張?jiān)旅?， 羅雅琴 ， 鄭偉 ， 徐杰 ， 董雪燕 ， 李善琛 ， 王敬毅

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250000；

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250000

急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）是骨髓造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其特征為髓系祖細(xì)胞快速大量增殖并逐漸取代骨髓正常造血細(xì)胞。其臨床主要表現(xiàn)為貧血、出血、發(fā)熱和感染，該病多具有病情急重、難以控制、容易復(fù)發(fā)、預(yù)后兇險(xiǎn)等臨床特點(diǎn)，對人類的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅。已有研究認(rèn)為，染色體數(shù)量或者結(jié)構(gòu)異常、基因突變或表達(dá)水平的異常導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、分化受阻以及凋亡受抑制是AML發(fā)病的主要機(jī)制。而這些過程中，細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期調(diào)控異常是白血病發(fā)生過程中的關(guān)鍵事件。當(dāng)前AML的治療手段包括化療、造血干細(xì)胞移植和生物治療，這些治療手段使AML的治愈率能夠達(dá)到50%［1］，但是AML發(fā)展迅速，發(fā)病原因及機(jī)制較為復(fù)雜，其高度異質(zhì)性導(dǎo)致AML化療后易復(fù)發(fā)［2］。因此，深入研究AML的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探究新的分子標(biāo)志物對于提高藥物的治療效果以及改善AML患者的預(yù)后具有重要意義。有研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）對微小RNA（microRNA，miRNA）具有海綿吸附作用，可以作為內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）與miRNA競爭性結(jié)合，從而影響miRNA與mRNA的結(jié)合，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［3］。但是，許多l(xiāng)ncRNAs在AML發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用及臨床意義還有待進(jìn)一步研究。為此，本研究通過生物信息學(xué)的方法分析AML相關(guān)的差異表達(dá)基因，并構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA的競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能及AML發(fā)病的潛在機(jī)制，旨在為發(fā)現(xiàn)AML發(fā)病新的潛在機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是一個國際公共數(shù)據(jù)庫，收錄了來自世界各國研究機(jī)構(gòu)提交的高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)［4］。在GEO數(shù)據(jù)庫中分別檢索AML相關(guān)的mRNA、miRNA、lncRNA芯片，獲得編號為GSE142698、GSE142699、GSE96535的芯片原始數(shù)據(jù)。GSE142698芯片數(shù)據(jù)48例樣本中包含AML患者24例，正常對照組24例；GSE142699芯片數(shù)據(jù)48例樣本中包含AML患者24例，正常對照組24例；GSE96535芯片數(shù)據(jù)18例樣本中包含AML患者6例，急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia， ALL）患者6例，正常對照組6例。

1.2 方法

1.2.1差異表達(dá)基因的篩選 應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫中GEO2R功能分析上述數(shù)據(jù)的差異基因（differential genes，DEGs），利用Excel表格篩選出|log2foldchange（log2FC）|＞1且P＜0.05的差異RNA，然后使用VLOOKUP函數(shù)將各個探針名轉(zhuǎn)化為基因名，應(yīng)用SangerBox繪制火山圖對RNA的分布情況進(jìn)行直觀展示，將差異表達(dá)倍數(shù)絕對值前30的RNA繪制熱圖進(jìn)行展示。

1.2.2基因功能注釋 在線生物信息學(xué)分析工具DAVID［5］（https：//david.ncifcrf.gov/）收集了大量的基因生物功能和信號傳導(dǎo)通路研究信息，能夠富集分析大規(guī)模的基因，并注釋其生物學(xué)功能和信號通路途徑。為進(jìn)一步研究AML的發(fā)病機(jī)制，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)利用DAVID對初步篩選的差異mRNA進(jìn)行基因本體（GO）分析，以評估生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular constituent，CC）和分子功能（molecule function，MF）注釋的富集程度，京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析用于注釋與這些差異mRNA相關(guān)的信號通路，利用Sanger軟件繪制氣泡圖進(jìn)行富集結(jié)果的直觀展示。

1.2.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將所得29個DEGs導(dǎo)入STRING在線軟件中，得出PPI關(guān)系，并以TSV格式導(dǎo)出，再將得到的源文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，以相關(guān)參數(shù)自由度（degree centrality，DC），介數(shù)（betweenness centrality，BC）為條件進(jìn)行關(guān)鍵基因（Hub基因）的篩選。

1.2.4預(yù)測與差異表達(dá)miRNAs相關(guān)聯(lián)的mRNAs和lncRNAs 在miRWalk數(shù)據(jù)庫中預(yù)測與差異表達(dá)miRNAs相關(guān)聯(lián)的mRNAs。利用Spongescan數(shù)據(jù)庫預(yù)測與AML相關(guān)miRNAs調(diào)控的lncRNAs。

1.2.5ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了進(jìn)一步提高生物信息分析的可靠性，我們將預(yù)測得到的mRNAs和lncRNAs與用GEO2R分析得到的差異RNA取交集，并將重疊的RNA作為進(jìn)一步分析的差異表達(dá)mRNAs（DEmRNAs）和差異表達(dá)lncRNAs（DElncRNAs）。隨后建立了匹配的DElncRNADEmiRNA對和DEmiRNA-DEmRNA對。根據(jù)ceRNA理論構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，對于給定的共表達(dá)lncRNA-mRNA對，篩選其中與某一共同miRNA負(fù)性共表達(dá)的lncRNA-mRNA對，確定該lncRNA-miRNA-mRNA為共表達(dá)競爭的三聯(lián)體。將上述所有共表達(dá)競爭的三聯(lián)體構(gòu)建成lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。本研究的分析流程如圖1所示。

圖1 本研究流程圖Fig. 1 Flow chart of this study

2 結(jié)果與分析

2.1 AML相關(guān)的差異表達(dá)mRNAs、miRNAs及l(fā)ncRNAs

利用GEO2R（∣log2FC∣＞1，P＜0.05）分析差異表達(dá)的mRNAs、miRNAs及l(fā)ncRNAs，在公共數(shù)據(jù)集GSE142698中共篩選得到29個顯著差異的mRNAs，其中18個基因表達(dá)上調(diào)、11個基因表達(dá)下調(diào)；在公共數(shù)據(jù)集GSE142699中篩選得到70個差異顯著的miRNAs，與健康對照組相比，AML樣本中有31個miRNA過表達(dá)、39個miRNA表達(dá)下調(diào)；在公共數(shù)據(jù)集GSE96535中得到20 005個差異顯著的lncRNAs，包括10 248個上調(diào)lncRNA和9 757個下調(diào)lncRNA。所有mRNAs、miRNAs及l(fā)ncRNAs分布情況的火山圖如圖2所示，差異表達(dá)倍數(shù)絕對值前30的RNA熱圖如圖3所示。

圖2 mRNAs、miRNAs及l(fā)ncRNAs分布情況的火山圖Fig. 2 Volcano map of distribution of mRNAs, miRNA and lncRNAs

圖3 差異表達(dá)倍數(shù)絕對值前30的RNA熱圖Fig. 3 Heat map of Top30 absolute value differential expression multiple

2.2 基因功能注釋

DEmRNA被分為3個功能組，在生物過程組中，DEmRNA主要富集于細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、蛋白磷酸化、細(xì)胞分裂、周期蛋白依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)；在細(xì)胞組分組中，DEmRNA主要富集于細(xì)胞核、核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中；在分子功能組中，DEmRNA主要富集于蛋白結(jié)合功能、ATP結(jié)合功能和激酶活性功能。KEGG分析顯示其潛在的生物學(xué)功能，共獲得了23條顯著富集的通路。功能注釋用SangerBox繪制氣泡圖進(jìn)行結(jié)果可視化處理如圖4所示，DEmRNAs顯著富集于細(xì)胞衰老、PI3K-Akt信號通路、癌癥通路、T細(xì)胞受體信號通路等。

圖4 DEmRNA基因功能注釋氣泡圖Fig. 4 Bubble diagram of DEmRNA gene function annotation

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析

利用String在線工具對差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape檢測PPI中DEGs之間的潛在相關(guān)性（圖5），其中藍(lán)色為下調(diào)基因，紅色為上調(diào)基因；以相關(guān)參數(shù)自由度（DC）、介數(shù)（BC）為條件篩選出5個核心基因（圖6），分別為MYB、GATA2、CDK4、PKMYT1、CCNB1，均為上調(diào)基因。

圖5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 PPI net work

圖6 PPI互作網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心基因Fig. 6 Hub gene screened from PPI net work

2.4 與差異表達(dá)miRNAs相關(guān)聯(lián)的mRNAs和lncRNAs

miRWalk是一個綜合型的miRNA靶基因數(shù)據(jù)。利用miRWalk數(shù)據(jù)庫預(yù)測與差異表達(dá)miRNAs相關(guān)聯(lián)的mRNAs，得到15 804個預(yù)測的mRNAs，與用GEO2R分析的差異mRNAs取交集，最后得到25個mRNAs。利用Spongescan數(shù)據(jù)庫預(yù)測與AML相關(guān)miRNAs調(diào)控的lncRNAs共71個，與通過基因芯片分析得出的差異lncRNAs取交集得到6個lncRNAs。使用Cytoscape（v3.7.1）構(gòu)建了包含25個mRNA、21個miRNA和6個lncRNA的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，如圖7所示。

圖7 競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 7 Competitive endogenous RNA networks

3 討論

急性髓系白血病是一種由髓系造血祖細(xì)胞異常增殖和分化引起的高度異質(zhì)性的惡性克隆性疾病。治療AML的方法主要有化療、靶向治療和造血干細(xì)胞移植等。目前大部分AML患者尤其是青年患者的首選治療方法仍然是化療，對于中高?；颊邅碚f，不進(jìn)行移植的治療復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～70%，而且化療會帶來嚴(yán)重的毒副作用［6］。

在當(dāng)前的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中，數(shù)據(jù)分析技術(shù)在生物學(xué)信號通路的研究、代謝機(jī)制和人類疾病的診斷、治療、預(yù)后判斷中發(fā)揮著重要的作用［7］。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)理論指出，各種RNA共享共同的miRNA 應(yīng)答元件（microRNA response element，MRE），這使它們能夠競爭性地結(jié)合miRNA實(shí)現(xiàn)相互調(diào)控。ceRNA網(wǎng)絡(luò)已被證明在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中普遍存在，其在多種疾病特別是腫瘤中的作用已引起廣泛關(guān)注。為了更好地了解AML的異常基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本研究分析了多個數(shù)據(jù)庫，獲得了AML中異常表達(dá)的內(nèi)源性RNA，建立了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

本研究篩選出MYB、GATA2、CDK4、PKMYT1、CCNB1 5個核心基因，差異基因顯著富集于細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、蛋白磷酸化、細(xì)胞分裂、周期蛋白依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)功能，在細(xì)胞組分組中，差異基因主要富集于細(xì)胞核、核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中。在分子功能組中，差異基因主要富集于蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合和激酶活性。KEGG分析顯示，差異基因顯著富集于細(xì)胞衰老、PI3K-Akt信號通路、癌癥通路、T細(xì)胞受體信號通路等。本研究構(gòu)建了包含25個mRNA、21個miRNA和6個lncRNA的CeRNA網(wǎng)絡(luò)。

MYB是一種廣泛存在于真核生物、進(jìn)化上高度保守的原癌基因。有臨床研究表明，MYB可以作為一種轉(zhuǎn)錄因子，直接調(diào)控多種與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，從而影響癌細(xì)胞的侵襲、增殖過程，并參與AML的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程［8］。GATA2編碼一種造血轉(zhuǎn)錄因子，且在多種造血細(xì)胞的發(fā)育中起重要作用，是AML的易感基因［9］。程凱等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在K562細(xì)胞中敲降GATA2后，MYB表達(dá)同時(shí)下降，證明了GATA2對MYB有調(diào)控作用并且在血細(xì)胞中起重要作用。CCNB1即G2/有絲分裂特異性細(xì)胞周期蛋白B1，主要在G2/M期表達(dá)，是有絲分裂中的一種監(jiān)測蛋白，對于控制G2/M（有絲分裂）過渡的細(xì)胞周期至關(guān)重要［11］。有研究證實(shí)，CCNB1在許多預(yù)后較差的癌癥如卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌以及非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)［12-14］。PKMYT1是Wee家族的一種蛋白激酶，其通過磷酸化Tyr14/Tyr15和磷酸化CDK1-cyclinB復(fù)合物而失活CDK1-cyclinB復(fù)合物，是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子。先前的研究表明，上調(diào)的PKMYT1在肝癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［15-18］。

通過CeRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，我們推測lncRNA MUC19通過競爭性結(jié)合miRNA hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-145a-5p而減少GATA2和CDK6與miRNA的結(jié)合從而上調(diào)GATA2和CDK6的表達(dá)水平；lncRNA DYNCC2-DT通過競爭性結(jié)合miRNA hasmiR-185-5p而減少IL3RA與miRNA的結(jié)合從而上調(diào)IL3RA的水平。GATA2是重要的正常造血調(diào)節(jié)因子，主要在早期造血干/祖細(xì)胞中表達(dá)。髓樣分化過程中，GATA2表達(dá)下調(diào)，而GATA2在白血病中的高表達(dá)則反映了造血干/祖細(xì)胞分化、發(fā)育阻滯，幼稚白血病細(xì)胞增多［19］。CDK4、CDK6屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKs家族，如果CDKs表達(dá)異常，就會引起細(xì)胞周期紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［20］。已有研究發(fā)現(xiàn)，CDK6在膀胱癌、結(jié)腸癌和卵巢癌［21-23］等多種癌癥中高表達(dá)。IL3RA（CD123）是白細(xì)胞介素3（interleukin-3，IL-3）受體的α亞基，其調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖、存活和分化。IL3RA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種類型的白血病中表達(dá)，如AML、B-祖細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（Bacute lymphoblastic leukemia， B-ALL）、T細(xì)胞白血?。═ cell acute lymphoblastic leukemia， T-ALL）和慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia， CLL）。有實(shí)驗(yàn)表明，使用中性抗IL3RA抗體和asIL3RA抗體偶聯(lián)毒素靶向IL3RA表達(dá)細(xì)胞，在AML模型中顯示出對生存的有益影響［24］。越來越多的證據(jù)表明，IL3RA在白血病干細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常造血干細(xì)胞中不表達(dá)，并且在AML中與治療反應(yīng)、微小殘留病檢測和預(yù)后有關(guān)［25-27］。因此我們推測lncRNA MUC19、DYNCC2-DT可能以ceRNA的模式調(diào)控基因的表達(dá)從而影響了AML的進(jìn)展。

綜上所述，通過預(yù)測成功地構(gòu)建了AML中l(wèi)ncRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示了lncRNA可能通過miRNA間接調(diào)控差異表達(dá)的mRNA而參與AML的發(fā)病過程，為AML的作用機(jī)理研究提供了新的思路，同時(shí)為其治療提供了潛在的靶點(diǎn)。