畢榮宇,盧 君,唐 平,山其木格,王 麗,王 凡,李長(zhǎng)文
(1.貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司,貴州仁懷 564501;2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院,天津 300410)
中國(guó)白酒釀造歷史悠久,作為十二大香型白酒之一的醬香型白酒因其獨(dú)特的風(fēng)格越來(lái)越受到人們的喜愛(ài),已融入到日常生活的各個(gè)領(lǐng)域[1-2]。醬香型白酒起源貴州,是以當(dāng)?shù)嘏醇t高粱為原料,小麥制作的高溫大曲作為糖化發(fā)酵劑,經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌等釀造工藝而制成的[3]。相關(guān)研究表明,小麥皮中含有0.5%的阿魏酸,在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)生成4-甲基愈創(chuàng)木酚(4-Methylguaiacol,4-MG)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-Ethylguaiacol,4-EG)等酚類化合物。酚類化合物在醬香型白酒風(fēng)味和口感上起著非常重要的作用[4-5]。相關(guān)研究認(rèn)為,當(dāng)4-乙基苯酚(4-Ethylphenol,4-EP)和4-EG 的總量在酒中的濃度小于400 μg/L 時(shí),會(huì)使酒產(chǎn)生辛香、煙氣和革香韻的風(fēng)味,當(dāng)總質(zhì)量濃度大于620 μg/L時(shí),會(huì)使酒產(chǎn)生明顯的酚類特征,產(chǎn)生腥異味,掩蓋酒的香味[6-11]。因此對(duì)白酒中揮發(fā)性酚類化合物進(jìn)行定性定量檢測(cè),監(jiān)測(cè)其含量的變化,優(yōu)化生產(chǎn)工藝,避免產(chǎn)生異雜味,就顯得尤為重要。
目前,酒樣中酚類化合物的前處理方法主要有直接進(jìn)樣[12]、液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)[13-14]、固相微萃?。╯olid phase microextraction,SPME)[15]、固相萃?。╯olid phase extraction,SPE)[8,16]、攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction,SBSE)[17]等。檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(gas chromatography,GC)、氣相色譜質(zhì)譜法(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)、高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[18]等聯(lián)合上述前處理方法進(jìn)行酚類化合物的分析研究。
對(duì)比不同酚類化合物的前處理方法,每種方法都有各自優(yōu)點(diǎn)和不足[19]。本研究利用雙水相萃取的前處理方式,以白酒中的乙醇作為萃取劑,加入無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行分相,通過(guò)雙水相萃取法直接提取酚類化合物,結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定白酒中的酚類化合物。該方法操作條件溫和、提取工藝簡(jiǎn)單、易于連續(xù)操作、效率高、無(wú)毒無(wú)害、成本低[20-23],適用于白酒企業(yè)對(duì)酚類化合物的定量分析。
酒樣:酒樣(JT、LT、GT、DT、XT、MT、ZT 系列醬香型白酒),市售;由GT 酒廠提供的一至七輪次醬香型白酒基酒。
試劑及耗材:無(wú)水磷酸氫二鉀(分析純),乙醇(色譜級(jí)),愈創(chuàng)木酚(Guaiacol,Gua;純度98.0%),4-甲基愈創(chuàng)木酚(4-Methylguaiacol,4-MG;純度>98.0%),4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-Ethylguaiacol,4-EG;純度99.0%),4-甲基苯酚(4-Methylphenol,4-MP;純度≥99.7 %),4-乙基苯酚(4-Ethylphenol,4-EP;純度97.0%),苯酚(Phenol,Phe;純度≥99.5%),4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-Vinylguaiacol,4-VG;純度≥98.0%)均購(gòu)自上海阿拉丁(aladdin)公司。
儀器設(shè)備:TQ8030 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,配備AOC-20i 自動(dòng)進(jìn)樣器,日本島津公司;ME204T 電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-250E 超聲波發(fā)生器,昆山市超聲儀器有限公司;Vortex-Genie2 渦旋混合器,美國(guó)Scientific Industries 公司;Gen Pure xCAD Plus 純水機(jī),賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。
1.2.1 儀器檢測(cè)條件
色譜條件:色譜柱為Agilent DB-WAX 色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫為初始柱溫100 ℃,保持1 min,以6 ℃/min升溫至200 ℃,保持10 min,再以10 ℃/min升溫至230 ℃,保持10 min;載氣為高純氦氣(純度>99.999 %),流量控制方式為線速度;壓力145.2 kPa;總流量9.0 mL/min;流速1.0 mL/min;線速度26.3 cm/s;進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量1 μL。
質(zhì)譜條件:電離方式為電子電離源(elctron ionizotion,EI);電離能量70 eV;傳輸線溫度230 ℃;離子源溫度230 ℃;監(jiān)測(cè)方式為選擇離子掃描(single ion monitoring,SIM);四級(jí)桿溫度150 ℃;溶劑延遲10 min。
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
準(zhǔn)確稱取Gua,4-MG,4-EG,4-MP,4-EP,Phe,4-VG 各49.4 mg,48.4 mg,47.4 mg,49.9 mg,56.7 mg,52.8 mg,50.5 mg,用色譜級(jí)無(wú)水乙醇定容至25 mL。取7種多酚化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL至100 mL 容量瓶中,用色譜級(jí)無(wú)水乙醇定容,作為標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 中間液至10 mL 容量瓶中,再取0.2 mL 中間液至100 mL容量瓶中,定容,作為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)。
1.2.3 樣品前處理
酒樣混勻后放置磨口玻璃瓶?jī)?nèi)待用。準(zhǔn)確量取酒樣5.00 mL 于10 mL 具塞磨口離心管中,向離心管中加入無(wú)水磷酸氫二鉀固體,直至飽和為止,靜置分層。取上清液2.0 mL 于2 mL 離心管中,加入無(wú)水硫酸鎂200 mg,渦旋1 min混勻,10000 r/min離心10 min,取上清液,供GC-MS/MS分析。
取20 μg/mL的7種酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,按照最佳色譜條件進(jìn)行全掃描,得到7 種多酚化合物的總離子流色譜圖,見圖1;同時(shí)確定每種物質(zhì)的保留時(shí)間、定性離子和定量離子,選擇結(jié)果見表1。由圖1 可知,7 種酚類化合物均實(shí)現(xiàn)了良好的分離,為準(zhǔn)確定量分析奠定了基礎(chǔ)。由表1 可知,選定1 個(gè)定量離子,4 個(gè)定性離子,采用選擇離子掃描(SIM)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。
表1 7種酚類化合物保留時(shí)間、定性和定量離子
圖1 7種酚類化合物總離子流色譜圖
以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7 種酚類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限列于表2。由表2 可知,7 種酚類化合物在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.999。利用0.02 μg/mL 的濃度水平為依據(jù),3 倍信噪比計(jì)算檢出限,10 倍信噪比計(jì)算定量限。
表2 7種多酚化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限
由表2 可以得出,Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG 的檢出限分別為0.0030 μg/mL、0.0031 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0041 μg/mL、0.0011 μg/mL、0.0028 μg/mL,定量限分別為0.0101 μg/mL、0.0102 μg/mL、0.0075 μg/mL、0.0076 μg/mL、0.0137 μg/mL、0.0037 μg/mL、0.0093 μg/mL。本方法具有較低的檢出限與定量限,靈敏度能夠滿足醬香型白酒中酚類化合物的檢測(cè)需求。
準(zhǔn)確移取5 mL 的酒樣,分別按照低、中、高三個(gè)水平添加酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照樣品前處理方法進(jìn)行處理和測(cè)定不同酚類化合物的含量,每個(gè)濃度平行測(cè)定6 次,計(jì)算不同酚類化合物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。
由表3 可知,7 種酚類物質(zhì)的加標(biāo)回收率在90.74%~120.16%之間,精密度在1.17%~7.64%之間,回收率良好,精密度均小于10 %,滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的要求。
表3 酚類物質(zhì)加標(biāo)回收率及精密度
2.4.1 醬香型白酒檢測(cè)
相關(guān)研究表明,酚類物質(zhì)能為白酒提供獨(dú)特的焦醬味、奶香味、煙熏風(fēng)味和窖泥味,是白酒風(fēng)味組成不可缺少的一部分。但有些酚類化合物還會(huì)給酒體帶來(lái)異嗅味,如苯酚具有藥氣味、煙臭味,4-甲基苯酚具有窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、動(dòng)物臭,4-乙基苯酚呈動(dòng)物臭、馬廄臭[24],徐巖等[25]的研究證明4-甲基苯酚是濃香型白酒產(chǎn)生窖泥臭味的來(lái)源。4-乙基愈創(chuàng)木酚具有煙熏和丁香氣味,在濃度高時(shí)呈臭豆醬氣味,濃度低時(shí)似醬香空杯留香氣味[26-28];愈創(chuàng)木酚具有水果香、焦醬香,楊玉波等[29]的研究表明,茅臺(tái)酒中愈創(chuàng)木酚的質(zhì)量濃度與“糧香”強(qiáng)度具有正相關(guān)性,對(duì)“糧香”有著十分重要的作用。利用實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法,對(duì)不同品牌醬香型白酒中酚類化合物的含量進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定2次,計(jì)算平均值,檢測(cè)結(jié)果見表4。
由表4 可知,所選不同品牌系列醬香型白酒中酚類化合物的含量存在差異。除JT4、JT5 未檢出Gua,LT4 未檢出Gua、4-EG、4-VG 及LT5 未檢出4-EG、4-VG 外,其余醬香型白酒樣品均檢測(cè)出7 種酚類化合物。Gua 的濃度范圍是0.0000~0.2020 μg/mL,含量最高的是MT3;4-MG 的濃度范圍是0.0095~0.1006 μg/mL,含量最高的是JT2;Phe 的濃度范圍是0.0447~0.1906 μg/mL,含量最高的是ZT3;4-EG 的濃度范圍是0.0000~0.0742 μg/mL,含量最高的是MT3;4-MP 的濃度范圍是0.0084~0.2426 μg/mL,含量最高的是GT5;4-EP 的濃度范圍是0.0017~0.0541 μg/mL,含量最高的是MT2;4-VG 的濃度范圍是0.0000~0.2043 μg/mL,含量最高的是GT5;酚類化合物總量的濃度范圍是0.1375~0.9268 μg/mL,含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 總量的濃度范圍是0.0072~0.1275 μg/mL,含量最高的是MT3,研究表明4-EP 和4-EG 的濃度在小于400 μg/L 或大于620 μg/L 時(shí)會(huì)對(duì)酒體造成不同的影響,小于400 μg/L 時(shí),會(huì)使酒產(chǎn)生辛香、煙氣和革香韻的氣味,大于600 μg/L 時(shí),會(huì)產(chǎn)生腥味,通過(guò)檢測(cè)可知,所選醬香型白酒中4-EP 和4-EG 的總量均小于400 μg/L,不會(huì)對(duì)酒體造成影響。對(duì)比分析7 個(gè)品牌的5 款系列醬香型白酒酚類化合物總量的平均值發(fā)現(xiàn),GT 系列醬香型白酒中的含量最高,濃度為0.6354 μg/mL,其次是MT系列,濃度是0.5561 μg/mL,最低的是LT系列白酒,濃度是0.2175 μg/mL。
表4 醬香型白酒中酚類化合物 (μg/mL)
酚類化合物作為白酒中的健康活性物質(zhì),為健康飲酒奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。4-MG 和4-EG 可以抗氧化、有效的預(yù)防疾病、延緩衰老,促進(jìn)人體健康,4-EG還可降低血糖活性[30-31]。愈創(chuàng)木酚在臨床上可用于治療慢性氣管炎的多痰咳嗽。但是苯酚不僅是一種有害的物質(zhì),含量過(guò)高時(shí)還會(huì)造成酒體出現(xiàn)異味,所以在白酒的生產(chǎn)過(guò)程要控制苯酚的含量[32]。
2.4.2 不同輪次醬香型白酒基酒檢測(cè)
醬香型白酒復(fù)雜的“12987”釀造工藝過(guò)程,即一年生產(chǎn)周期、兩次投糧、九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次取酒,造就了其獨(dú)特的風(fēng)格品質(zhì)。由于不同季節(jié)環(huán)境、原料、大曲、微生物環(huán)境以及發(fā)酵過(guò)程酒醅性質(zhì)的不斷變化,導(dǎo)致七個(gè)輪次基酒具有明顯不同的風(fēng)格[33-34]。利用實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法,對(duì)GT 提供的七個(gè)輪次的醬香型白酒基酒中酚類化合物的含量進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定5 次,計(jì)算平均值,檢測(cè)結(jié)果見表5。
表5 不同輪次醬香型白酒基酒酚類化合物 (μg/mL)
由表5 可以看出,一輪次基酒中酚類化合物總量最高,為0.0373 μg/mL,發(fā)酵初期,原料中生成酚類物質(zhì)的前體物質(zhì)較多,導(dǎo)致一輪次基酒中酚類物質(zhì)含量最高;最低是三輪次,為0.2101 μg/mL。一輪次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物質(zhì)含量也顯著要高于其他輪次基酒。四輪、五輪、六輪次酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度較為接近。了解不同輪次基酒中酚類物質(zhì)的變化規(guī)律,有助于企業(yè)優(yōu)化調(diào)控工藝,控制酒中酚類化合物含量。
本研究采用雙水相萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法建立了一種簡(jiǎn)單,快速,高效分析醬香型白酒中酚類化合物的方法。該方法可以快速測(cè)定7種酚類化合物,且分離效果良好,線性范圍為0.0200~10.0000 μg/mL,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999,精密度在1.17 %~7.64 %,回收率為90.74 %~120.16 %,檢出限為0.0011~0.0041 μg/mL,定量限為0.0037~0.0137 μg/mL。利用該方法測(cè)定不同品牌醬香型白酒及GT提供的一至七輪次的醬香型白酒基酒中酚類化合物含量,結(jié)果表明,除JT4、JT5 未檢出Gua,LT4未檢出Gua、4-EG、4-VG及LT5未檢出4-EG、4-VG外,其余醬香型白酒樣品均檢測(cè)出7種酚類化合物。Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG含量最高的分別是MT3(0.2020 μg/mL)、JT2(0.1006 μg/mL)、ZT3(0.1906 μg/mL)、MT3(0.0742 μg/mL)、GT5(0.2426 μg/mL)、MT2(0.0541 μg/mL)、GT5(0.2043 μg/mL)。酚類化合物總量的濃度范圍是0.1375~0.9268 μg/mL,含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 總量的濃度范圍是0.0072~0.1275 μg/mL,含量最高的是MT3,研究表明4-EP 和4-EG 的濃度大于620 μg/L 時(shí)會(huì)對(duì)酒體造成不良的影響,通過(guò)檢測(cè)可知,所選醬香型白酒中4-EP 和4-EG 的總量均小于400 μg/L,不會(huì)對(duì)酒體造成影響。對(duì)比分析系列醬香型白酒酚類化合物總量的平均值發(fā)現(xiàn),GT 系列醬香型白酒中的含量最高,其次是MT 系列,最低的是LT 系列白酒。對(duì)輪次基酒的研究發(fā)現(xiàn),一輪次基酒中酚類化合物總量最高,為0.0373 μg/mL;最低是三輪次,為0.2101 μg/mL。一輪次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物質(zhì)的含量也顯著要高于其他輪次基酒。四輪、五輪、六輪次中酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度較為接近。通過(guò)對(duì)基酒及成品酒中酚類化合物的研究,可以為企業(yè)積累數(shù)據(jù),指導(dǎo)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝,穩(wěn)定酒中酚類化合物含量,對(duì)提升白酒品質(zhì)具有重要意義。