畢榮宇，盧 君，唐 平，山其木格，王 麗，王 凡，李長文

（1.貴州國臺酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，貴州仁懷 564501；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410）

中國白酒釀造歷史悠久，作為十二大香型白酒之一的醬香型白酒因其獨特的風(fēng)格越來越受到人們的喜愛，已融入到日常生活的各個領(lǐng)域[1-2]。醬香型白酒起源貴州，是以當(dāng)?shù)嘏醇t高粱為原料，小麥制作的高溫大曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌等釀造工藝而制成的[3]。相關(guān)研究表明，小麥皮中含有0.5%的阿魏酸，在發(fā)酵過程中會生成4-甲基愈創(chuàng)木酚（4-Methylguaiacol，4-MG）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG）等酚類化合物。酚類化合物在醬香型白酒風(fēng)味和口感上起著非常重要的作用[4-5]。相關(guān)研究認(rèn)為，當(dāng)4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP）和4-EG 的總量在酒中的濃度小于400 μg/L 時，會使酒產(chǎn)生辛香、煙氣和革香韻的風(fēng)味，當(dāng)總質(zhì)量濃度大于620 μg/L時，會使酒產(chǎn)生明顯的酚類特征，產(chǎn)生腥異味，掩蓋酒的香味[6-11]。因此對白酒中揮發(fā)性酚類化合物進(jìn)行定性定量檢測，監(jiān)測其含量的變化，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，避免產(chǎn)生異雜味，就顯得尤為重要。

目前，酒樣中酚類化合物的前處理方法主要有直接進(jìn)樣[12]、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[13-14]、固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）[15]、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）[8，16]、攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）[17]等。檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、氣相色譜質(zhì)譜法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[18]等聯(lián)合上述前處理方法進(jìn)行酚類化合物的分析研究。

對比不同酚類化合物的前處理方法，每種方法都有各自優(yōu)點和不足[19]。本研究利用雙水相萃取的前處理方式，以白酒中的乙醇作為萃取劑，加入無機(jī)鹽進(jìn)行分相，通過雙水相萃取法直接提取酚類化合物，結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定白酒中的酚類化合物。該方法操作條件溫和、提取工藝簡單、易于連續(xù)操作、效率高、無毒無害、成本低[20-23]，適用于白酒企業(yè)對酚類化合物的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：酒樣（JT、LT、GT、DT、XT、MT、ZT 系列醬香型白酒），市售；由GT 酒廠提供的一至七輪次醬香型白酒基酒。

試劑及耗材：無水磷酸氫二鉀（分析純），乙醇（色譜級），愈創(chuàng)木酚（Guaiacol，Gua；純度98.0%），4-甲基愈創(chuàng)木酚（4-Methylguaiacol，4-MG；純度＞98.0%），4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG；純度99.0%），4-甲基苯酚（4-Methylphenol，4-MP；純度≥99.7 %），4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP；純度97.0%），苯酚（Phenol，Phe；純度≥99.5%），4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-Vinylguaiacol，4-VG；純度≥98.0%）均購自上海阿拉?。╝laddin）公司。

儀器設(shè)備：TQ8030 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備AOC-20i 自動進(jìn)樣器，日本島津公司；ME204T 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-250E 超聲波發(fā)生器，昆山市超聲儀器有限公司；Vortex-Genie2 渦旋混合器，美國Scientific Industries 公司；Gen Pure xCAD Plus 純水機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器檢測條件

色譜條件：色譜柱為Agilent DB-WAX 色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫為初始柱溫100 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣(純度＞99.999 %)，流量控制方式為線速度；壓力145.2 kPa；總流量9.0 mL/min；流速1.0 mL/min；線速度26.3 cm/s；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離源(elctron ionizotion，EI)；電離能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度230 ℃；監(jiān)測方式為選擇離子掃描(single ion monitoring，SIM)；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲10 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取Gua，4-MG，4-EG，4-MP，4-EP，Phe，4-VG 各49.4 mg，48.4 mg，47.4 mg，49.9 mg，56.7 mg，52.8 mg，50.5 mg，用色譜級無水乙醇定容至25 mL。取7種多酚化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL至100 mL 容量瓶中，用色譜級無水乙醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 中間液至10 mL 容量瓶中，再取0.2 mL 中間液至100 mL容量瓶中，定容，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線點。

1.2.3 樣品前處理

酒樣混勻后放置磨口玻璃瓶內(nèi)待用。準(zhǔn)確量取酒樣5.00 mL 于10 mL 具塞磨口離心管中，向離心管中加入無水磷酸氫二鉀固體，直至飽和為止，靜置分層。取上清液2.0 mL 于2 mL 離心管中，加入無水硫酸鎂200 mg，渦旋1 min混勻，10000 r/min離心10 min，取上清液，供GC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜定性與定量

取20 μg/mL的7種酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按照最佳色譜條件進(jìn)行全掃描，得到7 種多酚化合物的總離子流色譜圖，見圖1；同時確定每種物質(zhì)的保留時間、定性離子和定量離子，選擇結(jié)果見表1。由圖1 可知，7 種酚類化合物均實現(xiàn)了良好的分離，為準(zhǔn)確定量分析奠定了基礎(chǔ)。由表1 可知，選定1 個定量離子，4 個定性離子，采用選擇離子掃描（SIM）模式進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。

表1 7種酚類化合物保留時間、定性和定量離子

圖1 7種酚類化合物總離子流色譜圖

2.2 方法的線性范圍，檢出限與定量限

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7 種酚類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限列于表2。由表2 可知，7 種酚類化合物在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.999。利用0.02 μg/mL 的濃度水平為依據(jù)，3 倍信噪比計算檢出限，10 倍信噪比計算定量限。

表2 7種多酚化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

由表2 可以得出，Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG 的檢出限分別為0.0030 μg/mL、0.0031 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0041 μg/mL、0.0011 μg/mL、0.0028 μg/mL，定量限分別為0.0101 μg/mL、0.0102 μg/mL、0.0075 μg/mL、0.0076 μg/mL、0.0137 μg/mL、0.0037 μg/mL、0.0093 μg/mL。本方法具有較低的檢出限與定量限，靈敏度能夠滿足醬香型白酒中酚類化合物的檢測需求。

2.3 回收率與精密度試驗

準(zhǔn)確移取5 mL 的酒樣，分別按照低、中、高三個水平添加酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品前處理方法進(jìn)行處理和測定不同酚類化合物的含量，每個濃度平行測定6 次，計算不同酚類化合物的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。

由表3 可知，7 種酚類物質(zhì)的加標(biāo)回收率在90.74%～120.16%之間，精密度在1.17%～7.64%之間，回收率良好，精密度均小于10 %，滿足實驗檢測的要求。

表3 酚類物質(zhì)加標(biāo)回收率及精密度

2.4 酒樣檢測

2.4.1 醬香型白酒檢測

相關(guān)研究表明，酚類物質(zhì)能為白酒提供獨特的焦醬味、奶香味、煙熏風(fēng)味和窖泥味，是白酒風(fēng)味組成不可缺少的一部分。但有些酚類化合物還會給酒體帶來異嗅味，如苯酚具有藥氣味、煙臭味，4-甲基苯酚具有窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、動物臭，4-乙基苯酚呈動物臭、馬廄臭[24]，徐巖等[25]的研究證明4-甲基苯酚是濃香型白酒產(chǎn)生窖泥臭味的來源。4-乙基愈創(chuàng)木酚具有煙熏和丁香氣味，在濃度高時呈臭豆醬氣味，濃度低時似醬香空杯留香氣味[26-28]；愈創(chuàng)木酚具有水果香、焦醬香，楊玉波等[29]的研究表明，茅臺酒中愈創(chuàng)木酚的質(zhì)量濃度與“糧香”強(qiáng)度具有正相關(guān)性，對“糧香”有著十分重要的作用。利用實驗所建立的分析方法，對不同品牌醬香型白酒中酚類化合物的含量進(jìn)行測定，每個樣品平行測定2次，計算平均值，檢測結(jié)果見表4。

由表4 可知，所選不同品牌系列醬香型白酒中酚類化合物的含量存在差異。除JT4、JT5 未檢出Gua，LT4 未檢出Gua、4-EG、4-VG 及LT5 未檢出4-EG、4-VG 外，其余醬香型白酒樣品均檢測出7 種酚類化合物。Gua 的濃度范圍是0.0000～0.2020 μg/mL，含量最高的是MT3；4-MG 的濃度范圍是0.0095～0.1006 μg/mL，含量最高的是JT2；Phe 的濃度范圍是0.0447～0.1906 μg/mL，含量最高的是ZT3；4-EG 的濃度范圍是0.0000～0.0742 μg/mL，含量最高的是MT3；4-MP 的濃度范圍是0.0084～0.2426 μg/mL，含量最高的是GT5；4-EP 的濃度范圍是0.0017～0.0541 μg/mL，含量最高的是MT2；4-VG 的濃度范圍是0.0000～0.2043 μg/mL，含量最高的是GT5；酚類化合物總量的濃度范圍是0.1375～0.9268 μg/mL，含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 總量的濃度范圍是0.0072～0.1275 μg/mL，含量最高的是MT3，研究表明4-EP 和4-EG 的濃度在小于400 μg/L 或大于620 μg/L 時會對酒體造成不同的影響，小于400 μg/L 時，會使酒產(chǎn)生辛香、煙氣和革香韻的氣味，大于600 μg/L 時，會產(chǎn)生腥味，通過檢測可知，所選醬香型白酒中4-EP 和4-EG 的總量均小于400 μg/L，不會對酒體造成影響。對比分析7 個品牌的5 款系列醬香型白酒酚類化合物總量的平均值發(fā)現(xiàn)，GT 系列醬香型白酒中的含量最高，濃度為0.6354 μg/mL，其次是MT系列，濃度是0.5561 μg/mL，最低的是LT系列白酒，濃度是0.2175 μg/mL。

表4 醬香型白酒中酚類化合物 (μg/mL)

酚類化合物作為白酒中的健康活性物質(zhì)，為健康飲酒奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。4-MG 和4-EG 可以抗氧化、有效的預(yù)防疾病、延緩衰老，促進(jìn)人體健康，4-EG還可降低血糖活性[30-31]。愈創(chuàng)木酚在臨床上可用于治療慢性氣管炎的多痰咳嗽。但是苯酚不僅是一種有害的物質(zhì)，含量過高時還會造成酒體出現(xiàn)異味，所以在白酒的生產(chǎn)過程要控制苯酚的含量[32]。

2.4.2 不同輪次醬香型白酒基酒檢測

醬香型白酒復(fù)雜的“12987”釀造工藝過程，即一年生產(chǎn)周期、兩次投糧、九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次取酒，造就了其獨特的風(fēng)格品質(zhì)。由于不同季節(jié)環(huán)境、原料、大曲、微生物環(huán)境以及發(fā)酵過程酒醅性質(zhì)的不斷變化，導(dǎo)致七個輪次基酒具有明顯不同的風(fēng)格[33-34]。利用實驗所建立的分析方法，對GT 提供的七個輪次的醬香型白酒基酒中酚類化合物的含量進(jìn)行測定，每個樣品平行測定5 次，計算平均值，檢測結(jié)果見表5。

表5 不同輪次醬香型白酒基酒酚類化合物 (μg/mL)

由表5 可以看出，一輪次基酒中酚類化合物總量最高，為0.0373 μg/mL，發(fā)酵初期，原料中生成酚類物質(zhì)的前體物質(zhì)較多，導(dǎo)致一輪次基酒中酚類物質(zhì)含量最高；最低是三輪次，為0.2101 μg/mL。一輪次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物質(zhì)含量也顯著要高于其他輪次基酒。四輪、五輪、六輪次酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度較為接近。了解不同輪次基酒中酚類物質(zhì)的變化規(guī)律，有助于企業(yè)優(yōu)化調(diào)控工藝，控制酒中酚類化合物含量。

3 結(jié)論

本研究采用雙水相萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法建立了一種簡單，快速，高效分析醬香型白酒中酚類化合物的方法。該方法可以快速測定7種酚類化合物，且分離效果良好，線性范圍為0.0200～10.0000 μg/mL，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，精密度在1.17 %～7.64 %，回收率為90.74 %～120.16 %，檢出限為0.0011～0.0041 μg/mL，定量限為0.0037～0.0137 μg/mL。利用該方法測定不同品牌醬香型白酒及GT提供的一至七輪次的醬香型白酒基酒中酚類化合物含量，結(jié)果表明，除JT4、JT5 未檢出Gua，LT4未檢出Gua、4-EG、4-VG及LT5未檢出4-EG、4-VG外，其余醬香型白酒樣品均檢測出7種酚類化合物。Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG含量最高的分別是MT3（0.2020 μg/mL）、JT2（0.1006 μg/mL）、ZT3（0.1906 μg/mL）、MT3（0.0742 μg/mL）、GT5（0.2426 μg/mL）、MT2（0.0541 μg/mL）、GT5（0.2043 μg/mL）。酚類化合物總量的濃度范圍是0.1375～0.9268 μg/mL，含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 總量的濃度范圍是0.0072～0.1275 μg/mL，含量最高的是MT3，研究表明4-EP 和4-EG 的濃度大于620 μg/L 時會對酒體造成不良的影響，通過檢測可知，所選醬香型白酒中4-EP 和4-EG 的總量均小于400 μg/L，不會對酒體造成影響。對比分析系列醬香型白酒酚類化合物總量的平均值發(fā)現(xiàn)，GT 系列醬香型白酒中的含量最高，其次是MT 系列，最低的是LT 系列白酒。對輪次基酒的研究發(fā)現(xiàn)，一輪次基酒中酚類化合物總量最高，為0.0373 μg/mL；最低是三輪次，為0.2101 μg/mL。一輪次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物質(zhì)的含量也顯著要高于其他輪次基酒。四輪、五輪、六輪次中酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度較為接近。通過對基酒及成品酒中酚類化合物的研究，可以為企業(yè)積累數(shù)據(jù)，指導(dǎo)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，穩(wěn)定酒中酚類化合物含量，對提升白酒品質(zhì)具有重要意義。