王振 ， YAO Mawulikplimi Adzavon ， 劉梓嘉 ， 劉夢昱 ， 謝飛 ，馬雪梅 ， 趙鵬翔

1.北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京 100124；

2.北京氫分子研究中心， 北京 100124；

3.抗病毒藥物北京市國際科技合作基地，北京 100124

作為人體最大的器官，皮膚具有多種功能，包括抵御微生物、調節(jié)體溫、分泌、排泄和參與內部環(huán)境的穩(wěn)定等［1］。皮膚損傷不可避免，但其修復是一個復雜且受到嚴格調控的過程，需要多種類型細胞［2］的協同作用以及相關細胞外基質（extracellular matrix，ECM）［3］來促進愈合。皮膚損傷后，凝血級聯反應引發(fā)炎癥，中性粒細胞、巨噬細胞遷移到傷口部位；隨后在細胞因子和趨化因子的作用下，血管內皮細胞、角質細胞以及上皮細胞共同負責血管生成和上皮化；與此同時，成纖維細胞遷移到受損區(qū)域，產生大量膠原蛋白，肉芽組織和ECM重新形成以填充傷口［4］。此外，上皮細胞經歷上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與真皮修復［5］。受傷組織的重塑時間取決于皮膚受損程度以及創(chuàng)傷局部微環(huán)境，而自然的皮膚修復通常會形成疤痕。疤痕形成以膠原的過度合成與沉積為特點，從主要的Ⅲ型膠原過渡到Ⅰ型膠原。這不僅給患者造成巨大痛苦，也給醫(yī)療工作帶來巨大負擔。盡管疤痕形成途徑和過程已有較多研究，但迄今為止還沒有發(fā)展出切實有效的疤痕防治方法［6］。

與成年小鼠愈合模式不同，哈里森描述了胎兒傷口的完美修復模式，即有效修復皮膚傷口而不形成疤痕 ，隨后的研究逐漸確立了這一無疤痕愈合概念［7］。一般來說，無疤痕愈合只出現在早期胎兒中，人類胎兒在妊娠24周左右［8］，小鼠在妊娠18 d左右［9］（E18），愈合方式將從無疤傷口愈合轉變?yōu)榘毯塾夏Ｊ健Ｑ芯勘砻?，快速上皮化是無疤痕傷口愈合的特征［10］，無疤痕/疤痕愈合模式之間的主要區(qū)別在于血管生成速率、炎癥水平、皮膚結構狀態(tài)和組織重塑快慢的不同，但目前缺乏對無疤痕愈合分子機制的系統研究。為了探索無疤痕愈合的分子機制并確定涉及無疤痕愈合的重要通路、基因，本研究分析了基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）中的GSE71619數據集，比較了小鼠胎兒（E14和E18）和成年（6周齡）皮膚組織中的基因表達。相關研究結果希望有助于發(fā)現新的疤痕治療靶點，并為臨床創(chuàng)傷治療提供更有效的策略。

1 材料和方法

1.1 表達譜芯片數據

不同胎齡皮膚愈合的相關芯片數據來源于GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。篩選得到數據集GSE71619［11］，平臺注釋文件為GPL19179。GSE71619數據集包含C57BL/6J不同胎齡/鼠齡的皮膚組織樣本，納入胎齡14 d（E14無疤痕愈合模式組）、胎齡18 d（E18）和6周齡成年鼠（W6）（疤痕愈合模式組）各6例，共18例皮膚樣本。

1.2 數據處理和DEGs的選取

利用edgeR包（版本：3.32.1）和TMM（trimmed mean of M-values）方法對上述芯片進行預處理和 標準 化［12-13］。應 用Limma 包［14］（版本：4.0.3；https：//www.R-project.org/）進行DEGs篩選。篩選條件設置為|log2FC|≥1以及P＜0.05。在E14vsE18、E14vsB6和E18vsB6 3個比較組之間采用維恩圖縮小尋找調控無疤痕愈合相關差異基因的范圍［15］。

1.3 功能富集分析

通過Metascape［16］對2個比較組（E14vsE18，E14vsW6）中的關鍵靶點基因進行基因本體（gene onotology，GO）功能和通路（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.4 PPI網絡的構建

將1.2中得到的關鍵靶點導入String［17］數據庫（https：//string-db.org/）中，置信度分數設置為highest confidence（0.9），隱藏網絡中無聯系的節(jié)點，其余參數保持默認。

1.5 統計分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（Xˉ±S）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 無疤痕愈合皮膚（E14）和疤痕愈合皮膚（E18+W6）之間的DEGs篩選

為了確保數據分析的準確性，首先使用主成分分析（principal component analysis，PCA）度量集群的相似性［18］。3組樣本（E14、E18、W6）之間的相似性如圖1所示。為了保持不同組之間的相對獨立性，我們在每組中保留了4個樣本，共12個樣本用于進一步分析。在E14、E18和W6皮膚組織活檢中，共對19 784個基因進行了基因表達譜分析，共鑒定出4 654個DEGs（|log2FC|＞2，P＜0.05）。比較E14和E18的基因表達，我們發(fā)現E14中有1 523個基因上調，3 131個基因下調（圖2A，C）。與W6相比，E14中有1 160個DEGs，包括791個上調基因和732個下調基因（圖2B，D）。

圖1 PCA分析Fig. 1 PCA analysis of raw data

圖2 不同胎齡和成熟小鼠皮膚組織的差異基因Fig. 2 DEGs in mice embryonic and adult skin

2.2 無疤痕皮膚和疤痕皮膚之間DEGs的功能表征

分別對E14vsE18以及E14vsW6上調和下調基因進行富集分析。E14vsE18上調DEGs主要的生物學功能和途徑包括組織形成、上皮發(fā)育、細胞黏附；E14vsW6中富集功能包括組織發(fā)育以及細胞增殖（表1）。下調DEGs（表2）在炎癥反應以及細胞分化（E14vsE18）和代謝過程、氧化還原反應（E14vsW6）功能中富集。

表2 E14 vs E18 和E14 vs W6中下調差異基因富集的前20個生物學功能Table 2 Top 20 biological function of related differential genes to the E14 Down-DEGs in E14 vs E18 and E14 vs W6

2.3 潛在無疤痕愈合相關基因的識別分析

包含不同發(fā)育階段的皮膚組織的數據集結合功能注釋表明，篩選出的DEGs也包括調控胎兒皮膚向成人皮膚發(fā)育過渡的基因（表1～2）。我們對E14、E18和W6小鼠皮膚組織樣本的基因群進行了維恩圖分析和功能注釋（圖3A）。E14vsE18和E14vsW6重疊但排除在E18vsW6之外的228個基因在很大程度上與發(fā)育過程無關，其功能注釋主要集中在傷口愈合方面。對這228個候選基因進行分析，并從中鑒定出4個Cluster（圖3B），其中Cluster 2由于E14組中個體平行性較差，且總體基因數量較少，因此暫不做細化分析。通過分析Cluster 1和Cluster 4發(fā)現，E14基因表達水平相似，E18和W6組在這2個Cluster中的表達水平特點呈現相似性，因此將這2個Cluster整合進行后續(xù)分析。

表1 E14 vs E18 和E14 vs W6中上調差異基因富集的前20個生物學功能Table 1 Top 20 biological function of differential genes related to the E14 Up-DEGs in E14 vs E18 and E14 vs W6

Cluster 1和Cluster 4中的基因（在E14中大多數表達下調）主要富集于代謝相關功能（圖3C），如有機化合物氧化、次級代謝過程、羧酸生物合成過程和AMPK信號通路。PPI網絡分析揭示了兩個簇中的關鍵基因，涉及PPP2CB、PPP2R5B、PIM3、PPM1L、AKT2、COX4I1、UBE2G2、MGST3、GSTM1和CYP1B1等（圖3D）。

Cluster 3中的基因（在E14中大部分上調）主要富集于肌肉活動和ECM合成相關功能（圖3C），GO富集前5個生物學功能為橫紋肌收縮、骨骼肌收縮、ECM形成、橫紋肌細胞發(fā)育和肌肉結構發(fā)育。該聚類的PPI網絡分析顯示，多為富含膠原和肌肉結構家族的hub基因，如COL5A2、COL4A2、COL1A2、MYH8、MYH3、TNNT2和TNNI1（圖3D）。

圖3 胎兒無疤愈合相關基因的鑒定Fig. 3 Identification of fetal scarless healing related genes.

2.4 關鍵基因的PPI分析

在ECM成分基因中，我們發(fā)現了更多與膠原家族有關的基因，包括COL1A2、COL4A2、COL5A2和COL8A1，它們可能是促進更好的組織重塑的關鍵基因（圖4A）。成纖維細胞和肌成纖維細胞（也稱為活化成纖維細胞）是ECM合成的主要來源。這些細胞位于富含ECM的結締組織中，合成、維持和重組ECM成分。在E14中上調的差異基因富集功能可能與成纖維細胞遷移、增殖和活化有關（圖4B）。因此，我們認為E14組的成纖維細胞活化可能是觸發(fā)無疤痕愈合的另一個關鍵因素。

圖4 Cluster 1&4和Cluster 3中通過PPI分析獲得的具有代表性的關鍵基因Fig. 4 Representative hub genes expression data out from the PPI network analysis for the genes in Cluster 1&4 and Cluster 3.

胎兒早期炎癥反應水平較低，與本研究中得到的結果基本一致（圖4C），即E14下調的差異基因功能富集于炎癥相關功能。此外，炎癥加劇會激活基質金屬蛋白酶，不利于ECM的進一步堆積。但我們發(fā)現線粒體功能相關基因的下調，如CYPB1、COX5B、CYC1（圖4E）與兔胎兒傷口愈合過程中的發(fā)現不一致［19］。此外，E14組的脂質代謝和抗氧化功能降低（圖4D），這可能與胎兒發(fā)育的微環(huán)境有關。

3 討論

隨著創(chuàng)傷修復研究的深入，研究者已在哺乳動物的胎兒中發(fā)現了無疤痕傷口愈合現象，且無疤痕愈合的能力隨著年齡的增長逐漸消失。這意味著胎兒皮膚在一定胎齡之前可以實現創(chuàng)傷后無疤痕愈合。本研究利用GEO數據庫，比較了孕早期（E14）、孕晚期（E18）和產后成年（W6）皮膚組織轉錄組數據，最終篩選出了包含25個下調基因和17個上調基因的核心基因模塊。

ECM重塑是傷口愈合的一個重要階段。研究表明，隆起的真皮疤痕組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白的水平均升高，因此ECM的過度形成導致疤痕的形成［20］。此外，ECM在愈合過程的每個階段都發(fā)揮著重要作用。一方面，ECM被視為修復過程的支架［12］，為愈合過程的每個階段（如血管形成、上皮化等）提供基質；另一方面，ECM在動態(tài)愈合過程中發(fā)揮轉導作用。如ECM通過調節(jié)生長因子和細胞因子，對中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞（角質形成細胞）發(fā)揮趨化作用［21］。通過本數據集的分析，我們發(fā)現Cluster3（E14上調）中基因富集的前3個生物學功能是橫紋肌收縮、骨骼肌收縮和ECM形成，表明ECM積累在無疤痕傷口愈合中的重要性。

炎癥始終是傷口愈合的一把雙刃劍。輕度炎癥對組織啟動細胞遷移和趨化以及分泌生長因子至關重要，而慢性炎癥會導致傷口難以愈合或愈合后出現異常疤痕［22］。糖酵解方式是多種干細胞群體的共同代謝特征，與氧化磷酸化過程相比，細胞一般通過糖酵解產生較低水平的能量［23］。結合在本研究中觀察到E14組的低能量生成水平，糖酵解可能在E14妊娠期占主導地位。因此，干細胞特性的維持可能與無疤痕愈合有關。

另一方面，本研究也存在一定的局限性。由于本文主要是采用生物信息學的方法，大量的數據結果是基于計算機與數學的統計功能進行的預測分析。結果的準確性取決于現代計算機技術的發(fā)展以及科研工作者對于該技術的理解，因此需要大量的實驗對本文結果進行驗證。

綜上，本研究通過數據集關鍵基因的篩選，揭示了ECM形成和纖維細胞活化在早期胎兒無疤痕愈合模式中的重要性，相關研究對未來的疤痕醫(yī)學護理具有一定參考價值。