李楠，李旭，程鵬，孔令鈺，楊萍 （天津市醫(yī)藥科學研究所，天津 300020）

姜黃素（curcumin，Cur）可通過調(diào)節(jié)多種信號通路，發(fā)揮抗黏液分泌、改善氣道重塑和減輕氣道高反應等作用，有望成為治療肺部炎癥性疾病的新型藥物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Cur可顯著抑制BEAS-2B細胞的增殖，提示Cur對支氣管上皮細胞介導的進行性炎癥反應具有預防作用[2]。

肺部吸入給藥可能是提高Cur等難溶性藥物生物利用度的有效途徑[3]。將藥物包裹于納米載體內(nèi)能減少藥物對肺部的不良反應，降低藥物對肺黏膜纖毛的損傷。本課題組前期曾采用微乳法制備了姜黃素固體脂質納米粒（Cur-SLN），將其微粉化后與載體乳糖（200目）和第三組分乳糖充分混勻后，制得Cur-SLN干粉吸入劑（Cur-SLN-DPI），經(jīng)測定其平均粒徑約為3.35 μm、排空率為95.17%、體外有效部位沉積率為28.73%[4]，但該制劑存在藥物從載體上分離效率低的問題。本研究采用課題組自主研發(fā)的花形乳糖（flower-shaped lactose，F(xiàn)L）[5-6]對原有Cur-SLN-DPI中的載體乳糖和第三組分乳糖進行替換，構建納米多孔FL裝載Cur-SLN吸入微粉（Cur-SLN-FL），并通過修飾載體表面的粗糙度，提高該微粉的分散性，改善藥物的體外肺部有效部位沉積效率；然后，以人支氣管上皮細胞BEAS-2B為對象，探討該吸入微粉作為肺部遞藥系統(tǒng)對氣道上皮細胞的安全性和作用機制，以期為該吸入微粉的進一步研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SPD-M20A型紫外檢測器、LC-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），F(xiàn)DU-2110型冷凍干燥機（日本EYELA公司），SZ-100型納米粒度儀（日本Horiba公司），S-3400N型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司），HELOS-OASIS型激光粒度儀（德國Sympatec公司），Sigma-3k30型高速冷凍離心機（德國Sigma-Aldrich公司），DNM-9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司），Aerolizer?吸入裝置（澳大利亞Novartis Pharmaceutical公司），新一代多級撞擊器（英國Copley公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

Cur原料藥（批號TZSW200317-1，純度99.0%）購自西安通澤生物科技有限公司；海藻糖購自艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司；FL（批號20210312）為實驗室自制。DMEM完全培養(yǎng)液、1640完全培養(yǎng)液和胰蛋白酶均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；胎牛血清均購自美國Gibco公司；脂多糖（LPS）購自美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒（批號042721220221）、Annexin Ⅴ/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批號092120201215）、JC-1線粒體膜電位測定試劑盒（批號093020201026）均購自上海碧云天生物技術有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 實驗細胞

BEAS-2B細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 Cur的含量測定方法

采用高效液相色譜法進行檢測[5]。色譜柱為Agilent C18（150 mm×5 mm，4.6 μm）；流動相為乙腈-5%冰醋酸溶液（55∶45，V/V）；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為426 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為20 μL。

2.2 Cur-SLN混懸液的制備

稱取處方量的泊洛沙姆188和吐溫-80，在75 ℃磁力攪拌下加入適量水作為水相；另稱取處方量的Cur、單硬脂酸甘油酯和PEG-40硬脂酸酯，在相同溫度和轉速下加入適量無水乙醇，完全溶解后作為有機相。在80 ℃、1 020 r/min恒溫磁力攪拌下，將有機相緩慢注入水相中，滴加完畢后，繼續(xù)恒溫攪拌3 h使其濃縮。趁熱將熱乳液以1∶1（V/V）加入0～2 ℃的冷水中，低溫固化2 h，即得黃色的Cur-SLN混懸液，于4 ℃下保存。同法制備空白SLN混懸液，備用[7]。

2.3 Cur-SLN-FL的工藝優(yōu)化及制備

2.3.1 單因素實驗優(yōu)化Cur-SLN的凍干保護劑 基于課題組的前期研究[7]，本研究僅對Cur-SLN的凍干保護劑進行考察。凍干保護劑的種類和濃度與其對樣品的保護作用直接相關。量取同體積的Cur-SLN混懸液，加入不同種類（乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖）和不同用量（2%、3%、5%）的凍干保護劑，混勻、分裝后，放入冷凍干燥機的程序凍干倉內(nèi)進行程序冷凍干燥。設置真空凍干程序約48 h，完成干燥后即得Cur-SLN凍干粉。以凍干粉的外觀形態(tài)、色澤、再分散性為主要評價指標[8]，評分標準見表1，綜合評分結果見表2。最終優(yōu)選出3%海藻糖為Cur-SLN凍干保護劑。以此條件所得凍干粉外形致密、飽滿、不回縮塌陷，為色澤均勻的淡黃色粉末，30 s可完全溶解。

表1 Cur-SLN凍干粉的指標評分標準

表2 不同凍干保護劑用量制備的Cur-SLN凍干粉質量評分結果

2.3.2 優(yōu)選凍干工藝所制Cur-SLN凍干粉的理化性質評價 取Cur-SLN凍干粉，測定樣品凍干前和凍干后再分散混懸液的粒徑、多分散性指數(shù)和包封率（%）[7]；采用透射電鏡觀察Cur-SLN凍干粉的形態(tài)。結果見表3和圖1。

圖1 Cur-SLN凍干粉再分散后透射電鏡圖

表3 樣品凍干前和再分散后的粒徑、多分散系數(shù)及包封率（±s，n＝3）

表3 樣品凍干前和再分散后的粒徑、多分散系數(shù)及包封率（±s，n＝3）

時間點凍干前再分散后平均粒徑/nm 19.13±0.11 21.69±0.95多分散性指數(shù)0.14±0.26 0.17±0.87 Zeta電位/mV-21.61±0.10-22.31±0.23包封率/%89.62±0.71 88.51±1.26

結果顯示，采用優(yōu)選工藝制備的Cur-SLN凍干粉經(jīng)再分散后，其粒徑、多分散性指數(shù)及包封率與凍干前略有變化，但其形態(tài)仍呈類球形或橢圓形，粒度圓整，表明凍干工藝不破壞Cur-SLN的結構。

2.3.3 Cur-SLN-FL的制備 分別精密稱量FL及Cur-SLN凍干粉適量，兩者以質量比2∶1、1∶1、1∶2，過200目篩混合均勻后，按2020年版《中國藥典》（四部）通則0951項下方法[9]，采用裝置1（雙級撞擊器）測定各部位的藥物沉積率[4]，實驗重復3次，結果見表4。

表4 不同混合比例對Cur-SLN-FL各部位沉積率的影響（±s，n＝3，%）

表4 不同混合比例對Cur-SLN-FL各部位沉積率的影響（±s，n＝3，%）

FL和Cur-SLN凍干粉的質量比2∶1 1∶1 1∶2模擬喉部25.19±1.08 21.03±0.79 16.12±1.28一級分布33.62±1.45 38.23±0.49 35.16±0.61二級分布29.34±0.51 32.76±2.61 40.92±0.02

由表4可見，Cur-SLN-FL的二級分布沉積率為（40.92±0.02）%，相比課題組前期報道的以吸入乳糖作為載體的Cur-SLN-DPI（28.73%）[4]，具有更高的藥物二級分布，推測可能是由于FL幾何粒徑雖較大，但密度較小，使FL空氣動力學粒徑較小，可在細支氣管中獲得更高的沉積率。隨著FL用量的減少，藥物的二級分布率沉積率逐漸提高，而模擬喉部的藥物沉積率逐漸降低。當FL與Cur-SLN凍干粉比例為1∶2時，藥物具有較好的二級分布。采用上述優(yōu)化工藝制備3批Cur-SLN-FL，并同法制備FL裝載的空白固體脂質納米粒吸入微粉（空白SLN-FL），用于后續(xù)理化性質的評價。

2.4 Cur-SLN-FL的理化性質表征

2.4.1 形態(tài)學分析 分別取Cur-SLN凍干粉、Cur-SLNFL和FL各適量，涂布在雙面導電膠上，再將導電膠固定于金屬板上，噴金后在掃描電鏡下觀察樣品的形態(tài)[5]，結果見圖2。

圖2 Cur-SLN凍干粉、Cur-SLN-FL和FL的形貌特征

結果顯示，Cur-SLN-FL呈現(xiàn)花形外貌，F(xiàn)L作為干粉吸入劑的載體在與藥物凍干粉混合的時候，將其吸附于其表面，起到了對Cur-SLN凍干粉表面形態(tài)的修飾作用，增加了粗糙度。

圖3 Cur-SLN-FL的粒徑分布圖

結果，Cur-SLN-FL的平均粒徑為（4.95±0.57）μm，De為（7.66±0.76）μm，Span為 2.39±0.41，MMAD 為（4.03±0.40）μm（MMAD在1～5 μm的范圍內(nèi)時，適合肺部吸入微粒的要求[10]）。

2.4.3 臨界相對濕度的考察 精密稱取Cur-SLN-FL適量，將其均勻鋪于預先精密稱定質量的具塞玻璃稱量瓶底部，置于不同相對濕度（relative humidity，RH）的恒溫恒濕箱內(nèi)，72 h后取出，精密稱量，計算吸濕率。以吸濕率為縱坐標、RH為橫坐標作圖，得吸濕平衡曲線[9，11]。結果如圖4所示。當RH大于52.89%時，Cur-SLN-FL的吸濕增重明顯上升，故本品的臨界相對濕度約為54%。這可能與FL的α/β復合結晶態(tài)有關，相較吸入乳糖，F(xiàn)L更易溶于水，因此在樣品的儲存中，尤其是高溫潮濕的季節(jié)，樣品應置于避光的干燥器內(nèi)。

圖4 不同RH下Cur-SLN-FL的吸濕百分率（25 ℃）

2.4.4 排空率的測定 取10粒裝有Cur-SLN-FL的膠囊，精密稱定其質量（m1）；然后將膠囊置于Aerolizer?吸入裝置內(nèi)，以（60±5）L/min的氣流抽吸4次、每次1.5 s，稱定其質量（m2）；用小刷拭凈膠囊內(nèi)的殘留內(nèi)容物，再稱定囊殼質量（m3）。計算每粒膠囊的排空率：排空率（%）=（m1-m2）/（m1-m3）×100%[4]。試驗重復3次，結果得Cur-SLN-FL的排空率為（90.34±1.21）%。

經(jīng)計算，Cur-SLN-FL在收集盤2～7級中的FPF為（47.5±0.7）%，明顯高于原有制劑 Cur-SLN-DPI的（25.8±0.6）%和Cur原料藥的（9.8±0.4）%。普通的Cur原料藥無法滿足肺部吸入制劑的要求，而原有制劑Cur-SLN-DPI有效部位沉積率雖符合《中國藥典》的要求[9]，但其在收集盤3～5級的比例明顯低于Cur-SLN-FL。結果見圖5。

圖5 空氣動力學實驗的各層級FPF的測定結果（±s，n＝3，%%）

Cur-SLN-FL實測MMAD為（4.33±0.08）μm，通常認為MMAD在0.5～5 μm的微?？杀环尾坑行?，而4～5 μm的顆?？捎脕磉f送治療呼吸系統(tǒng)疾病的藥物[10]，可見本研究制備的Cur-SLN-FL符合相關要求。

2.5 Cur-SLN-FL體外抑凋亡作用研究

2.5.1 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件和SPSS Statistics軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，各組與模型組行方差分析。檢驗水準α=0.05。

2.5.2 細胞培養(yǎng) 將BEAS-2B細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，貼壁生長，消化、傳代[12]。

2.5.3 空白SLN-FL浸提液的制備 在無菌條件下，將空白SLN-FL加入細胞培養(yǎng)液，在37 ℃下浸提24 h，制成不同質量濃度的空白SLN-FL浸提液。

2.5.4 Cur-SLN-FL對BEAS-2B細胞的毒性檢測 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備BEAS-2B細胞懸液。將BEAS-2B細胞以1.0×104個/孔接種于96孔板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（24±1）h，待細胞完全貼壁后，吸取培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次。換新鮮無血清培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔分為樣品對照孔（未經(jīng)處理的對照細胞孔）、樣品最大酶活性對照孔（未經(jīng)處理的陽性細胞孔）和處理樣品孔（Cur-SLN-FL和空白SLN-FL處理的細胞孔）。處理樣品孔每孔分別加入100 μL不同質量濃度（16、8、4、2、1 mg/mL）的空白SLN-FL浸提液和用培養(yǎng)液溶解的不同質量濃度（16、8、4、2、1 mg/mL）Cur-SLN-FL溶液進行處理，質量濃度設置參照課題組預試驗結果。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，將細胞培養(yǎng)板按400 r/min離心5 min，分別取各孔的上清液120 μL加入到新的96孔板相應孔內(nèi)，每孔再加60 μL LDH檢測工作液，混勻，室溫避光孵育30 min后，于490 nm處測定吸光度，并計算細胞毒性。細胞毒性（%）=（處理樣品孔吸光度-樣品對照孔吸光度）/（樣品最大酶活性對照孔吸光度-樣品對照孔吸光度）×100%。

結果顯示，經(jīng)Cur-SLN-FL處理2 h后，BEAS-2B細胞的增殖受到抑制，細胞的LDH釋放量隨著Cur-SLNFL質量濃度的增加而增加，且具有量效關系。經(jīng)計算，Cur-SLN-FL的半數(shù)致死量（LD50）為5.809 mg/mL。而空白SLN-FL浸提液按照《GB/T 16886.5-2017醫(yī)療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗》規(guī)定的細胞毒性檢測方法進行檢測，其LD50為3.908 mg/mL。

2.5.5 Cur-SLN-FL對BEAS-2B細胞早期凋亡的影響 采用Annexin Ⅴ/PI雙染法進行檢測。將BEAS-2B細胞懸液接種于6孔板，待細胞貼壁后將其分為Sham組、Model組、Cur-SLN-FL-H組（0.25 mg/mL）、Cur-SLNFL-L組（0.125 mg/mL）和Budesonide組（2.5 μg/mL），參考細胞毒性實驗結果和文獻[12]設置給藥劑量。除Sham組外，各組均加入含LPS（50 μg/mL）的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，Sham組、Model組加入同體積的培養(yǎng)液，給藥組分別加入對應劑量的藥液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，中和胰酶，終止消化，反復吹打使細胞脫落；以2 000 r/min離心5 min后，棄上清液，用PBS洗滌2次；再次離心5 min，棄上清液，采用PBS懸浮細胞，加入Annexin Ⅴ染色液混勻后再加入PI染液混勻，室溫避光染色15 min，用流式細胞儀檢測[13]。結果顯示，Sham組僅有少數(shù)細胞凋亡；與Sham組比較，Model組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與Model組比較，Cur-SLN-FL處理組的細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05），提示Cur-SLN-FL處理可減輕由LPS引起的細胞凋亡。結果見表5和圖6。

圖6 Cur-SLN-FL對BEAS-2B細胞早期凋亡率影響的流式細胞圖

表5 Cur-SLN-FL對BEAS-2B細胞早期凋亡率及線粒體膜電位的影響（±s，n＝5）

表5 Cur-SLN-FL對BEAS-2B細胞早期凋亡率及線粒體膜電位的影響（±s，n＝5）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05

組別Sham組Model組Cur-SLN-FL-H組Cur-SLN-FL-L組Budesonide組線粒體膜電位64.900±5.798 31.500±8.485a 50.750±1.626b 62.800±5.374b 65.850±2.051b細胞凋亡率/%4.000±0.283 23.533±1.290a 11.550±0.495b 15.200±2.404b 16.350±5.162

2.5.6 Cur-SLN-FL對BEAS-2B細胞線粒體膜電位的影響 采用JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位。將BEAS-2B細胞懸液接種于6孔板中，貼壁后按“2.5.5”項下分組處理24 h后，收集細胞，用PBS洗滌2次，以2 000 r/min離心5 min。按說明書配制JC-1熒光探針檢測工作液，每孔細胞用500 μL工作液懸浮均勻，于37 ℃、5%CO2避光染色20 min。經(jīng)2 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，收集細胞，用PBS洗滌2次，每孔用500 μL稀釋后的培養(yǎng)緩沖液重懸細胞后，用流式細胞儀檢測[13]。結果，與Sham組比較，Model組的線粒體膜電位顯著下降（P＜0.05），而Cur-SLN-FL處理組和Budesonide組的線粒體膜電位較Model組顯著升高（P＜0.05），表明Cur-SLNFL可以通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位減輕LPS引起的BEAS-2B細胞凋亡。結果見表5和圖7。

圖7 Cur-SLN-FL對BEAS-2B細胞線粒體膜電位影響的流式細胞圖

3 討論

載體型干粉吸入劑經(jīng)口吸入后，首先在呼吸道氣流的作用下，微粉由靜止變?yōu)榱鲃訝顟B(tài)；然后繼續(xù)在氣流的作用下，解聚成自由粒子，最終根據(jù)其空氣動力學粒徑的不同，沉積在肺部的不同位置。本課題組前期制備的Cur-SLN-DPI是將Cur-SLN吸附在一水合乳糖顆粒上，通過分子吸附作用將藥物分子固定。因載體乳糖和第三組分乳糖的稀釋劑粒徑均大于5 μm，限制了Cur-SLN-DPI進入細支氣管的量，其FPF僅為（25.8±0.6）%[4]。而本研究采用FL對原有載體乳糖和第三組分乳糖進行替換后，F(xiàn)PF提高至（47.5±0.7）%。由于溶解過慢可能會使得吸入顆粒被纖毛清除，降低治療效果[14]，而本研究制備的FL相比普通的吸入乳糖具有速溶的特性[5-6]，進入細支氣管后可迅速溶解，釋放出Cur-SLN，解決了干粉吸入劑脫吸附困難的問題。

氣道上皮細胞是呼吸系統(tǒng)的重要組成部分，是人體防止有毒顆粒、氣體和病原體侵入的第一道防御屏障[15]。氣道上皮細胞的過度凋亡通常被認為是氣道損傷的主要機制之一，線粒體是細胞凋亡的主要途徑之一，線粒體膜電位是目前最常用的反映線粒體通透性的指標之一，其下降越多表明細胞凋亡程度越深[13]。本研究制備的Cur-SLN-FL針對肺部吸入給藥的特點，以BEAS-2B細胞為靶細胞，進行了細胞凋亡率及線粒體膜電位研究。結果顯示，Cur-SLN-FL可有效削弱由LPS引起的BEAS-2B細胞的過度凋亡，且該作用與調(diào)節(jié)線粒體損傷有關。

綜上所述，本研究采用FL裝載Cur-SLN制成Cur-SLN-FL，操作簡便易行，有效改善了該制劑的體外肺部有效部分沉積率；同時，Cur-SLN-FL可通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位明顯改善LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡，為Cur等難溶性藥物應用于慢性阻塞性肺疾病呼吸系統(tǒng)疾病研究提供了一種新的思路。但本研究僅考察了Cur-SLN-FL在體外對LPS誘導BEAS-2B細胞損傷的作用，后續(xù)可考慮對其吸入給藥后改善慢性阻塞性肺疾病模型動物肺部炎癥的體內(nèi)藥效及作用機制進行深入研究。