施錚,王璐瑤,韋英杰,汪晶,魯晏武,潘揚,余黎,虞舜

(1.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥文獻研究所,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院·養(yǎng)生康復學院,江蘇 南京 210023;3.江蘇省中醫(yī)藥研究院,江蘇 南京 210028;4.寧波市中醫(yī)院皮膚科,浙江 寧波 315010;5.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023)

結核病至今仍是嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]?？菇Y核化學療法是干預結核病的有效手段,但多數(shù)一線化療藥物都有潛在肝毒性,易產(chǎn)生抗結核藥物肝損傷(Antituberculosis drug-induced liver injury,ATDILI)[2],最終導致化療中斷,甚則治療失敗。中醫(yī)藥療法干預ATDILI具有明顯優(yōu)勢,自20世紀90年代以來,臨床報道多,但治法各異,令人莫衷一是,急需運用新方法、新思路進行系統(tǒng)整理與挖掘[3]。本文擬將數(shù)據(jù)挖掘與藥理實驗驗證相結合,分析中醫(yī)藥干預ATDILI的用藥規(guī)律,篩選核心方藥。

1 數(shù)據(jù)挖掘

1.1 資料與方法

1.1.1 處方來源 搜索中國知網(wǎng)、萬方、中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫(CBM)、讀秀、維普、PubMed、Web of Science等數(shù)據(jù)庫,收集中醫(yī)藥干預ATDILI的臨床報道、學術專著。檢索時限均從建庫至2020年6月15日。由2名研究者獨立篩選文獻、評價方法學質量,提取數(shù)據(jù),并交叉核對,若遇分歧,則討論或咨詢第3名研究者判定,缺乏的信息盡量與作者聯(lián)系予以補全。檢索式與檢索流程見圖1。共篩選出118篇文獻，其中一些報道對不同證型采用不同方劑辨證施治，共342首中醫(yī)藥干預ATDILI的方劑。

1.1.2 數(shù)據(jù)整理與錄入 將342首方劑,參照《中華人民共和國藥典》對藥名進行統(tǒng)一標準化處理,冷背異名如“南嶺蕘花”,則參考《中華本草》轉化為“了哥王”,系統(tǒng)整理清洗后錄入,統(tǒng)一藥物的別名、異名,完成錄入后,再交專人校對。

1.1.3 數(shù)據(jù)分析 方劑數(shù)據(jù)挖掘運用中醫(yī)傳承輔助平臺(V2.5),對用藥頻次進行描述性統(tǒng)計;基于關聯(lián)規(guī)則挖掘本研究的藥物配伍規(guī)律。

1.2 結果

1.2.1 用藥頻次 342首處方,涉及藥物229種,總頻次3 835次,按降序排列,可得到頻次在25以上的藥物41味,見表1。

表1 高頻藥物Table 1 High frequency drugs

1.2.2 關聯(lián)規(guī)則 設置支持度個數(shù)為88,置信度為0.8,將藥對降序排序,得到頻次≥88的藥對,共有17條,涉及中藥11味,見表2。共得到關聯(lián)規(guī)則11條,見表3,網(wǎng)絡圖展示見圖2。設置支持度個數(shù)為122,置信度為0.8,降序排列,得到頻次≥122的藥對,共有4條,涉及中藥5味,網(wǎng)絡圖展示見圖3。將圖3獲得的高頻、高置信度的5味中藥組合視為本研究的核心方，與頻次最高的前8味單藥，納入下一步藥效篩選研究。

表2 支持度個數(shù)88條件下藥對組合Table 2 Drug pairs in the support degree number of 88

表3 常用藥物規(guī)則分析Table 3 Analysis of common drug rules

圖2 支持度個數(shù)為88時藥物關聯(lián)的網(wǎng)絡圖Fig.2 Network diagram of drug associations in the support degree number of 88

圖3 支持度個數(shù)為122時藥物關聯(lián)的網(wǎng)絡圖Fig.3 Network diagram of drug associations in the support degree number of 122

2 藥效篩選

2.1 材料與方法

2.1.1 儀器 體式顯微鏡(SMZ-800N,日本NIKON公司);熒光顯微鏡(Leica DMI 3000B,德國Leica公司);分析天平(MT5,瑞士METTLER TOLEDO公司);生化培養(yǎng)箱(SPX-80,寧波海曙賽褔實驗儀器廠);氮吹儀(N-EVAP-11,美國Organomation公司)。

2.1.2 藥品與試劑 異煙肼(INH,美國Sigma-Aldrich公司,批號:MKCJ5583);甘草酸二銨注射液(DG,10 mL∶50 mg,正大天晴藥業(yè)股份有限公司,批號:191219104);醋柴胡(BupleurumchinenseDC.,安徽省金芙蓉中藥飲片公司,批號:02-19060101)、茯苓[Poriacocos(Schw.) Wolf.,安徽存真中藥飲片有限公司,批號:200301]、炒白芍(PaeonialactifloraPall.,安徽省金芙蓉中藥飲片公司,批號:01-19080101)、茵陳(ArtemisiacapillarisThunb.,安徽嘉佑中藥飲片有限公司,批號:20200401)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.,江蘇華洪藥業(yè)科技有限公司,批號:200526)、丹參(SalviamiltiorrhizaBge.,安徽存真中藥飲片有限公司,批號:200602)、郁金(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling,安徽存真中藥飲片有限公司,批號:200301)、炒白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.,安徽存真中藥飲片有限公司,批號:191102),均購買于南京南中醫(yī)大國醫(yī)堂門診部,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學陳建偉教授鑒定。斑馬魚胚胎培養(yǎng)基:5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.33 mmol·L-1CaCl2、0.33 mmol·L-1MgSO4。

2.1.3 實驗動物 Tuebingen品系斑馬魚、CZ320[ihb175Tg,Tg(-1.7apoa2:GFP)]品系肝臟特異性熒光標記斑馬魚,均為4～6月齡,購買于南京堯順禹生物科技有限公司。

2.1.4 核心方藥提取物的制備 取核心方藥:高頻藥物8種(柴胡、茯苓、白芍、茵陳、炙甘草、丹參、郁金、白術)、核心方1種(柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陳，1∶1∶1∶1∶1)各20 g,分別第1次加入10倍體積純凈水煎煮1 h,將液體過濾后倒出,第2次加入10倍體積純凈水煎煮1 h,將液體過濾后倒出。合并2次濾液,加純水至400 mL(合生藥量50 mg·mL-1),取20 mg生藥量藥液吹干備用,臨用前用培養(yǎng)基適當稀釋,分別配制不同濃度的供試液。

2.1.5 斑馬魚幼魚的收集處理方法 斑馬魚的養(yǎng)殖參照Zebrafish Book[4]。Tuebingen品系斑馬魚雌雄分開飼養(yǎng),定時喂以孵化的豐年蝦卵,飼養(yǎng)條件按照光照14 h/黑暗10 h,水溫28 ℃的循環(huán)水系統(tǒng)。于收集魚卵前1日16:00按雌雄比1∶1挑選健康性成熟的斑馬魚放入產(chǎn)卵缸中,次日9:00—10:00收集受精卵。將受精卵挑選、清洗后移入胚胎培養(yǎng)用水中培養(yǎng),并滴入亞甲基藍消毒。在受精卵發(fā)育至72 hpf,得到3 dpf幼魚,挑選發(fā)育正常的幼魚,移入24孔板中,每孔8尾,同一濃度設3個重復孔。將3 dpf幼魚暴露在不同濃度的供試液中,每孔2 mL溶液。連續(xù)給藥3 d,每天換液。實驗重復3次。CZ320品系斑馬魚復篩,每孔3尾幼魚,設3個重復孔,其余與Tuebingen品系相同。

2.1.6 核心方藥干預斑馬魚ATDILI模型的藥效觀察 設置空白對照組(胚胎培養(yǎng)基)、模型組(INH 8 mmol·L-1)、陽性藥物組(INH與DG4、20、100、500 μg·mL-1聯(lián)合給藥)以及INH與待篩選核心方藥(高頻藥物8種,核心方1種,見“2.1.4”)水提液50、100、200、400、800 μg·mL-1聯(lián)合給藥組,共51組,每組72尾幼魚,在給藥72 hpe記錄Tuebingen斑馬魚死亡數(shù)和畸形數(shù),計算死亡率和畸形率。在體視顯微鏡下觀察斑馬魚的形態(tài)變化情況。選用死亡率最低，且死亡率相同時畸形率最低的濃度組，使用CZ320品系斑馬魚驗證初篩結果,每組27尾幼魚,在熒光顯微鏡下觀察肝臟形態(tài)變化情況。

2.1.7 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用卡方檢驗;計量資料在滿足正態(tài)分布和方差齊性的前提條件下,進行組間方差分析,組間比較采用Tukey's檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 結果

2.2.1 核心方藥對斑馬魚幼魚ATDILI模型死亡率、畸形率的影響 與空白對照組相比,ATDILI模型組的死亡率、畸形率均顯著上升(P<0.01);與模型組相比,隨著給藥濃度的增加,待篩選藥物死亡率、畸形率均顯著下降(P<0.05，P<0.01),至高濃度時(400～800 μg·mL-1)，死亡率、畸形率又有所上升，見表4～5。

表4 核心方藥對斑馬魚ATDILI模型死亡率的影響Table 4 Effects of core prescriptions and drugs on mortality in zebrafish ATDILI models

表5 核心方藥對斑馬魚ATDILI模型畸形率的影響Table 5 Effect of core prescriptions and drugs on malformation rate in zebrafish ATDILI models

(續(xù)表)

2.2.2 核心方藥對斑馬魚幼魚形態(tài)學變化的影響 與空白對照組相比,模型組出現(xiàn)魚鰾缺失或減小、卵黃囊吸收延滯、脊柱彎曲、心包水腫;與模型組相比,隨著給藥濃度增加(100～200 μg·mL-1),多數(shù)待篩選藥物組形態(tài)學變化均有不同程度改善,至高濃度時(400～800 μg·mL-1)惡化。見圖4。

注：Control.空白對照組；INH.INH 8 mmol·L-1;DG和中藥水提物濃度單位為μg·mL-1；黑色箭頭指示心包水腫;紅色箭頭指示魚鰾缺失或減小;黃色箭頭指示卵黃囊吸收延滯;藍色箭頭指示脊柱彎曲。圖4 斑馬魚幼魚形態(tài)圖Fig.4 Morphological diagram of zebrafish larval

2.2.3 核心方藥對CZ320品系斑馬魚ATDILI模型的影響 與空白對照組相比,模型組的斑馬魚肝臟熒光面積顯著下降,熒光光密度顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,待篩選藥物組的斑馬魚肝臟熒光面積顯著上升,熒光光密度顯著增強(P<0.01)。見圖5。

注：Control.空白對照組；INH.INH 8 mmol·L-1圖5 72 hpe斑馬魚幼魚的肝臟熒光情況比較Fig.5 Comparison of liver fluorescence of 72 hpe juvenile zebrafish

3 討論

3.1 用藥分類

根據(jù)用藥頻次統(tǒng)計，本研究中補虛藥(共1 115次,29.07%)、清熱藥(共634次,16.53%)、利水滲濕藥(共524次,13.66%)位居前3位,單味藥以柴胡頻次最高,體現(xiàn)了補虛、清熱、利濕是治療ATDILI的最常用治法。余下排序為活血化瘀藥、疏肝藥、理氣藥、化痰止咳平喘藥等。①補虛藥:ATDILI多因稟賦虛弱,感染癆蟲在先,加之化療療程長,藥毒侵襲,損傷肝脾,久病入腎,以致脾肺氣虛、肝腎陰虛,故以補氣藥(共564次,14.71%)補脾肺之氣,扶正祛邪；以補血藥(共321次,8.37%)補血養(yǎng)血以柔肝斂陰；以補陰藥(共215次,5.61%)補養(yǎng)因癆蟲受損之肺陰、因藥毒受損之胃陰及肝腎之陰。②清熱藥:清熱藥占第2位,化療藥物藥毒侵肝,絡脈瘀阻,氣火失調,以致濕熱內(nèi)生,瘀血內(nèi)阻,以藥毒、濕熱、氣滯、血瘀為標,故以清熱涼血藥(共221次,5.76%)清熱涼血,活血散瘀,除肝經(jīng)瘀熱;以清熱解毒藥(共169次,4.41%)清熱解毒兼利濕;以清熱燥濕藥(共130次,3.39%)清熱燥濕,瀉肝火,解肝毒。③利水滲濕藥:以利濕退黃藥(共267次,6.96%)最多,入肝膽經(jīng),清利濕熱,利膽退黃,使?jié)駸岬们?黃疸得除;以利水退腫藥(共238次,6.21%)利水滲濕,健脾瀉熱。

3.2 常用藥對分析

常用藥對降序排列,柴胡為核心,見表2。①柴胡-白芍頻次最高,其源于《傷寒論》之四逆散,肝為剛臟,體陰用陽,柴胡疏肝解郁、白芍柔肝養(yǎng)血,二者并用,為調肝的基本藥對。②柴胡-茯苓排第2位,其源于《圣濟總錄》之柴胡茯苓湯,為疏肝健脾之常用藥對。藥毒傷肝,肝病傳脾的病機特點在本研究中十分突出,柴胡-茯苓即為此而設。③柴胡-炙甘草排第3位,其源于《傷寒論》之小柴胡湯,柴胡疏肝,甘草緩肝急、解肝毒、補脾氣,該藥對疏肝理氣,解毒緩中,使脾氣充,肝氣調,氣滯消,瘀熱散。高頻組合主要可以分為:疏肝-補虛(如柴胡-白芍)、疏肝-利水滲濕(如柴胡-茵陳)、疏肝-活血化瘀(如柴胡-郁金)、補虛-補虛(如炙甘草-白芍)、疏肝-清熱(如柴胡-赤芍),體現(xiàn)了補虛、清熱、利濕的治法下,重用柴胡的用藥特點。

3.3 關聯(lián)規(guī)則分析

為了探尋本研究用藥共性,參考已有報道[5],不同參數(shù)提取數(shù)據(jù)的預讀與臨床實際,將支持度個數(shù)設為88、122,置信度設為0.8。①支持度個數(shù)為88時(占總方藥25%),以柴胡為中心,常與補虛藥(炙甘草、白芍、白術)、清熱藥(赤芍、黃芩)、利水滲濕藥(茯苓、茵陳)、活血化瘀藥(郁金、丹參)、收澀藥(五味子)等合用。②支持度個數(shù)為122時(占總方藥35.7%),柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陳,是本研究最核心用藥組合,可看作核心方。此方為《太平惠民和劑局方》“逍遙散”加減方,在逍遙散的基礎上,去當歸、薄荷、生姜,加茵陳。柴胡疏肝理氣;茯苓利水滲濕,健脾和胃;白芍養(yǎng)血柔肝;炙甘草益氣解毒,調和諸藥;茵陳蒿清熱利濕。全方共奏疏肝健脾,清利濕熱之功。適用于肝郁脾虛兼內(nèi)生濕熱者,暗合前文補虛、清熱、利濕,注重肝脾同治的治法。由于本研究的處方來源很多沒有記載明確劑量,為便于研究,綜合藥典劑量、本研究納入的有劑量數(shù)據(jù)的臨床報道,將比例定為柴胡、茯苓、白芍、炙甘草、茵陳1∶1∶1∶1∶1。

綜上,根據(jù)數(shù)據(jù)挖掘,推測ATDILI的病因病機應為:癆病在先,化療后藥毒傷肝,病位主要在肝、脾,病久必累及腎。本虛標實,以藥毒、濕熱、氣滯、血瘀為標,以肝、脾、肺、腎氣血虧虛為本。ATDILI的治療以補虛、清熱、利濕為總原則,注重肝脾同治。以疏肝解郁,健脾養(yǎng)血,清利濕熱為基本治法,兼顧活血化瘀、理氣化痰、止咳平喘。

3.4 核心方藥的藥效驗證篩選

斑馬魚產(chǎn)卵多、繁殖快、胚胎透明，與人類基因有87%同源性[6]。在毒性篩選中,斑馬魚與傳統(tǒng)模型相比，既有相似的神經(jīng)、血管、代謝系統(tǒng),又有相似的活性代謝產(chǎn)物,并且實驗周期短、成本低、用藥量少,更符合倫理[7]。斑馬魚模型可以高效地對數(shù)據(jù)挖掘結果進行高通量篩選驗證。斑馬魚適用于中藥保肝研究已經(jīng)得到反復驗證[8],并廣泛用于ATDILI研究[9-10]。斑馬魚受精卵16 hpf發(fā)育出肝細胞前體,50 hpf形成肝臟并易于識別,60～72 hpf肝臟生長到適當大小,故肝毒性篩選多采用3 dpf的斑馬魚作為評價模型[10]。綜合有關文獻[9,11]與預實驗,本研究采用8 mmol·L-1INH給藥72 hpe建立斑馬魚ATDILI模型,結果顯示,柴胡、茯苓、白芍、茵陳、炙甘草、丹參、郁金、白術以及核心方隨著給藥濃度增加,ATDILI模型斑馬魚幼魚的畸形率、死亡率均顯著下降(P<0.05)。至高濃度時,畸形率、死亡率又有上升。形態(tài)學上各藥物干預組均發(fā)育好于模型組。與模型組相比,待篩選藥物組的斑馬魚肝臟熒光面積顯著上升(P<0.01),熒光光密度顯著增強(P<0.01)。本研究基于數(shù)據(jù)挖掘技術得到的核心方藥,在斑馬魚模型上均顯示出一定的保肝作用。且核心方組的畸形率、熒光面積均優(yōu)于陽性藥DG與各單味藥,體現(xiàn)了核心方的保肝優(yōu)勢,其具備作為新藥開發(fā)的潛力。而在單味中藥的篩選中,茵陳、白芍、丹參、白術組畸形率、熒光面積均優(yōu)于陽性藥組,顯示對ATDILI具有較強的保肝作用,下一步可以繼續(xù)篩選這些單味中藥中的活性單體保肝成分。數(shù)據(jù)挖掘具有低成本、高通量的優(yōu)勢,本研究的實驗結果又在一定程度上驗證了數(shù)據(jù)挖掘技術的可靠性與適用性。

本研究的ATDILI藥效篩選模型也存在一定的局限:①斑馬魚在基因、生物學特征上與哺乳動物仍存在一定差異性,其不一定能夠完全反映藥物在人類體內(nèi)代謝的真實情況。②ATDILI模型僅適用于篩選在培養(yǎng)基中溶解度較高的藥物,本研究曾經(jīng)試圖建立INH-利福平聯(lián)用ATDILI模型,但由于利福平溶解度低而失敗,目前同類研究均存在這一不足[10]。因此筆者在未來的研究中會專注于:①使用經(jīng)典的哺乳動物模型對斑馬魚模型篩選的核心方藥藥效進行驗證[12-13]。②繼續(xù)改進斑馬魚ATDILI模型。③納入更多數(shù)據(jù)挖掘出的高頻藥物、藥對、新方在斑馬魚ATDILI模型進行篩選驗證。④結合中藥化學技術與生物學技術,發(fā)掘核心方藥的活性成分,同時探索作用機制。