王澤魯 梁俊波 王曉月

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005）

基因組編輯工具，尤其是基于CRISPR系統(tǒng)的單堿基編輯器自推出以來就顯示了廣闊的臨床應(yīng)用前景［1］。單堿基編輯器（base editors，BEs）能高效地對指定位點的單個核苷酸變異（SNV）進行精準(zhǔn)修復(fù)，為治療遺傳性疾病提供了良好方案［2-3］。主流的BEs 由催化活性受損的Cas9 酶連接脫氨酶構(gòu)成，在單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）的指導(dǎo)下，定位到預(yù)先設(shè)計的基因組位置發(fā)揮作用［4］。根據(jù)實現(xiàn)的單堿基替換類型，BEs可分為腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）和胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）。ABEs 能實現(xiàn)A 到G 的直接轉(zhuǎn)換，CBEs能將C 轉(zhuǎn)換為T［3，5］。綜合ABEs 和CBEs，它們能實現(xiàn)對所有轉(zhuǎn)換類型SNVs的修復(fù)。在人類致病性遺傳變異中，點突變占比58%，點突變類型為“轉(zhuǎn)換”的SNVs 占61%。BE 校正SNVs 除了在DNA水平精準(zhǔn)修復(fù)，還可以在蛋白質(zhì)水平進行修復(fù)。利用密碼子的簡并性，蛋白質(zhì)水平的校正增加了可選用的BEs范圍，也增加了在已有的BEs種類下可實現(xiàn)校正的SNVs范圍［6］。

近年來，多種ABEs 和CBEs 被開發(fā)出來。2020年，研究者又開發(fā)出可介導(dǎo)CG堿基顛換的單堿基編輯工具CGBEs，在編輯效率和產(chǎn)物純度得到極大提高后，CGBEs 在未來研究中的應(yīng)用極具潛力［7］。以上多種BEs在識別的原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列、具有編輯活性的序列范圍等屬性上有所差異［6，8-9］。對目標(biāo)點突變進行編輯時，需要結(jié)合點突變的類型及其背景序列特點，選擇合適的BEs 和sgRNA［10］。因此，借助計算工具來設(shè)計sgRNA 十分必要。不同于Cas9在編輯位點產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（DSBs），BEs 不會引入DSBs，從而被認(rèn)為是更安全的基因組編輯工具［2］。在應(yīng)用于臨床之前，十分有必要對BEs的特異性進行詳盡的評估。

目前，雖然有較多工具可以實現(xiàn)BEs 的sgRNA設(shè)計，如BE-designer［5］、BE-FF［6］、beditor［11］，但缺少工具將下游的脫靶（off-target，OT）圖譜分析及脫靶產(chǎn)物注釋納入［12-13］。已有預(yù)測CRISPR 系統(tǒng)脫靶的工具，如Cas-OFFinder［14］、CFD［15］、uCRISPR［16］；最新開發(fā)出的預(yù)測BEs 脫靶編輯效率工具BEdeepoff 包含了兩個獨立工具——ABEdeepoff 和CBEdeepoff。它們分別基于ABEmax 和BE4max 在成對的sgRNA-脫靶DNA 高通量文庫上的編輯效率構(gòu)建得到［17］。以上預(yù)測脫靶工具可以對脫靶位點以及脫靶位點處的編輯活性進行預(yù)測，然而不同工具在預(yù)測結(jié)果上具有差異［18-19］，綜合使用多個脫靶預(yù)測工具可以為脫靶評估提供更全面的參考。

基于此，本文提出了綜合性工具BE-dot，BEdot 實現(xiàn)了設(shè)計sgRNA，綜合多個工具預(yù)測脫靶圖譜以及對脫靶產(chǎn)物進行功能注釋的完整過程。借鑒已有工具BE-FF 對SNVs 的同義校正，BE-dot 在設(shè)計sgRNA 時不僅提供了在DNA 水平上對SNVs 的精確校正方案，還提供了在蛋白質(zhì)水平校正突變的方案，使得非轉(zhuǎn)換類型的SNVs 也有可能被BEs 校正。在臨床應(yīng)用中除了必要考慮的單堿基編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，BEs在靶向位點的編輯效率也是評估編輯方案優(yōu)劣的重要方面，尤其是針對某一SNV有多個可選用的BE-sgRNA方案時。因此，BE-dot添加了BE-Hive［20］作為預(yù)測候選sgRNA 編輯效率的工具，以對用戶提供更全面的參考信息。另外，BE-dot允許用戶使用自定義的BEs，能更靈活、更具有實用性地設(shè)計sgRNA。軟件的下載地址為：https://github.com/wendyw630/BE-dot。

1 方 法

1.1 sgRNA的設(shè)計

本研究面向的基因組為人類基因組GRCh38，BE-dot的總工作流程見圖1。針對用戶需要編輯的SNV，用戶調(diào)用BE-dot 來設(shè)計sgRNA 可通過輸入方式一——rsID，或輸入方式二——SNV及其上下游各50 nt 序列。若用戶提供的為rsID，BE-dot 調(diào)用python Bio 程序包的Entrez.efetch 模塊，以URL格式訪問NCBI的Entrez 數(shù)據(jù)庫，檢索其子數(shù)據(jù)庫“SNP”。將檢索到的序列保存到本地目錄下，然后使用Bio 程序包的SeqIO模塊去解析它，可以得到rsID在“SNP_ID”、“CLINICAL_SIGNIFICANCE”、“GENE_ID”、“CHRPOS”、“FXN_CLASS”、“DOCSUM”等方面的信息，進一步解析“DOCSUM”中以HGVS［21］表達式記錄的cDNA 水平的突變信息，可以得到SNV 的突變類型。若用戶接受在蛋白質(zhì)水平上的校正，以方式二輸入時還需提供SNV 所在密碼子閱讀框的位置（1或2或3）。

通過判斷SNV 類型，選擇適用的BEs 類型為ABEs 或CBEs 或CGBEs。對于突變?yōu)門→C或A→G，選用CBEs；突變?yōu)镚→A 或C→T，選用ABEs；突變?yōu)镚→C 或C→G，選用CGBEs。確定BEs 類型后，BE-dot 對于該類型內(nèi)的所有BEs 篩選。將SNV 在某BE 的編輯窗口的各個位置滑動，若SNV 在編輯窗口內(nèi)的該位置時能滿足PAM 要求，并同時滿足編輯窗口內(nèi)僅有SNV 突變堿基這一個BE 能編輯的堿基類型，則該BE 及相應(yīng)位置的sgRNA 可對該SNV 進行精確修復(fù)；若編輯窗口內(nèi)BE可編輯的不只有SNV突變后的堿基，則可能發(fā)生旁編輯（bystander editing），如果對SNV 的編輯連同旁編輯可以修復(fù)SNV 對蛋白質(zhì)的影響，則該BE及相應(yīng)位置的sgRNA記為 “同義修復(fù)”。

1.2 脫靶圖譜的預(yù)測

BE-dot 提供預(yù)測脫靶圖譜的工具有Cas-OFFinder、CALITAS、CFD-score、uCRISPR、BEdeepoff（表1）。其中可用于預(yù)測脫靶位點的工具有Cas-OFFinder 和CALITAS；可用于預(yù)測BEs在脫靶位點處編輯活性的工具有CFD-score、uCRISPR、BEdeepoff，它們不做脫靶位點的預(yù)測，都是基于Cas-OFFinder 的搜索結(jié)果進行編輯活性預(yù)測。

Cas-OFFinder 在更新的3.0 及更高版本中增加了對DNA 凸起、RNA 凸起的考慮，即認(rèn)為存在sgRNA 與DNA 配對中兩者堿基數(shù)不相等的脫靶。在本研究中，BE-dot 設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)是：存在DNA 凸起或者RNA 凸起的最大值為1，sgRNADNA 錯配數(shù)最大值為3。CALITAS 設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)中DNA凸起和RNA凸起總數(shù)最大為2，sgRNADNA錯配數(shù)為3。

Fig.1 The overall workflow of BE-dot

Table 1 List of 5 OT prediction tools contained in BE-dot

CFD得分可以拆解為獨立sgRNA-DNA匹配情況的得分和PAM序列得分，其中PAM序列得分規(guī)則是基于觀測CRISPR/Cas9 結(jié)合相同sgRNA、不同PAM序列時的切割活性得到的，其PAM序列的偏好性在PAM序列不是NGG的單堿基編輯系統(tǒng)中很難適用。BE-dot 舍棄了CFD 得分中對PAM 序列打分的部分，保留了其對sgRNA-DNA匹配情況的打分。

BEdeepoff 是基于成對的sgRNA-脫靶DNA 高通量試驗，分別檢測ABEmax和BE4max單堿基編輯器在脫靶DNA 上的編輯效率，構(gòu)建得到預(yù)測模型ABEdeepoff、CBEdeepoff。在設(shè)計的sgRNA-脫靶DNA 文庫中，考慮了含有堿基插入、缺失的情況，因此BEdeepoff 可對含有DNA 或RNA 凸起的OT位點做脫靶活性的預(yù)測。由于CFD和uCRISPR只針對無DNA 或RNA 凸起的OT 位點做脫靶活性的預(yù)測，因此Cas-OFFinder 找到的OT 位點中與sgRNA 等長度匹配的OT 作為CFD 和uCRISPR 的輸入。

用戶運行BE-dot 的脫靶預(yù)測模塊時，可參考操作說明（圖2）輸入相應(yīng)的參數(shù)。其中，OTprediction 模塊對部分參數(shù)提供了默認(rèn)值，它們是mismatch_number（默認(rèn)值取3）、DNAbulge（默認(rèn)值取1）、RNAbulge，（默認(rèn)值取1）。

Fig.2 Screen shot of command lines of BE-dot OT prediction

1.3 使用ANNOVAR對脫靶編輯產(chǎn)物進行功能注釋

對于潛在的脫靶位點，可能存在sgRNA 與這段DNA配對，使得BE在此編輯產(chǎn)生試驗設(shè)計之外的點突變。BE-dot的OTannotation模塊實現(xiàn)了將某個OT位點上所有的編輯結(jié)果進行窮舉，并將各種點突變組合自動轉(zhuǎn)換為ANNOVAR［23］的輸入文件格式。

該模塊需要用戶提供BE 名稱，BE-dot 將結(jié)合BE 的堿基轉(zhuǎn)換類型和編輯窗口，遍歷脫靶序列上可能的編輯位點，列舉所有可能的脫靶編輯組合情況。

2 結(jié) 果

2.1 設(shè)計sgRNA的應(yīng)用舉例

rs80357410是人類17號染色體的第43 124 027位堿基發(fā)生了T到C的錯義突變，ClinVar數(shù)據(jù)庫中的注釋顯示其位于BRCA1基因，多項研究表明該SNV與乳腺癌和卵巢癌相關(guān)［24-25］。對此，使用BEdot 的sgRNA 設(shè)計功能選擇可校正此點突變的BEs和sgRNA。

運行如下命令：python BE-dot.py designsgRNA_opt1 --jobID job001 --upSeq GCGTTGAAGAAGTACAAAATGTCATTAATGCTATGCAG AAAATCTTAGAG--downSeq GTCCCATCTGGTAAGTCAGCACAAGAGTGTATTAATTTGGGATTCC TATG --mut C --wt T --codon_frame 1 --outputPath/path/，因為該SNV在dbSNP數(shù)據(jù)庫中有相關(guān)記錄，所以可運行命令：python BE-dot.py designsgRNA_opt2 --rsID rs80357410 --outputPath/path/

sgRNA的設(shè)計結(jié)果見表2，BE-dot提供的堿基編輯器中能對該SNV精確修復(fù)的有Target-AID-NG、xBE3、SpRY-PmCDA1、SpRY-BE4max。此外，能在蛋白質(zhì)水平修復(fù)的堿基編輯器有BE-PLUS、evoCDA1-BE4max。盡管它們的編輯窗口內(nèi)除了目標(biāo)編輯的C，編輯位點的上游7 nt處還存在一個C，但該C 位于的密碼子為ATC，與非目標(biāo)編輯產(chǎn)物ATT同樣翻譯為異亮氨酸。由于BE-Hive中目前包含的BEs類型有限，在本次校正中能進行編輯效率預(yù)測的只有CP-CBEmax-variants，其預(yù)測值（Z-score）為-0.19，略低于平均水平。

Table 2 BE-dot’s sgRNA design scheme for correcting rs803574101）

BE-dot 納入了CGBEs，可以實現(xiàn)對突變類型為C→G和G→C的SNV的糾正，使得以往不能直接利用ABEs、CBEs 進行編輯的SNV 有了可能的編輯方案。統(tǒng)計ClinVar數(shù)據(jù)庫中被記錄為“致病性”和“可能具有致病性”的SNV 記錄共43 925 條，其中C：G 突變?yōu)門：A 的SNV 占比最大，有20 918個；A：T 突變?yōu)镚：C 的SNV 占比15%，有6 410個；C：G→G：C占11%，有3 704個（圖3a）。利用BE-dot 對以上3 種突變類型的SNV 設(shè)計編輯方案，綜合精確修復(fù)和同義修復(fù)的設(shè)計結(jié)果，可以對 15 724個具有和可能具有致病性的C：G→T：A突變進行糾正，A：T→G：C 可編輯的有5 272 個，C：G→G：C可編輯的有1 306個（圖3b）。

2.2 預(yù)測BE的脫靶圖譜可以指導(dǎo)BEs和sgRNA的選擇

Fig.3 Pathogenic SNV type and BEs editable SNV ratio

脫靶圖譜是評估BEs的重要方面，具有高度特異性的BEs 才有可能發(fā)展到臨床應(yīng)用。對于rs80357410 設(shè)計的8 個可選用的BEs，結(jié)合各自對應(yīng)的sgRNA進行脫靶數(shù)量的預(yù)測，得出的OT數(shù)量的預(yù)測結(jié)果見圖4a。預(yù)測結(jié)果中，Cas-OFFinder預(yù)測的脫靶數(shù)量顯著多于CALITAS預(yù)測數(shù)量（配對t檢驗，P=0.004 534）。相較于PAM 序列為NG 和NRN的BE類型，PAM序列為NGG的BE-PLUS和evoCDA1-BE4max 在全基因組范圍內(nèi)預(yù)測的脫靶位點數(shù)量最少，特異性最高。在編輯效率等方面可以滿足要求的情況下，應(yīng)優(yōu)先選擇BE-PLUS 或evoCDA1-BE4max。

BE-PLUS 在脫靶位點處的編輯活性預(yù)測由CFD、uCRISPR、BEdeepoff 給出（表3）。表3 保留了BEdeepoff 預(yù)測脫靶編輯效率大于0.2 的記錄。由于CFD 和uCRISPR 只能對sgRNA 和DNA 長度一致的匹配做出活性預(yù)測，因此表中列出的脫靶序列來自Cas-OFFinder 和CALITAS 預(yù)測結(jié)果中的無DNA 或RNA 凸起的部分。兩個軟件在這4 個脫靶位點處的預(yù)測得分排名是基本一致的，其中脫靶活性最高的位點位于17 號染色體43 124 016～ 43 124 038位，與sgRNA序列比對時僅5'端第12位堿基存在錯配。綜合以上分析，需要特別注意 BE-PLUS 對應(yīng)的gRNA 在17 號染色體43 124 016～43 124 038位的脫靶。

Fig.4 OT quantity and BE-PLUS system’s OT site distribution

Table 3 BE-PLUS cleavage efficiency on OT sites corresponding to different prediction tools

2.3 對脫靶編輯產(chǎn)物進行功能注釋的應(yīng)用舉例

對選定的BE 和sgRNA 進行脫靶圖譜的分析后，還可以利用BE-dot 對高風(fēng)險的脫靶位點進行編輯產(chǎn)物的分析。結(jié)合rs80357410示例中找到的表3 所示的4 個具有最高脫靶編輯活性的位點，將Cas-OFFinder 運行結(jié)果中這4 個位點的相應(yīng)記錄提取出來，作為輸入文件4ots_BE_PLUS.txt，運行命令python BE-dot.py OTannotation -BE BE-PLUS -i 4ots_BE_PLUS.txt -o/path/，即可得到所有的脫靶SNV 組合情況，共得到7 條突變記錄（表4）。調(diào)用ANNOVAR 文件做功能注釋后得到發(fā)生在外顯子區(qū)的脫靶SNV 有1 個，屬于BRCA1基因位于17號染色體的第43 124 035位，是同義突變；發(fā)生在內(nèi)含子和基因間區(qū)的SNV共有6個。

綜合以上分析，BE-PLUS 對應(yīng)的gRNA 盡管在基因組上有個別高脫靶活性位點，但其脫靶編輯并不會對基因組或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物產(chǎn)生有害的影響。

Table 4 The list of all possible editing products on BE-PLUS 4 OT hot sites

3 討 論

隨著單堿基編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對某一點突變位點設(shè)計特異性強的sgRNA已經(jīng)成為普遍需求。對此，已有多個sgRNA 設(shè)計工具問世，如BEdesigner、BE-FF、beditor。已有的可用于預(yù)測BE脫靶效應(yīng)的工具也經(jīng)歷了由經(jīng)典基于比對的Cas-OFFinder 增加到基于假設(shè)、基于機器學(xué)習(xí)、基于能量等多種類型的工具［14，18，26-27］。盡管相關(guān)的工具數(shù)量較多，目前仍沒有工具對sgRNA 設(shè)計、脫靶效應(yīng)評估及下游的功能注釋等完整過程進行整合，沒有對BEs脫靶提供功能相同的多種工具的綜合評價。

基于此，本文開發(fā)了BE-dot，實現(xiàn)了僅需用戶提供SNV，即可完成sgRNA 設(shè)計、脫靶效應(yīng)預(yù)測和脫靶產(chǎn)物功能注釋的完整流程。為用戶提供在DNA 水平和蛋白質(zhì)水平修復(fù)某一SNV 時所有可選用的BEs 以及可設(shè)計的sgRNA。BE-dot 利用多個脫靶預(yù)測工具預(yù)測脫靶圖譜，更容易確定脫靶熱點，避免了使用單一工具的偏差。此外，BE-dot可以自動列舉脫靶位點處所有可能的編輯產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)換為ANNOVAR 變異注釋所要求的格式，使得用戶能方便快速地獲得脫靶編輯產(chǎn)生的功能影響。

根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果［2，28］，關(guān)于誘導(dǎo)產(chǎn)生BEs脫靶的因素尚無明確的結(jié)論。BE-dot 考慮的脫靶類型主要是由sgRNA 序列相似性引起的脫靶。另外，當(dāng)前版本的BE-dot 的功能僅面向基因組GRCh38，將來會包含多種基因組，擴大其應(yīng)用的范圍。

4 結(jié) 論

本研究建立了一個對SNVs設(shè)計單堿基編輯方案并對編輯方案的脫靶圖譜進行全面評估的綜合分析工具——BE-dot（https://github.com/wendyw630/BE-dot）。BE-dot 在設(shè)計單堿基編輯方案中包含了27 種CBEs 和12 種ABEs。BE-dot 不僅提供了在DNA 水平上的精確修復(fù)方案，還提供了在蛋白質(zhì)水平上的同義修復(fù)方案，旨在利用已有的BEs對盡可能多的SNVs提供編輯方案。同時，它調(diào)用第三方工具BE-Hive對編輯方案的靶標(biāo)編輯效率進行預(yù)測。在評估編輯方案的脫靶效應(yīng)時，BE-dot 納入了多個脫靶預(yù)測工具，便于確定脫靶熱點。此外，為了方便用戶查看脫靶編輯對基因功能的影響，BE-dot 能程序化地列舉所有可能的脫靶編輯產(chǎn)物并分析了脫靶產(chǎn)物所位于的基因組區(qū)域以及對基因功能的影響。使用BE-dot 的sgRNA 設(shè)計功能時，用戶需要提供SNV 的rsID 或包含SNV 在內(nèi)共計101 nt 的DNA 序列及SNV 所處的氨基酸密碼子閱讀框。提供BE-sgRNA編輯方案以及目標(biāo)編輯的基因組文件即可進行脫靶位點的預(yù)測。

與其他軟件相比，BE-dot 首次實現(xiàn)了設(shè)計SNV 修復(fù)方案、脫靶評估以及脫靶功能影響的完整過程。對編輯方案從靶標(biāo)編輯效率以及脫靶效應(yīng)等方面進行了全面的評估。旨在為生物醫(yī)學(xué)試驗引入或修復(fù)SNVs設(shè)計編輯方案并對方案提供全面的評估和參考。