方中岳 梁亮 呂維民 張嵐清 楊帆 張繼虹 歐霞

（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類(lèi)生命的健康。其傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)、放療、化療等，但這些治療方法依然存在不能根治和嚴(yán)重的毒副作用等問(wèn)題。近十年來(lái)，腫瘤免疫療法得到了極大的發(fā)展，通過(guò)重新啟動(dòng)并維持腫瘤-免疫循環(huán)，激活機(jī)體正常的抗腫瘤免疫，從而達(dá)到控制與清除腫瘤的目的［1］。其中，溶瘤病毒療法（oncolytic virotherapy）是腫瘤免疫療法的一個(gè)重要分支，已被充分證實(shí)在腫瘤治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。2015 年，美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)溶瘤皰疹病毒（talimogene laherparepvec，T-VEC）用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療，使溶瘤病毒療法受到越來(lái)越多的關(guān)注。2021 年，溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）Teserpaturev（G47Δ，Delytact）在日本獲批用于治療惡性膠質(zhì)瘤，使溶瘤病毒療法再次成為腫瘤免疫治療的焦點(diǎn)。溶瘤病毒可選擇性感染腫瘤細(xì)胞，最終通過(guò)裂解腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤相關(guān)抗原，或者通過(guò)表達(dá)外源基因來(lái)激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。溶瘤病毒靶向感染和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力受多種因素限制，如腫瘤細(xì)胞表面受體、腫瘤細(xì)胞內(nèi)促腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)通路以及復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境（tumor microenrinment，TME）等，隨著病毒學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因工程手段對(duì)病毒基因組進(jìn)行改造和修飾可提高溶瘤病毒載體與腫瘤細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合的能力，提高溶瘤病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路的抑制作用以及提高溶瘤病毒對(duì)TME 中低氧、新血管生成以及免疫抑制狀態(tài)等的改善和抑制能力，從而提高溶瘤病毒靶向感染和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。本文將從腫瘤細(xì)胞表面受體［2］、腫瘤細(xì)胞內(nèi)促腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)通路［3］、腫瘤微環(huán)境［4］三個(gè)方面，對(duì)提高溶瘤病毒腫瘤靶向性的策略進(jìn)行綜述。

1 靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面受體

腫瘤細(xì)胞表面受體是腫瘤細(xì)胞表面能與特定的信號(hào)分子結(jié)合并可以引起腫瘤細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的一種膜表面蛋白，在腫瘤生長(zhǎng)、遷移中發(fā)揮重要作用。溶瘤病毒靶向腫瘤細(xì)胞表面受體的方式主要有兩種：一是利用野生型病毒載體的天然嗜性；二是通過(guò)基因工程等手段，對(duì)病毒載體進(jìn)行修飾，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性（圖1a）。

少數(shù)野生型病毒載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的天然嗜性在一定程度上保證了溶瘤病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的天然靶向性。如CD54、CD55在黑色素瘤、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而這些分子也是柯薩奇病毒（coxsackie virus，CV）的天然受體［5］，CV 通過(guò)CD55 募集到細(xì)胞附近，隨后通過(guò)CD54 的內(nèi)化作用進(jìn)入宿主細(xì)胞［6］。利用柯薩奇病毒A21（coxsackie virus A21，CVA21）對(duì)CD54、CD55 的天然靶向性，可有效靶向感染并殺傷黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞。其中靶向黑色素瘤的研究顯示出良好的安全性，并于2009 年通過(guò)I期安全性試驗(yàn)，目前進(jìn)入晚期黑色素瘤的Ⅱ期試驗(yàn)。同時(shí)，CVA21還在多發(fā)性骨髓癌、肺癌等多種癌癥的治療中也表現(xiàn)出良好的靶向性和安全性［7］。

有些溶瘤病毒載體的天然受體在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞表面均表達(dá)，因此，在溶瘤病毒基因組中缺失或插入特異性片段可以進(jìn)一步提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。如單純皰疹病毒I型（herpes simplex virus-I，HSV-I）表面糖蛋白gD可與靶細(xì)胞表面受體皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)（herpesvirus entry mediator，HVEM）、連接蛋白1（Nectin-1）等特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，但HVEM和Nectin-1在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞表面均有表達(dá)，從而導(dǎo)致HSV-1對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性較差。人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor，HER-2）是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族的一員，在乳腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞表面均過(guò)表達(dá)。因此，用HER-2 特異性抗體替代gD 部分片段可以有效提高重組HSV-1 對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。Menotti等［8］將HER-2 特異性的抗體的輕鏈（107 aa）和重鏈（120 aa）用連接器（Linker）連接，替代gD上的6～38 氨基酸片段，構(gòu)建了重組HSV-1 病毒 R-LM113，與野生型病毒相比，該重組病毒對(duì)HER-2高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞SKOV-3有更強(qiáng)的感染能力，其幾乎不感染正常細(xì)胞。此外，白介素（interleukins，IL）-13的特異性受體IL-13α2在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而在正常組織細(xì)胞中低表達(dá)［9］。Zhou等［10］用IL-13 替代gD 的1～32 氨基酸片段，構(gòu)建了重組HSV病毒R5141，用R5141感染Vero細(xì)胞和表達(dá)IL-13α2的Vero-13R細(xì)胞后，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)病毒滴度和病毒相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)證實(shí)，R5141 只能通過(guò)細(xì)胞表面的IL-13 與其受體的特異性結(jié)合進(jìn)入Vero-13R 細(xì)胞并復(fù)制。因此，利用HER-2 特異性抗體或IL-13 替代HSV-1 表面糖蛋白gD 的部分片段可提高HSV-1 靶向腫瘤細(xì)胞的能力。

由于多數(shù)病毒受體在正常細(xì)胞表面均能表達(dá)，故利用溶瘤病毒載體對(duì)其受體的天然趨向性提高其靶向腫瘤細(xì)胞的能力存在一定的限制［11］。而利用腫瘤表面特異性受體的抗體替代溶瘤病毒載體與其天然受體結(jié)合的部分結(jié)構(gòu)域，可以提高溶瘤病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，并且這種靶向性可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面特征和病毒載體的類(lèi)型進(jìn)行改變，極大促進(jìn)了溶瘤病毒靶向性的提高［12］。

2 靶向抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)促腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)通路

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路改變有很大的關(guān)系，在腫瘤細(xì)胞中存在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制蛋白（retinoblastoma tumor suppressor protein，RB）-E2F、干擾素（interferon，IFN）、Wnt、p53 等信號(hào)通路失調(diào)。腺病毒（adenovirus，Ad）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）、甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）、痘苗病毒（vaccinia virus，VV）等通過(guò)基因工程修飾后均能作用于這些失調(diào)的信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向治療（圖1b）。

Wnt信號(hào)通路在多種腫瘤中異常激活，其原因主要是大腸腺瘤性息肉?。╝denomatous polyposis coli，APC）基因發(fā)生截短突變后形成穩(wěn)定的β 連環(huán)蛋白（β-catenin），隨后β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核，與Tcf/Lef家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活細(xì)胞周期蛋白D、C-myc 等Wnt 靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生［13］。在肝細(xì)胞癌（hepatacellular carcinoma，HCC）干細(xì)胞（cancer steam cells，CSCs）中異常激活的Wnt 信號(hào)通路被認(rèn)為是肝臟CSCs 的自我更新、抗藥性和致癌性的關(guān)鍵。Zhang等［14］構(gòu)建表達(dá)肺癌抑制因子1（tumor suppressor in lung cancer-1，TSLC1）的重組腺病毒Ad.wnt-E1A（Δ24bp）-TSLC1，隨后分別處理具有CSCs特征的MHCC-97H細(xì)胞、HepG2等惡性腫瘤細(xì)胞和L02等正常細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，Ad.wnt-E1A（Δ24bp）-TSLC1 可以靶向殺傷Wnt 信號(hào)通路異常激活的細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯殺傷效果。隨后，Wang等［15］構(gòu)建了攜帶TSLC1 的重組溶瘤腺病毒S24-TSLC1，在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：TSLC1 能夠下調(diào)Tcf4/ β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性并抑制CyclinD1和C-myc的表達(dá)，進(jìn)而殺傷Wnt異常激活的肝癌細(xì)胞，該結(jié)論在人肝細(xì)胞癌SMMC-7721 的小鼠異種移植瘤模型中進(jìn)一步得到證實(shí)。因此，靶向異常激活的Wnt信號(hào)通路可以提高溶瘤病毒的靶向性，并為腫瘤的治療帶來(lái)更多的方法和希望。

RB-E2F信號(hào)通路通過(guò)控制細(xì)胞周期從G1期到S 期的轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程，在正常細(xì)胞中，RB 通過(guò)募集組蛋白去乙酰化抑制E2F 活性，當(dāng)RB 失調(diào)時(shí)，E2F釋放并招募轉(zhuǎn)錄激活劑，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［16］。Ad 基因組中E1A 的922～947 bp 是RB家族的結(jié)合區(qū)，Heise等［17］通過(guò)缺失E1A 的922～ 947 bp，構(gòu)建重組腺病毒dl922-947，通過(guò)感染H1299、MB231 等RB 缺陷的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)在乳腺癌異種移植模型中能夠有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，故dl922-947 可以通過(guò)靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)失調(diào)的RB信號(hào)通路，用于癌癥的局部和全身治療。

IFN 信號(hào)通路是細(xì)胞中重要的抗病毒通路，IFN與細(xì)胞表面的干擾素受體（IFN receptor，IFN-R）結(jié)合，誘導(dǎo)IFN 下游效應(yīng)分子蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）的表達(dá)，當(dāng)病毒產(chǎn)生的dsRNA 與PKR 結(jié)合后，活化的PKR 可使elF-2α 磷酸化，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的 復(fù)制［18］。甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是一種毒力因子，可以對(duì)抗宿主細(xì)胞IFN 信號(hào)通路中PKR 介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，NS1缺失的IAV不能在正常細(xì)胞中復(fù)制，但由于激活的Ras 可使PKR 去磷酸化，故NS1 缺失的IAV 可在Ras 激活的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，并進(jìn)一步裂解腫瘤細(xì)胞［19］。Bergmann等［20］敲除IAV 的NS1片段構(gòu)建delNS1，隨后分別感染正常細(xì)胞和通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)N-ras基因的正常細(xì)胞，結(jié)果顯示delNS1選擇性在表達(dá)N-ras 基因的正常細(xì)胞中復(fù)制，驗(yàn)證了IAV可以靶向IFN從而作為一種有效的溶瘤病毒載體。此外，HSV-1、HSV-2、新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）［21］等病毒載體經(jīng)基因工程修飾后也可通過(guò)在IFN信號(hào)通路缺陷的腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制靶向裂解腫瘤細(xì)胞。

3 靶向適應(yīng)或改善腫瘤微環(huán)境（TME）

TME 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，其中低氧、新血管生成、免疫抑制狀態(tài)［22］是腫瘤治療過(guò)程中的重要障礙，溶瘤病毒可以通過(guò)改善TME 中低氧環(huán)境、抑制新血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制狀態(tài)等手段提高其對(duì)腫瘤的靶向性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散（圖1c）。

3.1 構(gòu)建低氧條件復(fù)制型溶瘤病毒

實(shí)體瘤生長(zhǎng)時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞耗氧量大、腫瘤相關(guān)性貧血和治療性貧血等因素影響，腫瘤細(xì)胞往往處于低氧狀態(tài)。這種低氧狀態(tài)與腫瘤對(duì)藥物的耐受、細(xì)胞侵襲能力和患者生存率都有密切關(guān)系［23］。如果溶瘤病毒能夠特異性在實(shí)體瘤內(nèi)低氧狀態(tài)下感染和殺傷腫瘤細(xì)胞，即可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。針對(duì)腫瘤微環(huán)境中的低氧環(huán)境，常通過(guò)構(gòu)建低氧條件復(fù)制型溶瘤病毒靶向治療實(shí)體瘤。目前主要有兩種策略：a.利用低氧條件復(fù)制型病毒作為溶瘤病毒載體；b.在病毒基因組中插入缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factors，HIFs）誘導(dǎo)目的基因表達(dá)［24］。

低氧條件復(fù)制型病毒載體作為溶瘤病毒是應(yīng)對(duì)腫瘤低氧環(huán)境的有利方法。例如水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）是一種屬于彈狀病毒科的RNA病毒，Connor等［4］發(fā)現(xiàn)，VSV在感染缺氧應(yīng)激細(xì)胞時(shí)比正常氧條件下產(chǎn)生更多的mRNA，在感染后期，VSV 可以克服低氧條件下eIF-2α磷酸化亞基的增加和感染初期病毒蛋白合成的抑制，從而產(chǎn)生更多的子代病毒裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)VSV 的感染還可通過(guò)翻譯起始因子eIF-4E 的去磷酸化來(lái)抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的翻譯，以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，隨后在對(duì)HeLa 細(xì)胞裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中，瘤內(nèi)給藥和靜脈給藥方式均證明了VSV 只能在低氧的腫瘤細(xì)胞部位復(fù)制。因此，根據(jù)VSV 在低氧條件下能夠高效復(fù)制的特性，其可以作為良好的溶瘤病毒載體進(jìn)行靶向?qū)嶓w瘤的治療。

使用HIFs 作為特異性啟動(dòng)子可以在低氧情況下有效誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，提高溶瘤病毒的腫瘤靶向性。HIFs是一個(gè)由α亞單位和β亞單位組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，作為腫瘤缺氧環(huán)境的主要分子在缺氧情況下被激活［25］。缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）通過(guò)直接結(jié)合缺氧反應(yīng)元件（hypoxia-responsive element，HRE）啟動(dòng)缺氧條件下的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此可以利用HIF-1和HRE兩種基因的調(diào)控作用，開(kāi)發(fā)出能夠靶向低氧環(huán)境中腫瘤細(xì)胞的溶瘤病毒。HYPR-Ad#1 是一種利用基因工程手段改造的溶瘤腺病毒載體，其將編碼病毒復(fù)制因子的E1A 基因置于HIF-1 啟動(dòng)子之下，使其只能在缺氧或顯示HIF-1 激活的腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制并表達(dá)目的基因，使用HYPR-Ad#1 感染LN229、U251MG、D247MG、Daoy 四種HIFs 激活的腦腫瘤細(xì)胞后，結(jié)果在低氧情況下E1A 高表達(dá)，并且有超過(guò)90%的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），而在常氧情況下沒(méi)有檢測(cè)到明顯的E1A 表達(dá)和CPE 的出現(xiàn)，說(shuō)明HYPR-Ad#1 可以在低氧條件和HIFs激活的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制［26］。

因此，利用某些溶瘤病毒載體在低氧條件下高效復(fù)制的特性或?qū)IFs 插入多種病毒載體復(fù)制必需基因的上游，都可以獲得在低氧條件選擇性復(fù)制的溶瘤病毒，提高溶瘤病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。

3.2 抑制腫瘤新血管生成

腫瘤血管新生是指在腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)作用下，從現(xiàn)有的血管上生長(zhǎng)出新的血管，以供給腫瘤細(xì)胞快速增殖所需要的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在侵襲性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到十分重要的作用［27］。抑制腫瘤血管新生是抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要策略，目前除了利用某些病毒載體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的天然靶向殺傷作用外，還可利用溶瘤病毒載體表達(dá)血管生長(zhǎng)因子抑制劑、IL、趨化因子等來(lái)抑制腫瘤新血管生成［28］。

利用VSV 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的天然靶向性，感染VSV 可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Breitbach等［29］在結(jié)直腸癌異種移植模型小鼠中通過(guò)靜脈注射VSV，檢測(cè)到腫瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）的感染，隨后，腫瘤組織中出現(xiàn)血液凝固以及嗜中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的死亡，而在正常組織中則沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了野生型VSV 可以特異性感染腫瘤組織中的ECs，并發(fā)揮有效的抑瘤效果。

利用溶瘤病毒載體表達(dá)sFlt-1、IL-24、PF4 等血管生長(zhǎng)因子抑制劑可提高其抑制腫瘤新血管生成的能力，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。ZD55-sflt-1是第一個(gè)被報(bào)道表達(dá)血管生長(zhǎng)因子抑制劑的溶瘤腺病毒，其在E1B上55 ku缺失的同時(shí)表達(dá)可溶性的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑sFlt-1，在人結(jié)直腸癌的動(dòng)物模型中顯示出對(duì)腫瘤血管生成的抑制效果［30］。IL-24 屬于IL-10 蛋白家族成員，是一種有效的抗血管生成細(xì)胞因子，可以抑制血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的特異性凋亡［31］。Chai等［32］在條件復(fù)制型腺病毒的E4片段前插入IL-24基因，構(gòu)建了表達(dá)IL-24的重組腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24，并在此基礎(chǔ)上在E1 區(qū)域插入抗血管生成的Arresten 片段構(gòu)建HE1B55D-RGD。將這兩種溶瘤腺病毒進(jìn)行裸鼠黑色素瘤移植瘤模型給藥后，蛋白質(zhì)檢測(cè)、免疫染色和病理分析發(fā)現(xiàn)，IL-24 蛋白通過(guò)抑制VEGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的活性來(lái)發(fā)揮其抗血管生成活性。此外，IL-18、IL-12和趨化因子如血小板因子4（platelet factor 4，PF4）在腫瘤的動(dòng)物模型中均顯示具備有效的抗血管生成作用。

通過(guò)上述兩種方式靶向抑制腫瘤組織新血管生成，不僅可以有效提高溶瘤病毒的靶向性和溶瘤效果，還可以抑制給藥部位遠(yuǎn)端的腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步提升溶瘤病毒的抑瘤效果。

3.3 改善腫瘤免疫抑制狀態(tài)

腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)限制了腫瘤免疫療法的療效。腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)并維持免疫抑制狀態(tài)主要有兩種方式：a.在腫瘤周?chē)奂{(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg cells）［33］、髓源性抑制細(xì)胞（myeloidderived suppressor cells，MDSCs）［34］等免疫抑制細(xì)胞，隨后這些免疫抑制細(xì)胞分泌免疫抑制因子，使細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）失活，形成腫瘤的免疫抑制狀態(tài)［35］；b.誘導(dǎo)免疫檢查點(diǎn)分子如程序性死亡配體1/程序性死亡1（programmed death-ligand 1/programmed death-1，PD-L1/PD-1）、半乳糖凝集素9（galectin-9）/TIM-3、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）等的表達(dá)，通過(guò)抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸，形成腫瘤免疫抑制狀態(tài)［36］。而溶瘤病毒可以通過(guò)表達(dá)多種細(xì)胞因子和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs），以及與嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）聯(lián)合作用來(lái)靶向調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫抑制狀態(tài)并增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫能力［37-38］。

3.3.1 表達(dá)多種細(xì)胞因子

IL 是由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他非單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。IL-12 是一種由DCs 分泌的多效應(yīng)細(xì)胞因子，可以激活先天免疫和適應(yīng)性免疫，并且在Th1型抗腫瘤免疫中起重要作用［39］。通過(guò)基因工程手段構(gòu)建了表達(dá)IL-12 的溶瘤痘苗病毒vvDD-IL-12-FG，該病毒能有效募集CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞并誘導(dǎo)其活化，并在增加IFN-γ 表達(dá)的同時(shí)降低TGF-β和VEGF 的表達(dá)，因此，vvDD-IL-12-FG 可以有效改善腫瘤免疫抑制環(huán)境，提高結(jié)腸癌小鼠的生存周期和生存率［40］。

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）是屬于集落刺激因子的一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，其可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移和成熟，隨后增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用。在HSV-1 的ICP34.5 和ICP47 缺失的同時(shí)表達(dá)GM-CSF，構(gòu)建重組病毒T-VEC，其不僅可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制，還可以通過(guò)激活宿主全身的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，靶向調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境，進(jìn)一步提高靶向性和溶瘤效果［41］，并在2015年被FDA 批準(zhǔn)用于黑色素瘤的治療。不僅如此，基于痘苗病毒表達(dá)GM-CSF的Pexa-Vec在肝細(xì)胞癌的治療方面已進(jìn)入Ⅲ期臨床［42］。

趨化因子是一種可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移和淋巴組織發(fā)育的小型分泌蛋白，在腫瘤組織中，不同的趨化因子可以誘導(dǎo)不同的免疫細(xì)胞遷移到腫瘤微環(huán)境中，從而調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)［43］。CCL19 可以與表達(dá)其受體CCR7 的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（cytokine induced killer，CIK）細(xì)胞直接作用發(fā)揮抗腫瘤作用，利用tk和vgf共同缺失的重組痘苗病毒vvDD 為載體，構(gòu)建表達(dá)CCL19 的重組病毒vvCCL19，在小鼠結(jié)腸癌的體內(nèi)外模型發(fā)現(xiàn)，vvCCL19 通過(guò)將樹(shù)突狀細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞募集到腫瘤細(xì)胞附近，改變腫瘤細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)宿主的抗腫瘤免疫［44］。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）具有殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫、參與炎癥反應(yīng)等功能。CD40L 是一種免疫激活劑，屬于TNF 超家族中Ⅱ型跨膜蛋白，在活化的CD4+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和記憶性的CD8+T 細(xì)胞表達(dá)［45］。CD40L與其受體CD40 相互作用可以通過(guò)活化巨噬細(xì)胞、激活NK 細(xì)胞并使NK 細(xì)胞增殖，從而改善TME，促進(jìn)機(jī)體的抗腫瘤免疫［46］。Pesonen等［47］構(gòu)建了表達(dá)CD40L的重組腺病毒CGTG-401，在治療多名晚期肺癌等實(shí)體瘤患者過(guò)程中觀察到顯著的腫瘤特異性T 細(xì)胞反應(yīng)并有效改善患者的預(yù)后。此外，TNF 超家族成員OX40 及其配體OX40L 也可以作為腫瘤免疫治療的靶分子。Yl?smaki等［48］構(gòu)建同時(shí)表達(dá)CD40L 和OX40L 兩種免疫刺激分子的重組腺病毒VALO-D102，其中，CD40L 可通過(guò)APCs激活CD8+T 細(xì)胞影響先天免疫，而OX40L 可促使CD8+T 細(xì)胞增殖，形成記憶性T 細(xì)胞庫(kù)，因此VALO-D102 可以通過(guò)激活先天免疫和適應(yīng)性免疫逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境中免疫抑制狀態(tài)。

3.3.2 表達(dá)ICIs

免疫檢查點(diǎn)分子CTLA-4、TIM-3.PD-1等在許多免疫細(xì)胞表面表達(dá)，當(dāng)其與腫瘤細(xì)胞表面配體特異性結(jié)合后通過(guò)腫瘤免疫逃避對(duì)抗腫瘤免疫發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，ICIs通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合阻斷免疫檢查點(diǎn)分子的負(fù)調(diào)控通路，恢復(fù)抗機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫［49］。使用tk和vgf基因缺失的減毒痘苗病毒為載體，以PD-1 的胞外結(jié)構(gòu)域作為PD-L1 的抑制劑iPD-L1，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)GM-CSF 和iPD-L1 的重組痘苗病毒VV-iPDL1/GM，當(dāng)其感染腫瘤細(xì)胞后，其表達(dá)的iPD-L1 可以通過(guò)自分泌和旁分泌的方式與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1結(jié)合，從而恢復(fù)抗腫瘤細(xì)胞免疫，隨后使用VV-iPDL1/GM 對(duì)B16-F10 小鼠黑色素瘤模型進(jìn)行瘤內(nèi)給藥，流式數(shù)據(jù)顯示其可以促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)性DCs的成熟和腫瘤新抗原特異性T細(xì)胞的活化，為腫瘤的靶向治療，特別是對(duì)PD1/PDL1 阻斷治療有耐藥性的患者，提供一個(gè)更有效的靶向治療方案［50］。此外，以HSV-1 為載體，表達(dá)PD-1特異性單鏈抗體的溶瘤病毒NG34scFvPD-1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床前研究中顯示，其可以通過(guò)恢復(fù)腫瘤特異性T細(xì)胞活性改變腫瘤的免疫抑制狀態(tài)，且在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)形成記憶性抗腫瘤免疫，為靶向治療PD-1 高表達(dá)的腫瘤提供了數(shù)據(jù)支持［51］。因此，使用溶瘤病毒表達(dá)ICIs的部分片段，可以避免ICIs 在治療過(guò)程中引起過(guò)激的免疫反應(yīng)，在發(fā)揮靶向抗腫瘤功能的同時(shí)降低ICIs的副作用。

3.3.3 與CAR-T聯(lián)合作用

CAR-T 是腫瘤免疫療法的一種新興手段，利用抗原抗體特異性結(jié)合將T細(xì)胞募集到腫瘤細(xì)胞附近，以殺傷腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)，CAR-T 療法廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究，并被FDA 批準(zhǔn)用于淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病的治療，但由于TME 中的免疫抑制和CAR-T 遞送系統(tǒng)能力有限等不足限制了其在實(shí)體瘤的應(yīng)用［52］。溶瘤病毒可以通過(guò)對(duì)病毒載體進(jìn)行修飾，使目的基因定向表達(dá)，特異性增強(qiáng)抗腫瘤免疫，在治療實(shí)體瘤的研究中發(fā)揮重要作用［53］。因此，對(duì)溶瘤病毒和CAR-T 療法進(jìn)行聯(lián)用可以靶向調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境同時(shí)提高抗腫瘤能力。使用選擇性腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的溶瘤病毒表達(dá)CAR-T 特異性抗原，在提高靶向性的同時(shí)募集CAR-T 細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，促進(jìn)抗腫瘤免疫，隨后CAR-T裂解腫瘤細(xì)胞促進(jìn)了子代病毒的釋放，進(jìn)一步增強(qiáng)其抗腫瘤效果［54］。CD19是B淋巴細(xì)胞及濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞的表面蛋白，參與B細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)功能，其作為CAR-T 的靶點(diǎn)在B 細(xì)胞惡性腫瘤的研究中進(jìn)入臨床和臨床前研究［55］。Aalipour等［56］以tk 功能受損的痘苗病毒為載體，將CD19選擇性遞送至腫瘤細(xì)胞表面，并構(gòu)建了CD19 CAR-T 細(xì)胞，在B16 和HeLa 等實(shí)體瘤體內(nèi)外模型中驗(yàn)證了溶瘤病毒和CAR-T 聯(lián)合治療可以提高溶瘤病毒靶向性，并通過(guò)CAR-T 調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境，進(jìn)一步提高抗腫瘤效果和小鼠的預(yù)后，也為CAR-T在實(shí)體瘤中的治療開(kāi)辟了新的方向。

Fig.1 Tumor targeting mechanism of oncolytic virus圖1 溶瘤病毒靶向腫瘤的機(jī)制

4 挑戰(zhàn)與展望

早期的溶瘤病毒療法大多使用天然病毒，雖然其在實(shí)體瘤和少量轉(zhuǎn)移瘤的治療過(guò)程中取得一定效果，但存在靶向性差、副作用大、無(wú)法引起有效的腫瘤免疫、僅能通過(guò)瘤內(nèi)給藥等缺陷。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，溶瘤病毒的研究取得了巨大的進(jìn)步。腫瘤靶向性得到巨大提升，毒副作用明顯降低，通過(guò)插入細(xì)胞因子等提升宿主的抗腫瘤免疫，這些為難治性實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移瘤的治療帶來(lái)希望［57］。

雖然溶瘤病毒療法取得了巨大的進(jìn)步，但在治療過(guò)程中也存在許多障礙。溶瘤病毒屬于活病毒，可以在宿主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)溶瘤病毒進(jìn)行清除，所以在治療過(guò)程中如何動(dòng)態(tài)保持有效的溶瘤劑量是現(xiàn)今需要解決的問(wèn)題。不僅如此，病毒載體和外源基因能否穩(wěn)定地在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，為溶瘤病毒的安全性帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)［38］。除此之外，溶瘤病毒的給藥途徑和臨床患者的選擇都將成為溶瘤病毒發(fā)展過(guò)程中需要解決的困難。

隨著科技不斷發(fā)展以及人們對(duì)溶瘤病毒載體和腫瘤發(fā)病機(jī)制等研究的深入，使用天然溶瘤病毒或基因工程修飾的溶瘤病毒、與其他療法和藥物聯(lián)合治療等都為靶向治療腫瘤提供了新的方向。因此，溶瘤病毒在今后必將會(huì)成為對(duì)抗腫瘤的“主力軍”，在人類(lèi)抗腫瘤事業(yè)和人類(lèi)健康中發(fā)揮積極作用。