劉大宇 ， 徐際超 ， 曾瀅，3 ， 徐曲毅 ， 劉宏 ， 李越 ， 劉長暉

1.廣州市公安局黃埔區(qū)分局，廣州 510700；

2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣州 510442；

3.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣州 510515

法庭DNA數(shù)據(jù)庫的建立，一方面從技術(shù)上克服了偵查破案中地區(qū)和個(gè)案的局限性，另一方面可從根本上解決刑事案件中無名尸體的身份確定和被拐兒童的身份認(rèn)定等調(diào)查難題，能及時(shí)有效地打擊刑事犯罪［1］。Y-STR數(shù)據(jù)庫作為DNA數(shù)據(jù)庫的一部分，其輔助鑒定價(jià)值已在大量案件中得以體現(xiàn)，是常染色體數(shù)據(jù)庫的重要補(bǔ)充［2-5］。中國社會(huì)由于傳統(tǒng)的父姓制度，使得Y-STR數(shù)據(jù)庫的建設(shè)具有重大意義。

隨著Y-STR DNA數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)大，無關(guān)男性個(gè)體的隨機(jī)匹配概率也在增加，為了提高YSTR的個(gè)體識(shí)別效能，盡可能降低匹配數(shù)據(jù)量，在檢驗(yàn)基因座數(shù)量有限的情況下，通常的做法是引入高多態(tài)性的快速突變Y-STR［6-7］。但突變率高的基因座容易導(dǎo)致同一父系的男性個(gè)體在匹配時(shí)因基因突變而被錯(cuò)誤排除，不利于使用Y-STR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行父系家系排查?；诖?，本研究以374個(gè)廣東漢族無血緣關(guān)系男性個(gè)體為樣本，通過AGCU Y SUPP PLUS（簡稱YSP）熒光檢測試劑盒和AGCU Y37（簡稱Y37）熒光檢測試劑盒檢測共59個(gè)Y-STR基因座的不同組合，評(píng)估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效能并探討Y-STR基因座的合理組合。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

采集374名廣東地區(qū)漢族無血緣關(guān)系男性個(gè)體的口腔拭子，所有樣本提供者均對(duì)本研究知情并自愿簽訂知情同意書。

AGCU Y SUPP PLUS試劑盒與AGCU Y37試劑盒均購自無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司；Hi-DiTM甲酰胺、9700型PCR儀和ABI3130XL型基因分析儀均購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

Y-STR基因座的優(yōu)勢在于父系遺傳，除非突變，同一父系的男性個(gè)體Y-STR基因座分型一致，因此常用于父系親權(quán)鑒定、現(xiàn)場混合檢材檢驗(yàn)以及父系家族排查。本研究應(yīng)用AGCU Y SUPP PLUS和AGCU Y37兩種試劑盒，包含DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)中涉及的59個(gè)Y-STR基因座，其中49個(gè)為單拷貝基因座，5個(gè)為雙拷貝基因座（DYF404S1 a/b、DYS459 a/b、DYS385 a/b、DYS527 a/b、DYF387S1 a/b），對(duì)374例廣東漢族無血緣關(guān)系男性個(gè)體進(jìn)行基因分型檢測，獲取其遺傳信息并將這59個(gè)Y-STR基因座按照突變率的高低進(jìn)行分類組合和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.1DNA提取、PCR擴(kuò)增和分型 用高盛TraceMag微量DNA磁珠純化試劑盒及x-pure 96微量DNA自動(dòng)提取/檢測工作站提取DNA，-4 ℃保存待用。分別按照YSP和Y37試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI 3130XL遺傳分析儀電泳，使用GeneMapper IDX v1.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 用PowerStatsV12.xls計(jì)算各基因座的基因頻率；用Arlequin v3.5統(tǒng)計(jì)單倍型頻率；基因多樣性（gene diversity，GD）及單倍型多樣性（haplotype diversity， HD）按公式（1）計(jì)算。系統(tǒng)識(shí)別能力（discrimination capacity，DC）按公式（2）計(jì)算。

其中，n表示樣本數(shù)，Pi表示第i個(gè)（等位）基因的基因頻率或單倍型頻率。

其中，Nh為單倍型數(shù)目，Ns為樣本總量。

2 結(jié)果與分析

2.1 59個(gè)Y-STR多態(tài)性分析

電泳分型結(jié)果顯示，各樣本均得到有效擴(kuò)增，有2例樣本在DYS448基因座出現(xiàn)等位基因丟失，DYS460、DYS19、DYS587、DYS630、DYS449、DYS522以及DYS622等7個(gè)單拷貝基因座共檢出8例 二 基 因 分 型，DYS404S1a/b、DYS387S1、DYS527a/b和DYS385a/b等4個(gè)雙拷貝基因座共檢出35例三基因分型，DYS385a/b雙拷貝基因座檢出2例五基因分型。上述異常分型的基因座均經(jīng)公安部研發(fā)的DNATyper Y29試劑盒復(fù)核，結(jié)果分型一致，這些異常分型樣本在基因頻率和基因型頻率計(jì)算中未納入統(tǒng)計(jì)，在單倍型分析時(shí)納入統(tǒng)計(jì)。

374例個(gè)體經(jīng)YSP和Y37試劑盒檢測所獲得的59個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率見表1。59個(gè)Y-STR基因座在廣東漢族群體的GD值如圖1所示，最低值為0.055 1（DYS645），最高值為0.958 0（DYS387S1a/b）。除 了DYS645（GD=0.055 1）、DYS617（GD=0.374 3）、DYS391（GD=0.382 1）、DYS438（GD=0.434 4）、DYS388（GD=0.4600）、DYS437（GD=0.487 8）、DYS596（GD=0.498 6）等7個(gè)基因座外，其余52個(gè)基因座GD值均大于0.5，表明這些基因座多態(tài)性較好，適用于廣東漢族人群的法醫(yī)學(xué)研究與分析。

圖1 59個(gè)Y-STR的GD值分布Fig. 1 Distribution of GD values of 59 Y-STR loci

表1 374例廣東漢族男性個(gè)體經(jīng)YSP試劑盒和Y37試劑盒檢測獲得的等位基因/單倍型頻率Table 1 Gene/haplotype frequencies of 374 Guangdong Han-ethnic male individuals tested with YSP and Y37 Kits

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.2 59個(gè)Y-STR的組合分析

根據(jù)突變率的不同［8-14］，這59個(gè)Y-STR基因座可以分為：中低突變Y-STR（突變率小于0.004）共44個(gè)，高快突變Y-STR（突變率大于0.004）共15個(gè)。將檢測所得的遺傳數(shù)據(jù)按YSP試劑盒所含的32個(gè)Y-STR基因座（YSP）、Y37試劑盒所含的37個(gè)Y-STR基因座（Y37）、兩種試劑盒總共包含的59個(gè)Y-STR基因座（Y59）、44個(gè)中低突變YSTR基因座（Y-L 44）和15個(gè)高快突變Y-STR基因座（Y-H 15）共5種組合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類，計(jì)算檢出的單倍型數(shù)量、HD值和DC值，結(jié)果如表2所示。Y59組合的單倍型數(shù)量為374，HD值和DC值分別為1.000 000和1.000 000，多態(tài)性效能最高，而突變率小于0.004的Y-L 44組合的HD值和DC值分別為0.999 986和0.997 326；突變率大于0.004的Y-H 15組合的HD值和DC值分別為0.999 971和0.994 652。15個(gè)高快突變Y-STR基因座組合僅比44個(gè)中低突變Y-STR基因座組合少一個(gè)單倍型，而HD差值小于0.000 02，表明這兩種Y-STR基因座組合多態(tài)性效能相當(dāng)。

表2 5種基因座組合分析374例無關(guān)廣東漢族男性個(gè)體的系統(tǒng)效能比較Table 2 Comparison of systematic efficiency of 5 combinatorial loci to analyze 374 unrelated Guangdong Han-ethnic male individuals

3 討論

Y-STR數(shù)據(jù)庫的建立主要用于篩查同一父系個(gè)體，縮小排查范圍，為偵查提供線索，提高辦案效率。目前，全國各地的Y-STR數(shù)據(jù)庫規(guī)模不斷擴(kuò)大，檢驗(yàn)的Y-STR基因座也日益增多［15-17］，Y-STR單倍型入庫比對(duì)后容易出現(xiàn)篩出信息過多、難以甄別真?zhèn)蔚那闆r。為了提高試劑盒的檢驗(yàn)效能，常用的商品化Y-STR檢測試劑盒引入了一定數(shù)量的快速突變Y-STR基因座［6-7］，例如，本研究所用的Y37試劑盒含有DYS576和DYS449 2個(gè)快速突變Y-STR基因座，YSP試劑盒含有DYS713、DYS630和DYF404S1 3個(gè)快速突變Y-STR基因座。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，突變率μ＜0.002為低突變，0.002＜μ＜0.004為中突變，0.004＜μ＜0.01為高突變Y-STR，而μ＞0.01則為快速突變Y-STR［18］。本研究將2個(gè)Y-STR檢測體系的59個(gè)Y-STR中突變率μ＜0.004的44個(gè)中低突變Y-STR基因座組合分析，顯示其HD值和DC值分別為0.999 986和0.997 326；突變率μ＞0.004的15個(gè)高快突變Y-STR基因座組合的HD值和DC值分別為0.999 971和0.994 652，15個(gè)高快突變Y-STR基因座組合僅比44個(gè)中低突變Y-STR基因座組合少一個(gè)單倍型，而HD差值小于0.000 02，表明這兩種Y-STR基因座組合多態(tài)性效能相當(dāng)。

將少數(shù)快速突變Y-STR引入到某一個(gè)Y-STR檢測系統(tǒng)可顯著提高其系統(tǒng)多態(tài)性效能，在混合檢材個(gè)體識(shí)別中有重要的應(yīng)用價(jià)值，但高突變率基因座的引入也容易導(dǎo)致同一父系的男性個(gè)體因基因突變而被錯(cuò)誤排除。當(dāng)出現(xiàn)1～2個(gè)甚至更多Y-STR基因座分型不一致時(shí)，特別是不一致的基因座其等位基因相差1～2個(gè)重復(fù)單位時(shí)，無法輕易判斷是否為基因突變所致，因而不能輕易排除父系家族，不利于使用Y-STR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行父系家系排查。因此，基于Y-STR數(shù)據(jù)庫的實(shí)際應(yīng)用需求，不應(yīng)把快速突變Y-STR基因座隨意加入到某一常規(guī)Y-STR檢測體系中，而需從整體上考慮如何選擇和組合這些基因座。

國內(nèi)外已有構(gòu)建中低突變Y-STR檢測體系以及快速突變檢測體系的相關(guān)研究，但尚未見高突變和快速突變聯(lián)合檢測體系的報(bào)道。目前六色熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)成熟，一次可檢測30～50個(gè)遺傳標(biāo)記。若能將快速和高突變Y-STR進(jìn)行組合而建立檢測體系，有望大大提高個(gè)體識(shí)別效能，有利于混合檢材中男性供體的溯源；而將中低突變的Y-STR進(jìn)行組合，則可更好地滿足Y數(shù)據(jù)庫建設(shè)和父系家系排查的需求。