馬 靜，駱 敏，宋艷梅，譚蓮英，范光彩，周 歡，錢成林，夏忠悅，2＊

1 新希望乳業(yè)股份有限公司，四川成都 610023

2 乳品營養(yǎng)與功能四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610023

0 引言

因此，本文模擬生產(chǎn)中產(chǎn)品污染大腸桿菌的情況，向酸奶及乳飲料中接種大腸桿菌，監(jiān)控其在不同pH、儲(chǔ)藏溫度條件下，儲(chǔ)藏過程中菌含量變化及pH的變化情況，為實(shí)際生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)品冷藏及脫冷條件下大腸桿菌的檢驗(yàn)檢測和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供理論依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株為大腸埃希氏菌ATCC 25922。

1.1.2 試劑

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉，成都金山有限公司。

手從門上慢慢滑過，最終垂至地面，眼淚一滴滴落在手背上，很久了，沒有如此狼狽地哭過。每當(dāng)想要投奔想要的生活，腦海里就浮現(xiàn)出在病房外小聲抽泣的女人，浮現(xiàn)出她曾牽著他的手一起買菜，為他整理好凌亂的書包，為他甘于平庸。她的頭發(fā)白多了，小伊想，如果沒有自己，這個(gè)女人的日子該如何過？

1.1.3 儀器與設(shè)備

BSC1500IIA2-X生物安全柜，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；FE28-TRIS pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HVM1渦旋儀，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；JJ1000A電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

取保存于-80 ℃冰箱中磁珠管中的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，取1 粒磁珠轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化三代后備用。

1.2.2 樣品制備

（1）樣品中不同濃度大腸桿菌在不同儲(chǔ)藏溫度下含量的變化

選取酸奶（250 g/瓶），乳飲料（300 mL/瓶）各16 瓶，先將活化后菌液（1.2.1）用無菌生理鹽水梯度稀釋至103CFU/mL和105CFU/mL兩個(gè)梯度，再將稀釋后菌液接種至酸奶、乳飲料中使其菌含量約為10 CFU/mL和103CFU/mL。以上接種后樣品分別儲(chǔ)藏于4 ℃和25 ℃兩個(gè)溫度條件下，定期測定樣品中大腸桿菌含量變化。

（2）接種大腸桿菌驗(yàn)證在不同儲(chǔ)藏條件下含量變化

市售酸奶pH范圍一般為4.2~4.5[12]，乳飲料為3.0~4.0[13]，本試驗(yàn)酸奶的初始pH為4.2，乳飲料為3.6，因此，分別調(diào)節(jié)酸奶及乳飲料的pH為4.2和3.6兩個(gè)組，然后無菌操作向樣品中接種大腸桿菌至樣品中菌含量約為103CFU/mL，分別儲(chǔ)藏于4 ℃和25 ℃條件下，測定樣品中大腸桿菌含量變化及樣品pH的變化情況。根據(jù)不同的儲(chǔ)藏條件及pH分為以下四個(gè)組。

表1 樣品的pH及儲(chǔ)藏溫度

（3）不同pH營養(yǎng)肉湯對大腸桿菌含量的影響

在通常情況下營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基溶解后pH為7.5，本次試驗(yàn)調(diào)節(jié)初始營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH分別為3.2，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，取1 mL大腸桿菌菌液分別接種到100 mL的營養(yǎng)肉湯管中，置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期測定大腸桿菌含量。

1.2.3 大腸桿菌含量測定

本試驗(yàn)采用《GB 4789.3—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[14]中第二法測定樣品中大腸桿菌含量。

1.2.4 pH測定

采用校準(zhǔn)后的pH計(jì)測定儲(chǔ)藏過程中酸奶及乳飲料及營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶及乳飲料中不同濃度大腸桿菌儲(chǔ)藏后變化情況

通過向酸奶及乳飲料中接種低（10 CFU/mL，高（103CFU/mL）兩個(gè)梯度的大腸桿菌，模擬實(shí)際生產(chǎn)中產(chǎn)品低溫儲(chǔ)藏（4 ℃）及可能遇到的常溫脫冷（25 ℃）的情況，探究酸奶及乳飲料中大腸桿菌隨時(shí)間延長的含量變化情況。結(jié)果如表2所示，乳飲料在不同初始接菌量和不同儲(chǔ)藏溫度條件下，儲(chǔ)藏16 天后菌含量均降低至無法檢出。酸奶樣品儲(chǔ)藏在4 ℃仍還有大腸桿菌存活，且高梯度中剩余量高達(dá)268 CFU/mL，但在25 ℃條件下儲(chǔ)藏，無論是接種高梯度還是低梯度的大腸桿菌，樣品中大腸桿菌含量均降低至無法檢出（表2）。

表2 不同產(chǎn)品在不同儲(chǔ)藏溫度條件下大腸桿菌含量及pH的變化情況

造成以上差異的原因可能是由于溫度適宜，乳酸菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，或者乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致樣品pH降低[15~19]。從表中結(jié)果表明，大腸桿菌降低至無法檢出的樣品均為低pH的樣品。因此，低pH可能對大腸桿菌的活性造成較大的影響。

2.2 不同pH對酸奶中大腸桿菌的影響

基于2.1的結(jié)果，即酸奶和乳飲料在儲(chǔ)藏過程中大腸桿菌的存活情況不同的現(xiàn)象，進(jìn)一步對其原因進(jìn)行探究。經(jīng)測定，酸奶初始pH為4.2。由圖1a中可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，pH4.2的酸奶樣品在25 ℃條件下儲(chǔ)藏pH不斷降低，而在4 ℃條件下儲(chǔ)藏pH基本保持不變。pH為3.6酸奶樣品不管是在4 ℃和25 ℃儲(chǔ)藏pH基本保持不變。

圖1 酸奶在儲(chǔ)藏過程中的大腸桿菌菌含量（a）及pH（b）的變化情況

圖1b顯示出，儲(chǔ)藏過程中，A條件下的酸奶中大腸桿菌整體呈現(xiàn)相對緩慢降低趨勢，B，C，D條件下含量呈現(xiàn)減少趨勢，降低速率較快。低pH酸奶（B，D）樣品中菌均在儲(chǔ)藏4天后降低至無法檢出，C條件下儲(chǔ)藏6 天后降低至無法檢出。相同儲(chǔ)藏溫度條件下，pH低的酸奶中大腸桿菌含量減少的更快，表明pH對大腸桿菌的活性造成了較大的影響。當(dāng)酸奶pH為4.2時(shí)，冷藏（4 ℃）條件下，大腸桿菌及乳酸菌活性均受到抑制，乳酸菌在儲(chǔ)藏過程中未進(jìn)行明顯的發(fā)酵產(chǎn)酸，酸奶在整個(gè)儲(chǔ)藏過程中pH基本不變，因此大腸桿菌降低速率緩慢，儲(chǔ)藏15天后仍有菌檢出，為57 CFU/g，超出發(fā)酵乳三級(jí)采樣最高安全限量值5 CFU/g，而在25 ℃儲(chǔ)藏的酸奶中乳酸菌在相對適宜條件下，繁殖發(fā)酵產(chǎn)酸[20，21]，導(dǎo)致儲(chǔ)藏過程中酸奶pH明顯降低至3.8，這可能對大腸桿菌產(chǎn)生了較大的影響，其降低速率明顯高于低溫儲(chǔ)藏的酸奶樣品，但在這其中乳酸菌也可能造成了一定的影響[17]。當(dāng)酸奶pH為3.6時(shí)，不同儲(chǔ)藏溫度間降低速率相差不大，由此可見，pH對酸奶中大腸桿菌的影響更為明顯。

2.3 不同pH對乳飲料中大腸桿菌的影響

乳飲料初始pH為3.6，A條件下儲(chǔ)藏的乳飲料pH基本不變，而25 ℃儲(chǔ)藏過程中pH降低，可降到3.4。與酸奶不同的是在pH 3.6的低pH下，25 ℃儲(chǔ)藏乳飲料的pH持續(xù)降低，這可能是由于酸奶與乳飲料中乳酸菌菌種不同造成的。乳飲料中為更耐酸性的菌種，乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致pH持續(xù)降低。（圖2b）與酸奶相同，A條件下的乳飲料中大腸桿菌含量先略有增加后降低，可能是由于大腸桿菌對低溫具有一定的抗性[22]，隨時(shí)間延長，不利于其生長，菌含量明顯降低，其他條件下乳飲料中的大腸桿菌含量隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長而減少，B、C、D條件下的乳飲料分別在儲(chǔ)藏10，6，4 天后，大腸桿菌的量降低至無法檢出，且樣品pH分別為3.6，3.7，3.5，而A條件下的乳飲料直至儲(chǔ)藏15 天后仍有菌存活，為28 CFU/mL。圖2a中可以看出，儲(chǔ)藏溫度越高，pH低的乳飲料中菌含量降低的越快。儲(chǔ)藏溫度及pH均對大腸桿菌的活性造成了一定的影響[23]。

2.4 pH對大腸桿菌生長的影響驗(yàn)證

大腸桿菌對酸性具有一定的抗性[24]，但相對更低的pH也會(huì)對大腸桿菌的活性造成影響。有文獻(xiàn)報(bào)道大腸桿菌最低培養(yǎng)溫度為7 ℃左右，適合生長的最低pH為4左右[25，26]。表中為pH不同的培養(yǎng)基中大腸桿菌在培養(yǎng)過程中的變化情況。

當(dāng)pH＞3.8時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長大腸桿菌生長繁殖，菌含量增加，而當(dāng)pH≤3.8時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長大腸桿菌活性受到抑制，菌含量逐漸降低，由此可見較低的pH對大腸桿菌造成了一定的影響。乳飲料的pH相對酸奶更低，因此，對大腸桿菌活性造成了抑制，加速了大腸桿菌的失活，低溫條件下，正常乳飲料（pH 3.6）在儲(chǔ)藏6 天后菌含量降低為2 CFU/mL，隨時(shí)間延長，第10天降低至無法檢出，而酸奶（pH 4.2）在儲(chǔ)藏15 天仍有菌檢出（圖1a，圖2a）。

圖2 乳飲料在儲(chǔ)藏過程中的菌含量（a）及pH（b）的變化情況

3 結(jié)果與討論

表3 pH不同培養(yǎng)基中大腸桿菌隨培養(yǎng)時(shí)間延長的變化情況

產(chǎn)品中大腸菌群污染控制對于消費(fèi)者的食品安全來說至關(guān)重要，因此了解大腸桿菌污染產(chǎn)品后隨著儲(chǔ)藏時(shí)間及條件改變的變化規(guī)律具有重大意義。為了保障酸奶及乳飲料的品質(zhì)，一般低溫冷藏（4 ℃）保存[27]，但當(dāng)在出廠運(yùn)輸?shù)冗^程中可能會(huì)出現(xiàn)脫冷的情況，因此研究保質(zhì)期內(nèi)產(chǎn)品中感染大腸桿菌后的變化情況具有重要意義。低pH明顯加速大腸桿菌的衰亡，儲(chǔ)藏溫度及pH均對產(chǎn)品造成了一定的影響，但儲(chǔ)藏溫度對產(chǎn)品中大腸桿菌的影響可能是由于溫度升高產(chǎn)品中乳酸菌發(fā)酵，pH降低導(dǎo)致的。當(dāng)產(chǎn)品在運(yùn)輸、銷售等過程中發(fā)生脫冷時(shí)，通常認(rèn)為大腸桿菌可能繁殖，發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣導(dǎo)致產(chǎn)品脹包，然而本試驗(yàn)過程中，產(chǎn)品中大腸桿菌并未增加，25 ℃儲(chǔ)藏的酸奶及乳飲料在整個(gè)儲(chǔ)藏期間均未發(fā)生脹包現(xiàn)象，相反pH降低加速大腸桿菌的滅亡。大腸桿菌在不同pH培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)，再次證明了pH對大腸桿菌的影響。這對于生產(chǎn)中實(shí)際檢驗(yàn)檢測具有一定的指導(dǎo)意義。大腸菌群作為生產(chǎn)過程衛(wèi)生指示菌，對其的控制非常重要。由于pH對大腸菌群的影響，檢測成品可能并不能代表真實(shí)情況，需要及時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)檢測。因此，為了更好控制食品安全，對于酸奶類產(chǎn)品建議在發(fā)酵前或者成品灌裝后及時(shí)檢測。C