),CCK-8試劑盒、Trizol、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天公司,貨號:C0037、R0016、P0012S、P0018FS),ASIC1a抗體(Ptoteintech公司,貨號:27235-1-AP),CaMKⅡδ抗體、NLRP3抗體、Caspase-1抗體、GSDMD抗體和GAPDH抗體(Abcam公司,貨號:ab300563、ab181052、ab263899、ab138483、ab219800、ab9485)。

1.3 儀器

超凈工作臺(ESCO公司,型號:ACB-6E1),CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司,型號:310370),多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司,型號:Varioskan LUX),熒光倒置顯微鏡(Carl Zeiss公司,型號:Multiplex SR-2Y),流式細胞儀(BECKMAN COULTER公司,型號:CytoFLEX),Real-Time PCR循環(huán)儀(Bio-Rad公司,型號:CFX Opus Deepwell),電泳儀(Bio-Rad公司,型號:PowerPac),化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,型號:ChemiDocTMTouch)。

1.4 藥物制備

黃芪丹參提取物(HQ)的制備:生黃芪和丹參飲片購自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房。取黃芪6 kg,丹參3 kg,加水熱回流提取1.5 h后過濾,重復(fù)2次合并濾液,減壓濃縮為稠浸膏。用95%乙醇稀釋稠浸膏,調(diào)節(jié)含醇量為70%。靜置沉淀后取上清,105 ℃下減壓干燥48 h,制成HQ干粉。每1 g HQ干粉相當于5 g處方量。

含HQ的細胞干預(yù)藥物制備:稱取適量的提取物干粉加入PBS于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱充分溶解,12 000 r·min-1離心5 min×2次,上清以0.45 μm濾器過濾后再于超凈工作臺內(nèi)用0.22 μm濾器將藥液過濾除菌,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HQ細胞干預(yù)藥物的濃度測定:分別取按上法制備的HQ細胞干預(yù)藥物100、500 μL和1 mL置于3支1.5 mL離心管中,放入60 ℃烘箱中48 h充分蒸發(fā)水分。將烘干的離心管分別稱質(zhì)量。加藥前后2次稱取離心管質(zhì)量的差值即為對應(yīng)體積的藥液的含藥量,計算濃度并取平均值。

1.5 CCK-8法檢測細胞活力

1.5.1 檢測正常培養(yǎng)環(huán)境中細胞活力

取對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化制成細胞懸液,按每孔1×103個接種到96孔板中。細胞分為空白組(Blank,調(diào)零組)、對照組(Control)、HQ(0.1、1、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1)組。各組均使用H9c2專用培養(yǎng)基模擬正常培養(yǎng)環(huán)境，分別加入相應(yīng)濃度的HQ。培養(yǎng)結(jié)束后，使用酶標儀測定吸光度。

1.5.2 檢測PH 6.5酸性環(huán)境中細胞活力

細胞分為空白組(Blank，調(diào)零組)、對照組(Control)、HQ(20、40、60、80μg·mL-1)組。各分組加入相應(yīng)濃度的HQ處理2 h，除Blank組外，其余組再用 20 mmol·mL-1Lactate處理24 h，維持培養(yǎng)基pH 6.5。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 μL CCK-8工作液，使用酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.6 細胞分組與干預(yù)

選擇對數(shù)生長期的細胞進行實驗?；诩毎盍x擇HQ的濃度。將H9c2細胞分為3組:①對照組(Control):細胞正常培養(yǎng);②pH 6.5酸性環(huán)境模型組(Model):細胞用20 mmol·L-1Lactate處理24 h,維持培養(yǎng)基pH 6.5;③HQ+Nocistatin組:60 μg·mL-1HQ預(yù)處理細胞2 h,繼用1 mmol·L-1Nocistatin預(yù)處理1 h,再用20 mmol·L-1Lactate處理24 h;④HQ組:60 μg·mL-1HQ預(yù)處理細胞2 h,再用20 mmol·L-1Lactate處理24 h;⑤NS383組:1 μmol·L-1NS383預(yù)處理細胞1 h,再用20 mmol·L-1Lactate處理24 h。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將細胞分組處理后,用預(yù)冷的PBS清洗3次。離心并重懸后,根據(jù)試劑盒的說明,用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC對細胞進行染色。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 免疫熒光實驗

細胞分組干預(yù),PBS沖洗后放入4%多聚甲醛固定20 min,隨后加入0.5% Triton X-100通透15 min,滴加5%BSA均勻覆蓋細胞,室溫條件下進行封閉30 min。滴加一抗,將細胞放入濕盒中,恒溫4 ℃的條件下孵育過夜。室溫環(huán)境中熒光二抗(Cy3標記)孵育50 min。DAPI染液室溫孵育10 min后用熒光倒置顯微鏡進行圖像采集。

1.9 qPCR實驗

用TRIzol試劑從各組細胞中提取總RNA,測定RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用PCR系統(tǒng)進行實時反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參,計算各組相應(yīng)基因的2-ΔΔCt值。引物序列表1所示。

表1 特定引物序列Table 1 Specific primer sequences

1.10 Western blot分析

使用裂解緩沖液從不同組的H9c2細胞中提取總蛋白并通過BCA定量。將蛋白質(zhì)加載到SDS-PAGE中并通過電泳分離。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在TBST中用5%脫脂牛奶封閉1 h后,將膜與一抗(ASIC1a,1∶1 000;CaMKⅡδ,1∶1 000;NLRP3,1∶1 000;Caspase-1,1∶1 000;GSDMD,1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。用TBST洗滌膜,并與相應(yīng)的二抗(1∶5 000)在室溫下孵育。運用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)條帶,Image J軟件分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HQ促進pH 6.5酸性環(huán)境中降低的細胞活力

細胞在正常的培養(yǎng)環(huán)境中與Control組相比,HQ在0.1～100 μg·mL-1對細胞活力無明顯影響(圖1A)。在pH 6.5酸性環(huán)境中與Blank組相比,細胞活力顯著降低(P<0.01);與Control組比較,HQ對細胞活力具有顯著促進作用,尤其是60、80 μg·mL-1濃度組(P<0.01),且60 μg·mL-1優(yōu)于80 μg·mL-1濃度組(P<0.05),因此本研究選用60 μg·mL-1濃度作為細胞干預(yù)劑量(圖1B)。此結(jié)果提示HQ具有保護pH 6.5酸性環(huán)境中細胞凋亡的作用。

注:與Blank組相比,**P<0.01;與Control組相比,##P<0.01;與HQ 60 μg·mL-1組相比,▲圖1 CCK8檢測細胞活力Fig.1 CCK8 assay for cell viability

2.2 HQ抑制pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞凋亡

本研究進一步采用流式細胞術(shù)檢測pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞凋亡,結(jié)果顯示:pH 6.5酸性環(huán)境可誘導(dǎo)細胞凋亡明顯增加(P<0.01),HQ和ASIC1a抑制劑NS383均可減少酸性環(huán)境中的心肌細胞凋亡(P<0.01),且HQ的這種保護效應(yīng)可被ASIC1a激動劑Nocistatin逆轉(zhuǎn),提示HQ對酸性環(huán)境中的心肌細胞凋亡的保護效應(yīng)與調(diào)控ASIC1a酸敏感Ca2+通道有關(guān)(圖2)。

注:Q1-UL.壞死細胞；Q1-UR.晚期凋亡細胞；Q1-LL.正常細胞；Q1-LR.早期凋亡細胞。與Control組相比,**P<0.01;與Model組相比,##P<0.01;與HQ組相比,圖2 流式細胞術(shù)檢測各組pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞凋亡Fig.2 Flow cytometry detection of cardiomyocyte apoptosis in the acidic environment of pH 6.5 in each group

2.3 HQ抑制pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞ASIC1a表達

為明確HQ對心肌細胞酸敏感離子通道ASIC1a的影響,本研究采用免疫熒光檢測pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞中ASIC1a表達情況,結(jié)果顯示:pH 6.5酸性環(huán)境可誘導(dǎo)ASIC1a蛋白表達明顯增加(P<0.01),HQ和ASIC1a抑制劑NS383均可明顯降低酸性環(huán)境中ASIC1a表達(P<0.01),且HQ的這種保護效應(yīng)可被ASIC1a激動劑Nocistatin逆轉(zhuǎn),提示HQ對酸性環(huán)境中心肌細胞的抑制效應(yīng)與調(diào)控ASIC1a有關(guān)(圖3)。

注:比例尺=50 μm。與Control組相比,**P<0.01;與Model組相比,##P<0.01;與HQ組相比,▲

2.4 HQ下調(diào)pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及GSDMD mRNA表達

本研究分析了NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡信號相關(guān)基因mRNA表達,結(jié)果顯示:pH 6.5酸性環(huán)境可誘導(dǎo)H9c2心肌細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及GSDMD mRNA表達明顯增加(P<0.01),HQ和ASIC1a抑制劑NS383均可顯著下調(diào)酸性環(huán)境中的以上基因mRNA表達(P<0.01),且HQ的下調(diào)效應(yīng)可被ASIC1a激動劑Nocistatin逆轉(zhuǎn),提示HQ對酸性環(huán)境中的心肌細胞損傷的保護效應(yīng)與抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡有關(guān)(圖4)。

注:與Control組相比,**P<0.01;與Model組相比,##P<0.01;與HQ組相比,▲圖4 pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及GSDMD mRNA表達比較Fig.4 Comparison of cardiomyocytes mRNA expression of NLRP3, Caspase-1, IL-1β and GSDMD in the acidic environment of pH 6.5

2.5 HQ下調(diào)pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞ASIC1a、CaMKⅡδ、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD及GSDME-N蛋白表達

Western blot分析各組心肌細胞ASIC1a、CaMKⅡδ、NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達的結(jié)果顯示:pH 6.5酸性環(huán)境可誘導(dǎo)心肌細胞ASIC1a、CaMKⅡδ、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD及GSDME-N蛋白表達明顯增加(P<0.01),HQ和ASIC1a抑制劑NS383均可顯著下調(diào)酸性環(huán)境中的以上基因蛋白表達(P<0.05,P<0.01),且HQ對以上蛋白的下調(diào)效應(yīng)均可被ASIC1a激動劑Nocistatin逆轉(zhuǎn)(P<0.05,P<0.01),提示HQ對酸性環(huán)境中的心肌細胞損傷的保護效應(yīng)與調(diào)控ASIC1a介導(dǎo)的CaMKⅡδ表達和相關(guān)的抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡有關(guān)(圖5)。

注:與Control組相比,**P<0.01;與Model組相比,#P<0.05,##P<0.01;與HQ組相比,▲圖5 pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞ASIC1a、CaMKⅡδ、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD及GSDME-N蛋白表達比較Fig.5 Comparison of cardiomyocytes protein expression of ASIC1a, CaMKⅡδ, NLRP3, Caspase-1, Cleaved Caspase-1, GSDMD and GSDME-N in the acidic environment of pH 6.5

3 討論

乳酸和相關(guān)的H+離子可在冠心病心肌組織缺氧或在能量代謝從氧化磷酸化重編程為糖酵解的過程中產(chǎn)生。在缺氧的情況下,大部分丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸,由乳酸轉(zhuǎn)運蛋白單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4(MCT4)向外轉(zhuǎn)運到細胞外環(huán)境,進而形成酸性微環(huán)境[14]。酸性微環(huán)境是缺血缺氧心肌在能量代謝重編程的狀態(tài)下形成的細胞微環(huán)境,對心肌細胞的存活和損傷可產(chǎn)生重要影響,但具體機制仍有待闡釋。心肌細胞炎性損傷是缺血缺氧的關(guān)鍵結(jié)果,乳酸作為糖酵解的產(chǎn)物在誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活導(dǎo)致炎癥損傷方面發(fā)揮重要作用[15]。黃芪丹參配伍作為冠心病的經(jīng)典治療藥對,臨床療效確切,我們前期的研究結(jié)果提示其部分機制與調(diào)節(jié)缺血缺氧心肌的能量代謝重編程有關(guān)[13]。在本研究中我們進一步證實了黃芪丹參提取物可調(diào)節(jié)酸性微環(huán)境下心肌細胞的細胞焦亡相關(guān)的炎癥損傷,并且其機制與調(diào)控酸敏感離子通道ASIC1a介導(dǎo)的CaMKⅡδ信號有關(guān)。

乳酸產(chǎn)生、酸中毒和缺氧通常被認為是心肌血流減少或阻斷后的重要病理進程。同時,高乳酸濃度還與缺血或衰竭心肌的能量重構(gòu)(代謝模式從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?,如糖酵解、增加的谷氨酰胺分解和血管的低灌注率等也有密切關(guān)聯(lián),導(dǎo)致乳酸在非缺氧區(qū)域的積累。乳酸不僅是心肌細胞所處微環(huán)境酸化的主要參與者,而且可作為“信號分子”的重要作用,參與心肌細胞存活和損傷的不同機制。因此,針對乳酸、酸性微環(huán)境及其相關(guān)的能量代謝重編程的調(diào)節(jié)是保護缺血缺氧心肌的重要臨床策略。NLRP3炎性小體由NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點樣銜接蛋白(ASC)和Caspase-1效應(yīng)蛋白組成,ASC連接上游的NLRP3和下游的Caspase-1。激活的NLRP3炎性小體參與由細胞焦亡引起的細胞損傷,GSDMD是細胞焦亡核心執(zhí)行蛋白。從本研究的結(jié)果可以看出,在乳酸誘導(dǎo)的pH 6.5酸性環(huán)境中心肌細胞活力顯著降低、凋亡明顯增加,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD等NLRP3炎癥體介導(dǎo)的細胞焦亡信號也明顯增加,提示酸性微環(huán)境對心肌細胞產(chǎn)生炎性損傷影響。而給予HQ干預(yù)可明顯保護心肌細胞減輕酸性微環(huán)境誘導(dǎo)的細胞凋亡和焦亡損傷,顯示了HQ對酸性微環(huán)境下心肌的保護效應(yīng)。

針對酸性微環(huán)境是從何種途徑誘導(dǎo)細胞焦亡炎性損傷的機制,我們進一步從酸敏感離子通道ASIC1a介導(dǎo)的CaMKⅡδ信號的視角開展了研究。結(jié)果顯示,在pH 6.5酸性微環(huán)境下ASIC1a明顯增加,提示ASIC1a介導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+作為第二信使參與了下游的焦亡損傷信號。心肌細胞Ca2+超載是缺血損傷的重要因素,可通過CaMKⅡ等下游信號引發(fā)一系列心肌細胞死亡和心肌功能障礙事件。CaMKⅡδ是心臟中的主要亞型,是藥物抑制的潛在靶點。持續(xù)的CaMKⅡ激活誘發(fā)程序性細胞死亡,包括細胞凋亡和壞死性凋亡,是其有害影響的關(guān)鍵潛在機制之一。CaMKⅡ整合β-腎上腺素能、Gq偶聯(lián)受體、活性氧(ROS)、高血糖、NLRP3炎癥小體[16]和促死亡細胞因子信號傳導(dǎo)[17],并加重不良代謝重編程[18]。藥理學(xué)抑制CaMKⅡδ可保護缺血心肌線粒體凋亡和炎癥[19]。本研究結(jié)果顯示,在pH6.5酸性微環(huán)境下,伴隨ASIC1a表達增加,CaMKⅡδ的蛋白表達也明顯增加,提示CaMKⅡδ可能作為中轉(zhuǎn)信號介導(dǎo)了酸性微環(huán)境-ASIC1a與細胞焦亡間的串話。HQ可抑制酸性微環(huán)境下ASIC1a和CaMKⅡδ激活,并且上述效應(yīng)可被ASIC1a激動劑逆轉(zhuǎn),提示HQ對酸性微環(huán)境中心肌細胞焦亡的抑制效應(yīng)與調(diào)控ASIC1a/CaMKⅡδ信號有關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)pH6.5酸性微環(huán)境下心肌細胞發(fā)生凋亡和NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)的細胞焦亡與酸敏感離子通道ASIC1a介導(dǎo)的CaMKⅡδ信號激活有關(guān),HQ可通過下調(diào)酸性微環(huán)境中ASIC1a/CaMKⅡδ信號保護心肌細胞免受凋亡和細胞焦亡損傷。