王澤魯 梁俊波 王曉月

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005）

基因組編輯工具，尤其是基于CRISPR系統(tǒng)的單堿基編輯器自推出以來就顯示了廣闊的臨床應(yīng)用前景［1］。單堿基編輯器（base editors，BEs）能高效地對指定位點(diǎn)的單個(gè)核苷酸變異（SNV）進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)，為治療遺傳性疾病提供了良好方案［2-3］。主流的BEs 由催化活性受損的Cas9 酶連接脫氨酶構(gòu)成，在單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）的指導(dǎo)下，定位到預(yù)先設(shè)計(jì)的基因組位置發(fā)揮作用［4］。根據(jù)實(shí)現(xiàn)的單堿基替換類型，BEs可分為腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）和胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）。ABEs 能實(shí)現(xiàn)A 到G 的直接轉(zhuǎn)換，CBEs能將C 轉(zhuǎn)換為T［3，5］。綜合ABEs 和CBEs，它們能實(shí)現(xiàn)對所有轉(zhuǎn)換類型SNVs的修復(fù)。在人類致病性遺傳變異中，點(diǎn)突變占比58%，點(diǎn)突變類型為“轉(zhuǎn)換”的SNVs 占61%。BE 校正SNVs 除了在DNA水平精準(zhǔn)修復(fù)，還可以在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行修復(fù)。利用密碼子的簡并性，蛋白質(zhì)水平的校正增加了可選用的BEs范圍，也增加了在已有的BEs種類下可實(shí)現(xiàn)校正的SNVs范圍［6］。

近年來，多種ABEs 和CBEs 被開發(fā)出來。2020年，研究者又開發(fā)出可介導(dǎo)CG堿基顛換的單堿基編輯工具CGBEs，在編輯效率和產(chǎn)物純度得到極大提高后，CGBEs 在未來研究中的應(yīng)用極具潛力［7］。以上多種BEs在識別的原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列、具有編輯活性的序列范圍等屬性上有所差異［6，8-9］。對目標(biāo)點(diǎn)突變進(jìn)行編輯時(shí)，需要結(jié)合點(diǎn)突變的類型及其背景序列特點(diǎn)，選擇合適的BEs 和sgRNA［10］。因此，借助計(jì)算工具來設(shè)計(jì)sgRNA 十分必要。不同于Cas9在編輯位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（DSBs），BEs 不會引入DSBs，從而被認(rèn)為是更安全的基因組編輯工具［2］。在應(yīng)用于臨床之前，十分有必要對BEs的特異性進(jìn)行詳盡的評估。

目前，雖然有較多工具可以實(shí)現(xiàn)BEs 的sgRNA設(shè)計(jì)，如BE-designer［5］、BE-FF［6］、beditor［11］，但缺少工具將下游的脫靶（off-target，OT）圖譜分析及脫靶產(chǎn)物注釋納入［12-13］。已有預(yù)測CRISPR 系統(tǒng)脫靶的工具，如Cas-OFFinder［14］、CFD［15］、uCRISPR［16］；最新開發(fā)出的預(yù)測BEs 脫靶編輯效率工具BEdeepoff 包含了兩個(gè)獨(dú)立工具——ABEdeepoff 和CBEdeepoff。它們分別基于ABEmax 和BE4max 在成對的sgRNA-脫靶DNA 高通量文庫上的編輯效率構(gòu)建得到［17］。以上預(yù)測脫靶工具可以對脫靶位點(diǎn)以及脫靶位點(diǎn)處的編輯活性進(jìn)行預(yù)測，然而不同工具在預(yù)測結(jié)果上具有差異［18-19］，綜合使用多個(gè)脫靶預(yù)測工具可以為脫靶評估提供更全面的參考。

基于此，本文提出了綜合性工具BE-dot，BEdot 實(shí)現(xiàn)了設(shè)計(jì)sgRNA，綜合多個(gè)工具預(yù)測脫靶圖譜以及對脫靶產(chǎn)物進(jìn)行功能注釋的完整過程。借鑒已有工具BE-FF 對SNVs 的同義校正，BE-dot 在設(shè)計(jì)sgRNA 時(shí)不僅提供了在DNA 水平上對SNVs 的精確校正方案，還提供了在蛋白質(zhì)水平校正突變的方案，使得非轉(zhuǎn)換類型的SNVs 也有可能被BEs 校正。在臨床應(yīng)用中除了必要考慮的單堿基編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，BEs在靶向位點(diǎn)的編輯效率也是評估編輯方案優(yōu)劣的重要方面，尤其是針對某一SNV有多個(gè)可選用的BE-sgRNA方案時(shí)。因此，BE-dot添加了BE-Hive［20］作為預(yù)測候選sgRNA 編輯效率的工具，以對用戶提供更全面的參考信息。另外，BE-dot允許用戶使用自定義的BEs，能更靈活、更具有實(shí)用性地設(shè)計(jì)sgRNA。軟件的下載地址為：https://github.com/wendyw630/BE-dot。

1 方 法

1.1 sgRNA的設(shè)計(jì)

本研究面向的基因組為人類基因組GRCh38，BE-dot的總工作流程見圖1。針對用戶需要編輯的SNV，用戶調(diào)用BE-dot 來設(shè)計(jì)sgRNA 可通過輸入方式一——rsID，或輸入方式二——SNV及其上下游各50 nt 序列。若用戶提供的為rsID，BE-dot 調(diào)用python Bio 程序包的Entrez.efetch 模塊，以URL格式訪問NCBI的Entrez 數(shù)據(jù)庫，檢索其子數(shù)據(jù)庫“SNP”。將檢索到的序列保存到本地目錄下，然后使用Bio 程序包的SeqIO模塊去解析它，可以得到rsID在“SNP_ID”、“CLINICAL_SIGNIFICANCE”、“GENE_ID”、“CHRPOS”、“FXN_CLASS”、“DOCSUM”等方面的信息，進(jìn)一步解析“DOCSUM”中以HGVS［21］表達(dá)式記錄的cDNA 水平的突變信息，可以得到SNV 的突變類型。若用戶接受在蛋白質(zhì)水平上的校正，以方式二輸入時(shí)還需提供SNV 所在密碼子閱讀框的位置（1或2或3）。

通過判斷SNV 類型，選擇適用的BEs 類型為ABEs 或CBEs 或CGBEs。對于突變?yōu)門→C或A→G，選用CBEs；突變?yōu)镚→A 或C→T，選用ABEs；突變?yōu)镚→C 或C→G，選用CGBEs。確定BEs 類型后，BE-dot 對于該類型內(nèi)的所有BEs 篩選。將SNV 在某BE 的編輯窗口的各個(gè)位置滑動(dòng)，若SNV 在編輯窗口內(nèi)的該位置時(shí)能滿足PAM 要求，并同時(shí)滿足編輯窗口內(nèi)僅有SNV 突變堿基這一個(gè)BE 能編輯的堿基類型，則該BE 及相應(yīng)位置的sgRNA 可對該SNV 進(jìn)行精確修復(fù)；若編輯窗口內(nèi)BE可編輯的不只有SNV突變后的堿基，則可能發(fā)生旁編輯（bystander editing），如果對SNV 的編輯連同旁編輯可以修復(fù)SNV 對蛋白質(zhì)的影響，則該BE及相應(yīng)位置的sgRNA記為 “同義修復(fù)”。

1.2 脫靶圖譜的預(yù)測

BE-dot 提供預(yù)測脫靶圖譜的工具有Cas-OFFinder、CALITAS、CFD-score、uCRISPR、BEdeepoff（表1）。其中可用于預(yù)測脫靶位點(diǎn)的工具有Cas-OFFinder 和CALITAS；可用于預(yù)測BEs在脫靶位點(diǎn)處編輯活性的工具有CFD-score、uCRISPR、BEdeepoff，它們不做脫靶位點(diǎn)的預(yù)測，都是基于Cas-OFFinder 的搜索結(jié)果進(jìn)行編輯活性預(yù)測。

Cas-OFFinder 在更新的3.0 及更高版本中增加了對DNA 凸起、RNA 凸起的考慮，即認(rèn)為存在sgRNA 與DNA 配對中兩者堿基數(shù)不相等的脫靶。在本研究中，BE-dot 設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)是：存在DNA 凸起或者RNA 凸起的最大值為1，sgRNADNA 錯(cuò)配數(shù)最大值為3。CALITAS 設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)中DNA凸起和RNA凸起總數(shù)最大為2，sgRNADNA錯(cuò)配數(shù)為3。

Fig.1 The overall workflow of BE-dot

Table 1 List of 5 OT prediction tools contained in BE-dot

CFD得分可以拆解為獨(dú)立sgRNA-DNA匹配情況的得分和PAM序列得分，其中PAM序列得分規(guī)則是基于觀測CRISPR/Cas9 結(jié)合相同sgRNA、不同PAM序列時(shí)的切割活性得到的，其PAM序列的偏好性在PAM序列不是NGG的單堿基編輯系統(tǒng)中很難適用。BE-dot 舍棄了CFD 得分中對PAM 序列打分的部分，保留了其對sgRNA-DNA匹配情況的打分。

BEdeepoff 是基于成對的sgRNA-脫靶DNA 高通量試驗(yàn)，分別檢測ABEmax和BE4max單堿基編輯器在脫靶DNA 上的編輯效率，構(gòu)建得到預(yù)測模型ABEdeepoff、CBEdeepoff。在設(shè)計(jì)的sgRNA-脫靶DNA 文庫中，考慮了含有堿基插入、缺失的情況，因此BEdeepoff 可對含有DNA 或RNA 凸起的OT位點(diǎn)做脫靶活性的預(yù)測。由于CFD和uCRISPR只針對無DNA 或RNA 凸起的OT 位點(diǎn)做脫靶活性的預(yù)測，因此Cas-OFFinder 找到的OT 位點(diǎn)中與sgRNA 等長度匹配的OT 作為CFD 和uCRISPR 的輸入。

用戶運(yùn)行BE-dot 的脫靶預(yù)測模塊時(shí)，可參考操作說明（圖2）輸入相應(yīng)的參數(shù)。其中，OTprediction 模塊對部分參數(shù)提供了默認(rèn)值，它們是mismatch_number（默認(rèn)值取3）、DNAbulge（默認(rèn)值取1）、RNAbulge，（默認(rèn)值取1）。

Fig.2 Screen shot of command lines of BE-dot OT prediction

1.3 使用ANNOVAR對脫靶編輯產(chǎn)物進(jìn)行功能注釋

對于潛在的脫靶位點(diǎn)，可能存在sgRNA 與這段DNA配對，使得BE在此編輯產(chǎn)生試驗(yàn)設(shè)計(jì)之外的點(diǎn)突變。BE-dot的OTannotation模塊實(shí)現(xiàn)了將某個(gè)OT位點(diǎn)上所有的編輯結(jié)果進(jìn)行窮舉，并將各種點(diǎn)突變組合自動(dòng)轉(zhuǎn)換為ANNOVAR［23］的輸入文件格式。

該模塊需要用戶提供BE 名稱，BE-dot 將結(jié)合BE 的堿基轉(zhuǎn)換類型和編輯窗口，遍歷脫靶序列上可能的編輯位點(diǎn)，列舉所有可能的脫靶編輯組合情況。

2 結(jié) 果

2.1 設(shè)計(jì)sgRNA的應(yīng)用舉例

rs80357410是人類17號染色體的第43 124 027位堿基發(fā)生了T到C的錯(cuò)義突變，ClinVar數(shù)據(jù)庫中的注釋顯示其位于BRCA1基因，多項(xiàng)研究表明該SNV與乳腺癌和卵巢癌相關(guān)［24-25］。對此，使用BEdot 的sgRNA 設(shè)計(jì)功能選擇可校正此點(diǎn)突變的BEs和sgRNA。

運(yùn)行如下命令：python BE-dot.py designsgRNA_opt1 --jobID job001 --upSeq GCGTTGAAGAAGTACAAAATGTCATTAATGCTATGCAG AAAATCTTAGAG--downSeq GTCCCATCTGGTAAGTCAGCACAAGAGTGTATTAATTTGGGATTCC TATG --mut C --wt T --codon_frame 1 --outputPath/path/，因?yàn)樵揝NV在dbSNP數(shù)據(jù)庫中有相關(guān)記錄，所以可運(yùn)行命令：python BE-dot.py designsgRNA_opt2 --rsID rs80357410 --outputPath/path/

sgRNA的設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，BE-dot提供的堿基編輯器中能對該SNV精確修復(fù)的有Target-AID-NG、xBE3、SpRY-PmCDA1、SpRY-BE4max。此外，能在蛋白質(zhì)水平修復(fù)的堿基編輯器有BE-PLUS、evoCDA1-BE4max。盡管它們的編輯窗口內(nèi)除了目標(biāo)編輯的C，編輯位點(diǎn)的上游7 nt處還存在一個(gè)C，但該C 位于的密碼子為ATC，與非目標(biāo)編輯產(chǎn)物ATT同樣翻譯為異亮氨酸。由于BE-Hive中目前包含的BEs類型有限，在本次校正中能進(jìn)行編輯效率預(yù)測的只有CP-CBEmax-variants，其預(yù)測值（Z-score）為-0.19，略低于平均水平。

Table 2 BE-dot’s sgRNA design scheme for correcting rs803574101）

BE-dot 納入了CGBEs，可以實(shí)現(xiàn)對突變類型為C→G和G→C的SNV的糾正，使得以往不能直接利用ABEs、CBEs 進(jìn)行編輯的SNV 有了可能的編輯方案。統(tǒng)計(jì)ClinVar數(shù)據(jù)庫中被記錄為“致病性”和“可能具有致病性”的SNV 記錄共43 925 條，其中C：G 突變?yōu)門：A 的SNV 占比最大，有20 918個(gè)；A：T 突變?yōu)镚：C 的SNV 占比15%，有6 410個(gè)；C：G→G：C占11%，有3 704個(gè)（圖3a）。利用BE-dot 對以上3 種突變類型的SNV 設(shè)計(jì)編輯方案，綜合精確修復(fù)和同義修復(fù)的設(shè)計(jì)結(jié)果，可以對 15 724個(gè)具有和可能具有致病性的C：G→T：A突變進(jìn)行糾正，A：T→G：C 可編輯的有5 272 個(gè)，C：G→G：C可編輯的有1 306個(gè)（圖3b）。

2.2 預(yù)測BE的脫靶圖譜可以指導(dǎo)BEs和sgRNA的選擇

Fig.3 Pathogenic SNV type and BEs editable SNV ratio

脫靶圖譜是評估BEs的重要方面，具有高度特異性的BEs 才有可能發(fā)展到臨床應(yīng)用。對于rs80357410 設(shè)計(jì)的8 個(gè)可選用的BEs，結(jié)合各自對應(yīng)的sgRNA進(jìn)行脫靶數(shù)量的預(yù)測，得出的OT數(shù)量的預(yù)測結(jié)果見圖4a。預(yù)測結(jié)果中，Cas-OFFinder預(yù)測的脫靶數(shù)量顯著多于CALITAS預(yù)測數(shù)量（配對t檢驗(yàn)，P=0.004 534）。相較于PAM 序列為NG 和NRN的BE類型，PAM序列為NGG的BE-PLUS和evoCDA1-BE4max 在全基因組范圍內(nèi)預(yù)測的脫靶位點(diǎn)數(shù)量最少，特異性最高。在編輯效率等方面可以滿足要求的情況下，應(yīng)優(yōu)先選擇BE-PLUS 或evoCDA1-BE4max。

BE-PLUS 在脫靶位點(diǎn)處的編輯活性預(yù)測由CFD、uCRISPR、BEdeepoff 給出（表3）。表3 保留了BEdeepoff 預(yù)測脫靶編輯效率大于0.2 的記錄。由于CFD 和uCRISPR 只能對sgRNA 和DNA 長度一致的匹配做出活性預(yù)測，因此表中列出的脫靶序列來自Cas-OFFinder 和CALITAS 預(yù)測結(jié)果中的無DNA 或RNA 凸起的部分。兩個(gè)軟件在這4 個(gè)脫靶位點(diǎn)處的預(yù)測得分排名是基本一致的，其中脫靶活性最高的位點(diǎn)位于17 號染色體43 124 016～ 43 124 038位，與sgRNA序列比對時(shí)僅5'端第12位堿基存在錯(cuò)配。綜合以上分析，需要特別注意 BE-PLUS 對應(yīng)的gRNA 在17 號染色體43 124 016～43 124 038位的脫靶。

Fig.4 OT quantity and BE-PLUS system’s OT site distribution

Table 3 BE-PLUS cleavage efficiency on OT sites corresponding to different prediction tools

2.3 對脫靶編輯產(chǎn)物進(jìn)行功能注釋的應(yīng)用舉例

對選定的BE 和sgRNA 進(jìn)行脫靶圖譜的分析后，還可以利用BE-dot 對高風(fēng)險(xiǎn)的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯產(chǎn)物的分析。結(jié)合rs80357410示例中找到的表3 所示的4 個(gè)具有最高脫靶編輯活性的位點(diǎn)，將Cas-OFFinder 運(yùn)行結(jié)果中這4 個(gè)位點(diǎn)的相應(yīng)記錄提取出來，作為輸入文件4ots_BE_PLUS.txt，運(yùn)行命令python BE-dot.py OTannotation -BE BE-PLUS -i 4ots_BE_PLUS.txt -o/path/，即可得到所有的脫靶SNV 組合情況，共得到7 條突變記錄（表4）。調(diào)用ANNOVAR 文件做功能注釋后得到發(fā)生在外顯子區(qū)的脫靶SNV 有1 個(gè)，屬于BRCA1基因位于17號染色體的第43 124 035位，是同義突變；發(fā)生在內(nèi)含子和基因間區(qū)的SNV共有6個(gè)。

綜合以上分析，BE-PLUS 對應(yīng)的gRNA 盡管在基因組上有個(gè)別高脫靶活性位點(diǎn)，但其脫靶編輯并不會對基因組或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物產(chǎn)生有害的影響。

Table 4 The list of all possible editing products on BE-PLUS 4 OT hot sites

3 討 論

隨著單堿基編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對某一點(diǎn)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的sgRNA已經(jīng)成為普遍需求。對此，已有多個(gè)sgRNA 設(shè)計(jì)工具問世，如BEdesigner、BE-FF、beditor。已有的可用于預(yù)測BE脫靶效應(yīng)的工具也經(jīng)歷了由經(jīng)典基于比對的Cas-OFFinder 增加到基于假設(shè)、基于機(jī)器學(xué)習(xí)、基于能量等多種類型的工具［14，18，26-27］。盡管相關(guān)的工具數(shù)量較多，目前仍沒有工具對sgRNA 設(shè)計(jì)、脫靶效應(yīng)評估及下游的功能注釋等完整過程進(jìn)行整合，沒有對BEs脫靶提供功能相同的多種工具的綜合評價(jià)。

基于此，本文開發(fā)了BE-dot，實(shí)現(xiàn)了僅需用戶提供SNV，即可完成sgRNA 設(shè)計(jì)、脫靶效應(yīng)預(yù)測和脫靶產(chǎn)物功能注釋的完整流程。為用戶提供在DNA 水平和蛋白質(zhì)水平修復(fù)某一SNV 時(shí)所有可選用的BEs 以及可設(shè)計(jì)的sgRNA。BE-dot 利用多個(gè)脫靶預(yù)測工具預(yù)測脫靶圖譜，更容易確定脫靶熱點(diǎn)，避免了使用單一工具的偏差。此外，BE-dot可以自動(dòng)列舉脫靶位點(diǎn)處所有可能的編輯產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)換為ANNOVAR 變異注釋所要求的格式，使得用戶能方便快速地獲得脫靶編輯產(chǎn)生的功能影響。

根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果［2，28］，關(guān)于誘導(dǎo)產(chǎn)生BEs脫靶的因素尚無明確的結(jié)論。BE-dot 考慮的脫靶類型主要是由sgRNA 序列相似性引起的脫靶。另外，當(dāng)前版本的BE-dot 的功能僅面向基因組GRCh38，將來會包含多種基因組，擴(kuò)大其應(yīng)用的范圍。

4 結(jié) 論

本研究建立了一個(gè)對SNVs設(shè)計(jì)單堿基編輯方案并對編輯方案的脫靶圖譜進(jìn)行全面評估的綜合分析工具——BE-dot（https://github.com/wendyw630/BE-dot）。BE-dot 在設(shè)計(jì)單堿基編輯方案中包含了27 種CBEs 和12 種ABEs。BE-dot 不僅提供了在DNA 水平上的精確修復(fù)方案，還提供了在蛋白質(zhì)水平上的同義修復(fù)方案，旨在利用已有的BEs對盡可能多的SNVs提供編輯方案。同時(shí)，它調(diào)用第三方工具BE-Hive對編輯方案的靶標(biāo)編輯效率進(jìn)行預(yù)測。在評估編輯方案的脫靶效應(yīng)時(shí)，BE-dot 納入了多個(gè)脫靶預(yù)測工具，便于確定脫靶熱點(diǎn)。此外，為了方便用戶查看脫靶編輯對基因功能的影響，BE-dot 能程序化地列舉所有可能的脫靶編輯產(chǎn)物并分析了脫靶產(chǎn)物所位于的基因組區(qū)域以及對基因功能的影響。使用BE-dot 的sgRNA 設(shè)計(jì)功能時(shí)，用戶需要提供SNV 的rsID 或包含SNV 在內(nèi)共計(jì)101 nt 的DNA 序列及SNV 所處的氨基酸密碼子閱讀框。提供BE-sgRNA編輯方案以及目標(biāo)編輯的基因組文件即可進(jìn)行脫靶位點(diǎn)的預(yù)測。

與其他軟件相比，BE-dot 首次實(shí)現(xiàn)了設(shè)計(jì)SNV 修復(fù)方案、脫靶評估以及脫靶功能影響的完整過程。對編輯方案從靶標(biāo)編輯效率以及脫靶效應(yīng)等方面進(jìn)行了全面的評估。旨在為生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)引入或修復(fù)SNVs設(shè)計(jì)編輯方案并對方案提供全面的評估和參考。