薛珊珊,柏璐,孫昕宸,吳擁軍

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,江蘇 南京 210023)

喉源性咳嗽[1]以陣發(fā)性咽癢,咳嗽難止為主要臨床表現(xiàn),遇冷風、油煙刺激加重,臨床上常難以明確具體病因?，F(xiàn)代醫(yī)學提出咳嗽高敏綜合征(Chronic cough hypersensitivity syndrome,CHS) 的概念[2],將本病歸屬于難治性咳嗽范疇,目前廣泛認為神經(jīng)源性炎癥、神經(jīng)重塑是咳嗽敏感性增高的重要機制[3]。近年研究發(fā)現(xiàn),氣道上皮感覺神經(jīng)末梢的瞬時受體電位香草酸亞型1(Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1) 在咳嗽反射高敏感過程中發(fā)揮了重要作用[4],TRPV1通路被激活后,白細胞介素(IL)-10等抗炎因子表達減少[5],IL-1β等促炎因子表達增加,促進釋放P物質(zhì)(Substance P,SP) 、神經(jīng)激肽A(Neurokinin A, NKA) 、降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP) 等神經(jīng)肽[6],形成氣道神經(jīng)源性炎癥,進一步將興奮傳入中樞[7],促進中樞膠質(zhì)細胞活化,并分泌細胞因子(IL-1β) 、神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor, NGF) 等相關(guān)因子,致咳嗽中樞敏化[8-9]。

吳擁軍教授師承國醫(yī)大師干祖望教授,在繼承其學術(shù)思想及喉源性咳嗽辨治經(jīng)驗基礎(chǔ)上,創(chuàng)立祛風止咳方[10-11]應用于臨床,前期臨床研究顯示,祛風止咳方能顯著減少患者刺激性咳嗽,有效改善咽癢、咽干等伴隨癥狀,提高患者生活質(zhì)量[12],且復發(fā)少,有較好的臨床療效。為進一步探討本方治療喉咳的作用機制,本研究通過建立咳嗽敏感性增高豚鼠模型,觀察給藥前后豚鼠咳嗽次數(shù),及對TRPV1通路激活后相關(guān)細胞因子、神經(jīng)肽及中樞膠質(zhì)細胞活化的影響。

1 材料

1.1 動物

Hartley雄性豚鼠30只,體質(zhì)量(250±20)g,3～4周齡,購自邳州市東方養(yǎng)殖有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇) 2022-0004。適應性飼養(yǎng)1周,12 h/12 h光照循環(huán),自由進食用水,實驗環(huán)境溫度:(23±3) ℃,濕度:40%～70%,本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查批準(倫理號:202206A009)。

1.2 藥物

祛風止咳方:蜜麻黃120 g,荊芥120 g,杏仁200 g,蟬蛻60 g,蛇蛻60 g,桔梗120 g,蘇子200 g,百部200 g,半夏120 g,枇杷葉200 g,款冬花200 g,金沸草200 g,烏梅200 g,甘草60 g,共計2 060 g,購自南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,符合《中華人民共和國藥典》(2020年版)要求,室溫下浸泡30 min,加10倍量水煎煮1 h,紗布過濾后再次加10倍量水,煎煮40 min,合并濾液(100目濾網(wǎng)),濃縮至相對密度為1.20-1.25(80 ℃) 的清膏。清膏移入真空干燥箱內(nèi)干燥(真空度-0.09～-0.08 Mpa,溫度≤60 ℃),取干浸膏粉碎,過80目篩,得浸膏粉,每1 g提取物相當于4.68 g處方量。美敏偽麻溶液(2 mg∶0.4 mg∶6 mg),惠氏制藥有限公司,100 mL/瓶。

1.3 主要試劑與儀器

卵清蛋白(OVA,Sigma,貨號：A5503-1G);氫氧化鋁(索萊寶,貨號：A7130);環(huán)磷酰胺(麥克林,貨號:C804838-25g);辣椒素(瑞芬思,貨號:L-011);檸檬酸(麥克林,貨號:C805019-500g);豚鼠IL-1β、IL-10、IgE ELISA試劑盒(武漢華美,貨號:DY6226、DY5258、CSB-E12102Gp);TRPV1、SP、NKA、CGRP ELISA試劑盒(南京森貝伽,貨號:SBJ-G099、SBJ-H1898、SBJ-G005、SBJ-G018);TRPV1小鼠單克隆抗體、NGF兔單克隆抗體、IL-1β兔單克隆抗體(Abcam,貨號:ab203103、ab52987、ab234437);GFAP兔單克隆抗體(Novus,貨號:NB300-141);高速低溫離心機(Thermo Fisher Scientific,型號:MicroCL 17R),凝膠成像系統(tǒng)(上海天能,型號:5300),酶標儀(BioTek,型號:ELX800)。

2 方法

2.1 咳嗽敏感性增高豚鼠模型的建立

參考李得民等[13]的方法,采用卵蛋白致敏結(jié)合煙熏方法制備咳嗽敏感性增高豚鼠模型:實驗d1豚鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(30 mg·kg-1),d1～d35,每天于100 cm×60 cm×60 cm的半敞開式亞克力透明箱體中點燃5支香煙,熏煙30 min,d15、d22腹腔注射增敏劑(2 mg OVA和100 mg氫氧化鋁混懸液) 1 mL,空白組于相同時間點腹腔注射等體積生理鹽水;d29～d35采用1% OVA霧化攻擊,每日1次。造模結(jié)束24 h后,隨機取3只豚鼠,頸椎脫臼法處死,取咽喉黏膜、氣管黏膜、肺組織,進行HE染色病理觀察及相關(guān)指標檢測作為給藥前對照。

2.2 分組及給藥

適應性飼養(yǎng)結(jié)束后,30只豚鼠根據(jù)隨機數(shù)字表分為空白組、模型組、激動劑組(祛風止咳方+辣椒素) 、中藥組(祛風止咳方) 、對照組(美敏偽麻溶液),每組6只。各組均于實驗第36 d開始給藥,每日1次,連續(xù)2周;祛風止咳方組和美敏偽麻溶液組按照成人等效劑量,分別以1.99 g·kg-1(每1 g干浸膏配水5 mL)、2.7 mg·kg-1灌胃,灌胃體積10 mL·kg-1;激動劑組予TRPV1激動劑辣椒素溶液(10-4mol·L-1) 1 mL霧化吸入5 min,再行祛風止咳方灌胃(劑量同上);空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃。

2.3 豚鼠咳嗽敏感性測定(CRS)

將各組豚鼠放入霧化箱內(nèi),用0.4 mmol·L-1檸檬酸工作液連續(xù)霧化2 min,觀察5 min(豚鼠咳嗽時特征性動作:頸前伸、張口、伸出前腳等),記錄干預前后豚鼠咳嗽次數(shù)。

2.4 咽喉、氣管黏膜、肺組織病理情況

HE染色后,顯微鏡下觀察各組豚鼠干預前后咽喉黏膜、氣管黏膜、肺組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化及炎性細胞浸潤情況。

2.5 血細胞分析

豚鼠股動脈取血,采用自動血細胞檢測儀檢測用藥前后血白細胞總數(shù)(WBC) 、中性粒細胞計數(shù)(NEU) 、淋巴細胞計數(shù)(LYM) 、嗜酸性粒細胞計數(shù)(EOS) 、嗜酸性粒細胞比率(EOS%)。

2.6 ELISA實驗

給藥d14,以40 mg·kg-1戊巴比妥鈉行豚鼠腹腔注射麻醉,股動脈采血,取5 mL血液加入EDTA-K2抗凝管充分混勻,離心10 min(3 000 r·min-1),取血漿及上清;豚鼠處死后,剪開胸腹正中皮膚、肋骨,暴露胸腔,自近端剪斷氣管,取咽喉黏膜、氣管黏膜,用預冷的PBS(0.01 mol·L-1, pH=7.4) 沖洗組織,將剪碎的組織稱質(zhì)量，按1∶9比例混合對應體積的PBS加入勻漿器,充分研磨10 min(5 000 r·min-1),取上清液,嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測血清中IL-1β、IL-10、IgE的含量;咽喉黏膜、氣管黏膜的TRPV1和NKA、CGRP、SP表達水平。

2.7 Western blot實驗

豚鼠麻醉處死后,自枕骨大孔處分離顱骨暴露腦組織,腦干最下端即為延髓,切取延髓部分稱重,加入含PMSF及磷酸酶抑制劑的裂解液(按樣本質(zhì)量100 mg加裂解液體積1 mL比例),研磨勻漿30 min后,離心5 min(12 000 r·min-1),轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中。SDS-page電泳分離后,轉(zhuǎn)移于0.22 μm的PVDF膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉,分別用一抗孵育。4 ℃過夜后,TBS-T洗滌3次,加入辣根過氧化酶標記山羊抗兔Ig G抗體二抗,室溫2 h,TBS-T洗滌3次,每次5～10 min,最后用化學發(fā)光法進行顯色,PVDF膜置于天能5200凝膠成像系統(tǒng)內(nèi),應用Quantity One、Gel pro analyzer、Image J等軟件對各蛋白條帶進行定量分析。檢測延髓咳嗽中樞IL-1β、TRPV1、NGF、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP;星形膠質(zhì)細胞活化的標志物) 蛋白表達。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 豚鼠咳嗽敏感性檢測

給藥d1、d7、d14,與空白組比較,模型組豚鼠咳嗽次數(shù)顯著增加(P<0.01);藥物干預后,與模型組比較,祛風止咳方+辣椒素組、祛風止咳方組和美敏偽麻溶液組咳嗽次數(shù)明顯減少(P<0.01),祛風止咳方組和美敏偽麻溶液組與祛風止咳方+辣椒素組相比咳嗽次數(shù)減少更明顯(P<0.01),兩組間咳嗽敏感性差異不明顯(P>0.05)。結(jié)果見圖1。

圖1 各組豚鼠咳嗽敏感性比較Fig.1 Comparison of cough sensitivity ofguinea pigs in each group

3.2 豚鼠血細胞分析

與空白組比較,模型組白細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、嗜酸性粒細胞計數(shù)稍高,余無明顯差異(P>0.05);藥物干預后,與模型組相比,各組豚鼠嗜酸性粒細胞百分率明顯下降(P<0.05,P<0.01),祛風止咳方組與美敏偽麻溶液組相比,下降稍多,兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組豚鼠血細胞分析比較Table 1 Comparison of blood cell analysis of guinea pigs in each group

3.3 咽喉黏膜、氣管黏膜、肺組織病理形態(tài)變化

如圖2所見,與空白組相比,模型組豚鼠咽喉黏膜見角質(zhì)層增厚、炎性細胞浸潤、黏膜下結(jié)締組織水腫,氣管黏膜上皮纖毛排列紊亂、黏膜下炎細胞浸潤,肺組織可見嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤。藥物干預后,與模型組相比,祛風止咳方組、美敏偽麻溶液組黏膜角質(zhì)層增厚明顯、纖毛紊亂程度減輕,黏膜下炎細胞數(shù)量明顯減少,二者炎癥反應水平類似,祛風止咳方+辣椒素組炎性細胞浸潤總體程度較模型組減輕,較祛風止咳方組稍重。

咽喉黏膜

3.4 豚鼠血清IL-1β、IL-10、IgE含量，咽喉、氣管黏膜TRPV1、NKA、CGRP、SP水平表達

與空白組比較,模型組豚鼠血清IL-1β、IgE水平明顯升高,IL-10水平明顯降低 (P<0.01),咽喉、氣管黏膜中TRPV1、NKA、CGRP、SP水平升高(P<0.01);藥物干預后,與模型組比較,祛風止咳方+辣椒素組、祛風止咳方組、美敏偽麻溶液組血清IL-1β、IgE水平和咽喉、氣管黏膜中TRPV1、NKA、CGRP、SP水平均明顯降低 (P<0.05,P<0.01),祛風止咳方組和美敏偽麻溶液組IL-10水平明顯升高(P<0.01),祛風止咳方+辣椒素組與祛風止咳方組、美敏偽麻溶液組相比,差異明顯 (P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見表2～4。

表2 各組豚鼠血清IL-1β、IL-10、IgE的含量Table 2 Serum IL-1β, IL-10 and IgE contents of guinea pigs in each

表3 各組豚鼠咽喉黏膜TRPV1、NKA、CGRP、SP的水平Table 3 Expression of TRPV1, NKA, CGRP and SP in throat mucosa of guinea pigs in each

表4 各組豚鼠氣管黏膜TRPV1、NKA、CGRP、SP的水平Table 4 Expression of TRPV1, NKA, CGRP and SP in trachea mucosa of guinea pigs in each

3.5 豚鼠延髓咳嗽中樞IL-1β、TRPV1、GFAP、NGF蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示,豚鼠模型中,其延髓咳嗽中樞部位的IL-1β、TRPV1、GFAP、NGF蛋白表達量顯著升高(P<0.01),藥物干預后,與模型組相比,祛風止咳方+辣椒素組、祛風止咳方組和美敏偽麻溶液組IL-1β、TRPV1、GFAP、NGF蛋白表達量均顯著降低(P<0.01),美敏偽麻溶液組TRPV1、GFAP、NGF蛋白表達量下降最明顯(P<0.01),祛風止咳方+辣椒素組與祛風止咳方組相比,差異明顯 (P<0.01)。結(jié)果見圖3。

圖3 各組豚鼠延髓咳嗽中樞相關(guān)蛋白的表達水平Fig.3 Expression of cough center related proteins in medulla bulbar of guinea pigs in each group

4 討論

喉咳是臨床常見疾病,以反復發(fā)作的刺激性癢咳為特征,吳擁軍教授提出“風邪外犯,引動伏邪”為其核心病機,各種因素致表邪未清,伏于肺經(jīng)不去,再因風邪引動,致肺失宣降,久咳不愈。祛風止咳方以麻黃辛散為君,外祛風邪,杏仁為臣,配伍以蟬蛻、蛇蛻等蟲類藥,搜剔伏于肺經(jīng)頑邪,佐半夏、蜜百部、款冬花等降氣止咳化痰?，F(xiàn)代藥理學研究表明,祛風止咳方中活性成分可抑制TRPV1通路的活性,調(diào)控氧化應激,減少促炎因子生成,減輕氣道及肺部的炎癥,達到緩解炎癥反應、止咳的作用[14-16],但中藥成分復雜,整體效應機制還有待深入研究。

目前研究證實,外界刺激物(如變應原、酸等) 可直接或間接作用于鼻、咽、喉、肺感覺神經(jīng)C纖維末梢[17],激活TRPV1通路,致IL-1β等促炎因子釋放增加[18],IL-10等抗炎因子表達減少,黏膜血管通透性及炎性成分滲出,誘導IgE合成增多,產(chǎn)生嗜酸性炎癥,加重氣道敏感性,炎癥浸潤進一步釋放SP、NKA、CGRP等神經(jīng)肽,形成氣道神經(jīng)源性炎癥,導致咳嗽。我們以卵蛋白致敏結(jié)合煙熏刺激豚鼠造模,結(jié)果顯示模型組豚鼠血清中嗜酸粒細胞計數(shù)增加,且咳嗽敏感性增高,其咳嗽次數(shù)隨著造模時間延長趨于穩(wěn)定,與文獻描述較為一致。祛風止咳方干預后顯著減少模型豚鼠咳嗽次數(shù),降低嗜酸粒細胞計數(shù),減輕咽喉、氣道黏膜水腫及肺組織中嗜酸性粒細胞等炎細胞浸潤。ELISA結(jié)果示祛風止咳方干預后,血清IL-1β、IgE,和黏膜上皮TRPV1、NKA、CGRP、SP表達被抑制,IL-10分泌被上調(diào),與美敏偽麻溶液組比較無明顯差異,與祛風止咳方+辣椒素組比較有統(tǒng)計學差異。辣椒素作為TRPV1激動劑,直接作用于TRPV1,增加了TRPV1蛋白通路的開放,因此降低了祛風止咳方的干預效果,提示祛風止咳方可能通過抑制TRPV1通路開放,抑制促炎因子、神經(jīng)肽表達,促進抑炎因子分泌,減輕黏膜炎癥浸潤,降低氣道上皮黏膜敏感性,抑制外周氣道的神經(jīng)源性炎癥。

同時研究顯示,TRPV1通路的表達與中樞膠質(zhì)細胞的活化呈正相關(guān)[19],氣道神經(jīng)源性炎癥將興奮傳入中樞,促進膠質(zhì)細胞活化、釋放IL-1β、NGF等細胞因子,使谷氨酸等興奮性遞質(zhì)的表達增加,γ-氨基丁酸等抑制性遞質(zhì)的表達減少,進一步提高延髓咳嗽中樞對外周氣道感覺神經(jīng)傳入的敏感性[3]。GFAP作為星形膠質(zhì)細胞(AS) 胞質(zhì)內(nèi)的特異性酸性蛋白,被廣泛用于膠質(zhì)細胞活化的檢測[20]。我們通過Western blot觀察到,藥物干預后,祛風止咳方組和美敏偽麻溶液組IL-1β、TRPV1、GFAP、NGF蛋白表達量均降低,美敏偽麻溶液組蛋白表達量下降最多,可能與其含有中樞性鎮(zhèn)咳藥氫溴酸右美沙芬有關(guān),直接作用于延髓咳嗽中樞抑制咳嗽反射。祛風止咳方+辣椒素組蛋白表達量下降最少,療效減弱可能與激動劑致TRPV1過度表達促進中樞膠質(zhì)細胞活化分泌炎癥因子有關(guān)。上述結(jié)果提示祛風止咳方可能通過抑制延髓咳嗽中樞TRPV 1通路的表達,抑制中樞膠質(zhì)細胞活化,減少炎癥因子IL-1β、神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF分泌,從而抑制突觸釋放興奮性遞質(zhì),降低中樞咳嗽高敏感性。

綜上所述,祛風止咳方能抑制外周氣道、延髓咳嗽中樞TRPV1通路的表達,降低氣道神經(jīng)源性炎癥,抑制咳嗽中樞敏化,為明確其作用機制提供初步的實驗依據(jù)。但仍存在一些不足:①本研究參照喉咳的生理病理特點進行動物造模,符合喉咳的發(fā)病機制,但未能進行多種模型之間的結(jié)果比較,模型評價標準仍須統(tǒng)一;②本次研究初步探討了藥物干預前后GFAP表達的變化,活化的膠質(zhì)細胞釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β) 、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 等多種細胞因子,在以后的研究中有待進一步深入探討;③中藥復方成分復雜,應進一步拆方,篩選有效成分進行研究。