張秋實 ，黃豐 ，童曉云 ，楊竹雅 ，李寶晶 ，林玉萍 ，瞿璐 ，聶堅 ，虎春艷 （.云南中醫(yī)藥大學南藥重點實驗室，昆明 650500；.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院科研部，昆明 6500；.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，昆明 650500；.云南中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，昆明 650500）

哮喘是世界范圍內嚴重危害人類健康的一種氣道慢性炎癥性疾病[1-2]。2019年《柳葉刀》報道，我國哮喘患病率呈逐年增長的趨勢，其中20歲以上人群哮喘患病率為4.2%，涉及人口超過了4 500萬[3]。研究表明，除了獲得性免疫外，固有免疫也被認為與哮喘有關[4]。在固有免疫細胞中，Ⅱ型固有淋巴細胞（type Ⅱ innate lymphoid cells，ILC2s）被認為是通過釋放輔助性T細胞（helper T cell，Th）因子而導致嗜酸性氣道炎癥的關鍵[5-6]。過敏原可誘導氣道上皮細胞產(chǎn)生白細胞介素25（interleukin 25，IL-25）、IL-33和胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）。這些細胞因子可激活ILC2s而產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等炎癥因子，并引起氣道炎癥[7-10]。

五寶膠囊又名“五寶散”（或“雅叫哈頓散”），為傣醫(yī)傳統(tǒng)解藥名方，自1977年以來被歷版《中國藥典》所收載。五寶膠囊由小百部、藤苦參、苦冬瓜、箭根薯、蔓荊子莖葉以及羊耳菊根6味藥等量組成，具有清熱解毒、止血止痛以及調平“風、火、水、土”四塔和“色、識、受、想、行”五蘊的功效，臨床用來治療寒熱感冒、咽喉腫痛、虛勞心悸、咳嗽咯血、月經(jīng)不調、氣血不足、產(chǎn)后諸風、胸腹脹痛和產(chǎn)后流血不止等癥[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五寶膠囊能夠改善氣道炎癥，可能通過調節(jié)Th1/Th2和Th17/調節(jié)性T細胞（Treg）的平衡來發(fā)揮防治哮喘的作用[12]。本研究進一步探索了五寶膠囊對哮喘模型小鼠氣道炎癥及ILC2s上下游細胞因子的影響，以期為傣藥五寶膠囊更廣泛的臨床應用和開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

本研究所用主要儀器包括INQUA NEB plus型超聲霧化儀（德國PARI公司）、AR224CN型分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]、Spectra Max Plus 384型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）、1706型離心機（德國Hettich公司）、8920型超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 主要藥品與試劑

五寶膠囊（批號170703，每粒含生藥量0.2 g）購自云南西雙版納藥業(yè)有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA；批號A5253）和地塞米松原料藥（貨號D1756，純度≥98%）均購自美國Sigma公司；納米氫氧化鋁（批號37801）購自阿拉丁科技（中國）有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色液（貨號G1005）和過碘酸雪夫（PAS）染色液（貨號G1008）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；IL-5、IL-9、IL-13、IL-33、TSLP、免疫球蛋白 E（immunoglobulin E，IgE）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（批號分別為 A20580821、A20980513、A21381132、A23380314、A26580933、A27581115）均購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；IL-25（IL-17E）ELISA檢測試劑盒（批號M201211-007a）購自深圳欣博盛生物科技有限公司；黏蛋白5AC（MUC5AC）ELISA檢測試劑盒（批號ZKVBMELGV3）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；OVA-IgE ELISA檢測試劑盒（批號544983）購自美國Cayman公司；脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonucleaseⅠ ，DNase Ⅰ ；批號 35027800）和 LiberaseTM（批號35537400）均購自瑞士Roche公司；水為超純水。

1.3 動物

SPF級雌性6～8周齡的BALB/c健康小鼠40只，體質量為18～20 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2020-0001。小鼠適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，環(huán)境相對濕度50%～60%。本實驗經(jīng)云南中醫(yī)學院動物實驗倫理審查委員會批準，批準號為R-06201910。

2 方法

2.1 試劑的制備

2.1.1 地塞米松藥液 準確稱取地塞米松粉末3.0 mg，用30 μL乙醇溶解后用生理鹽水定容至30 mL，配制成0.1 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱保存，使用前用渦旋儀混勻。

2.1.2 五寶膠囊溶液 稱取五寶膠囊粉末5.0 g，加入50 mL的生理鹽水溶解，制備成100 mg/mL的母液，再用生理鹽水稀釋為50 mg/mL的溶液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模和給藥

40只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組和五寶膠囊低、高劑量組，每組8只。參考相關文獻[12]建立哮喘模型：模型組和給藥組小鼠分別于第1、8、15天腹腔注射0.2 mL含氫氧化鋁的OVA致敏液（OVA 1 mg/mL、氫氧化鋁5 mg/mL、生理鹽水0.2 mL）；正常組小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水。從實驗第21天開始，陽性對照組小鼠每天灌胃1 mg/kg地塞米松藥液，五寶膠囊低、高劑量組小鼠每天分別灌胃0.5、1 g/kg五寶膠囊溶液[12]，正常組和模型組小鼠每天灌胃10 mL/kg生理鹽水，連續(xù)7 d。每次灌胃1 h后，將模型組和給藥組小鼠置于霧化器內，予2%OVA溶液6 mL霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min；正常組小鼠予生理鹽水霧化激發(fā)。

2.3 血清中IgE、OVA-IgE含量的檢測

最后一次霧化激發(fā)小鼠24 h后，各組小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）麻醉，剪除小鼠眼睛周圍毛發(fā)后，用75%的乙醇消毒，摘除眼球取血，血液靜置1 h，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱中待測。按ELISA檢測試劑盒說明書檢測血清中的IgE、OVA-IgE含量。

2.4 BALF中相關細胞因子和黏蛋白含量的檢測

各組小鼠取血后，脫頸椎處死，固定于小鼠解剖板上，用75%乙醇消毒小鼠胸腹腔，進行氣管內插管。右肺用血管夾夾閉，左肺用0.6 mL磷酸鹽緩沖液分2次灌洗，每次沖洗3遍；回收并合并2次支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），于4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，取上清液按ELISA檢測試劑盒說明書檢測 BALF 中 IL-5、IL-9、IL-13、IL-25、IL-33、TSLP、MUC5AC的含量。

2.5 肺組織病理變化和杯狀細胞增生的觀察

收集完小鼠BALF后，取各組小鼠右肺中葉，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，濾紙吸干，置于4%多聚甲醛固定液中24 h后，將組織切片并包埋于石蠟中，制備5～8 μm切片。用HE染色并評估分析小鼠肺組織炎性浸潤情況和氣管增厚情況；通過PAS染色觀察各組小鼠氣道杯狀細胞的分布。

2.6 肺組織中ILC2s數(shù)量的檢測

收集完小鼠BALF后，分離除五寶膠囊低劑量組（由于在預實驗中發(fā)現(xiàn)低劑量五寶膠囊沒有藥效，所以本實驗沒有分離五寶膠囊低劑量組）以外各組小鼠右肺上葉及下葉，并研磨成碎片，加入DNase Ⅰ和LiberaseTM，在37 ℃下消化20 min，用紅細胞裂解液去除紅細胞，制成單細胞懸液后通過流式細胞術檢測肺組織中ILC2s的數(shù)量。流式配色方案為7AAD-CD45+LIN-KLRG 1+ST2+。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，檢測結果以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 五寶膠囊對哮喘小鼠血清中IgE、OVA-IgE的影響

如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽性對照組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量均顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量檢測結果（±s，n＝8，pg/mL）

表1 各組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量檢測結果（±s，n＝8，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別正常組模型組陽性對照組五寶膠囊低劑量組五寶膠囊高劑量組OVA-IgE 0.78±0.49 5.91±0.45a 2.08±0.64b 2.79±0.62b 1.55±0.31b IgE 104.77±4.70 177.14±7.17a 114.45±6.26b 142.06±5.82b 129.64±5.46b

3.2 五寶膠囊對小鼠BALF中ILC2s上游細胞因子IL-25、IL-33、TSLP的影響

如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中ILC2s上游細胞因子IL-25、IL-33、TSLP含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽性對照組小鼠BALF中IL-25、IL-33、TSLP含量均顯著降低（P＜0.01）。

3.3 五寶膠囊對小鼠BALF中ILC2s下游細胞因子IL-5、IL-9、IL-13的影響

如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中ILC2s下游細胞因子IL-5、IL-9、IL-13含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽性對照組小鼠BALF中IL-5、IL-9、IL-13含量均顯著降低（P＜0.01）。

3.4 五寶膠囊對小鼠肺組織病理變化的影響

如圖1所示，正常組小鼠的肺組織結構完整，黏膜上皮完整，氣管平滑肌和基底膜正常，無明顯增厚現(xiàn)象；模型組小鼠氣管、肺泡以及肺間質周圍有大量炎癥細胞浸潤，基底膜增厚嚴重，上皮增生；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽性對照組小鼠的炎癥細胞浸潤及基底膜增厚均有不同程度的緩解。

圖1 各組小鼠肺組織的病理學顯微圖（HE染色，×200）

3.5 五寶膠囊對小鼠肺組織杯狀細胞增生的影響

氣道內的杯狀細胞可分泌黏液，黏液中黏蛋白糖原部分可被PAS染為藍紫色。如圖2所示，正常組小鼠氣道完整，無杯狀細胞增生，未見黏液；模型組小鼠氣道見大量藍紫色，說明黏液較多，杯狀細胞增生明顯；五寶膠囊高、低劑量組和陽性對照組小鼠氣道內藍紫色均有所減少，可見杯狀細胞增生和黏液分泌被抑制。如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中MUC5AC含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽性對照組小鼠BALF中MUC5AC含量均顯著降低（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠肺組織杯狀細胞增生顯微圖（PAS染色，×200）

表2 各組小鼠BALF中ILC2s上下游細胞因子和黏蛋白含量檢測結果（±s，n＝8，pg/mL）

表2 各組小鼠BALF中ILC2s上下游細胞因子和黏蛋白含量檢測結果（±s，n＝8，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別M U C 5 A C I L-2 5 I L-3 3 T S L P I L-5 I L-9 I L-1 3正常組模型組陽性對照組五寶膠囊低劑量組五寶膠囊高劑量組0.8 1±0.1 4 1.9 2±0.1 4 a 0.9 9±0.0 8 b 1.1 0±0.3 5 b 1.0 4±0.0 9 b 5 3 4.4 9±7 4.3 6 1 6 9 0.3 9±1 1 7.7 8 a 7 9 4.7 1±6 6.4 7 b 1 0 6 0.2 1±1 4 1.3 2 b 9 9 1.1 9±1 3 6.1 7 b 2 8 8.7 4±3 5.6 1 6 9 2.6 4±4 0.3 4 a 3 3 2.8 8±3 6.3 5 b 4 4 9.8 3±2 5.1 2 b 3 7 3.6 8±2 4.7 2 b 2 0 3.5 6±1 3.6 2 3 5 7.9 8±2 4.6 3 a 2 3 0.9 9±9.2 7 b 2 6 8.3 8±1 4.9 3 b 2 4 6.2 8±1 1.6 9 b 7 7.3 8±5.2 2 1 6 4.6 9±9.6 4 a 9 1.9 4±6.9 4 b 1 1 3.7 2±9.1 5 b 8 6.2 3±1 1.8 2 b 6 2 6.7 8±4 7.5 5 1 7 1 3.9 6±6 8.1 1 a 1 0 8 3.3 8±7 2.5 9 b 1 4 2 0.9 3±8 0.2 2 b 1 2 9 5.7 3±5 0.9 9 b 1 2 9.1 0±2 8.5 0 2 9 9.8 3±3 4.3 3 a 1 5 0.2 5±4 0.1 1 b 1 9 3.4 1±4 2.9 6 b 1 6 9.3 5±2 2.1 8 b

3.6 五寶膠囊對小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量的影響

如圖3和圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高劑量組和陽性對照組小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量均顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠肺組織中ILC2s的流式圖

圖4 各組小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量的檢測結果（n＝8）

4 討論

傣醫(yī)學認為，“四塔”“五蘊”在人體內的動態(tài)平衡是維持人體正常生命活動的基礎。哮喘主要因體內四塔、五蘊功能失調，加之冷風寒邪、痰濕不化、上犯于肺，阻塞肺氣而發(fā)。其傳統(tǒng)經(jīng)方五寶膠囊具有“調平四塔、清火解毒”等功效，在臨床上可用于治療咳喘、咳痰[11]。但目前國內對該復方的研究報道相對較少。

肺部病理改變是哮喘的表征。在哮喘病理組織切片上可觀察到氣道、肺泡及肺間質周圍有大量炎性細胞、上皮增生、黏蛋白增多、氣道壁增厚、氣道管腔狹窄。而這些病理變化以氣道炎癥為基礎產(chǎn)生，炎癥是哮喘發(fā)病機制的中心[13]。ILC2s通過介導2型細胞因子（包括IL-4、IL-5、IL-9和IL-13）的產(chǎn)生從而激活2型炎癥性疾?。ㄟ^敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等）中的嗜酸性粒細胞、B細胞、肥大細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞來啟動和放大氣道炎癥[9]。IL-5可激活嗜酸性粒細胞，并將其募集到肺部；IL-9可參與肥大細胞增殖，并在ILC2s存活中發(fā)揮關鍵作用[9-10]；IL-13是誘導MUC5AC分泌過多和導致炎癥的重要因素，IL-13還可通過介導單核細胞和嗜酸性粒細胞引起炎癥反應，進而引起黏液細胞化生、氣道纖維化和氣道阻塞[14]。IL-25，也稱為IL-17E，是IL-17細胞因子家族的成員。IL-17家族的大多數(shù)成員可導致中性粒細胞浸潤，誘發(fā)Th1型炎癥，而IL-25可導致嗜酸性粒細胞增多，誘導Th2型炎癥，并引起IL-4、IL-5和IL-13的過度產(chǎn)生[15-16]。IL-33是IL-1細胞因子家族的成員，在許多炎癥過程和疾病中起著至關重要的作用。IL-33與其受體ST2結合可增強體外和體內Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生[17]。有文獻表明，上皮來源的IL-33是誘導IL-13產(chǎn)生ILC2s的有效刺激劑[18]。上皮細胞來源的細胞因子TSLP與哮喘炎癥途徑的啟動和持續(xù)有關，其參與了炎癥性氣道疾病的發(fā)病機制，包括變應性鼻炎、慢性鼻竇炎、哮喘和慢性阻塞性肺病等[19]。哮喘的各種致病因素，包括氣道高反應性、黏液過度產(chǎn)生和氣道重塑，被認為至少部分是由TSLP通過其下游促炎作用驅動的，涉及的細胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13等[20]。因此，ILC2s的積累和激活被認為是哮喘炎癥的關鍵因素[7]。

本研究采用經(jīng)典的哮喘小鼠模型建立方法，選取BALB/c雌性小鼠，多次腹腔注射OVA致敏，霧化吸入OVA后激發(fā)，建立哮喘模型。病理組織切片HE染色顯示，模型組小鼠肺組織氣管周圍炎癥顯著增加，氣道黏液及炎癥細胞浸潤增多，氣管平滑肌和氣道基底膜增厚，提示哮喘模型建立成功[12，21]。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中的IL-25、IL-33、IL-5、IL-9、IL-13、TSLP含量和肺組織中的ILC2s數(shù)量均顯著升高；經(jīng)五寶膠囊干預后，上述細胞因子和ILC2s數(shù)量均不同程度降低，說明五寶膠囊可能通過調節(jié)ILC2s上下游細胞因子來緩解哮喘模型小鼠的炎癥反應。

IgE是由B細胞響應細胞介導的免疫反應的過敏原激活而產(chǎn)生的。過敏原特異性IgE與免疫效應細胞上表達的FcεRI受體具有高親和力，二者結合會導致效應細胞立即激活，最終導致細胞脫顆粒及促炎介質的釋放[22]。本研究表明，五寶膠囊可以降低哮喘模型小鼠血清中OVA-IgE和IgE的含量，減少炎癥因子的釋放，改善杯狀細胞增生，減少杯狀細胞分泌的MUC5AC，從而改善氣道炎癥，進而緩解哮喘。

綜上所述，五寶膠囊可通過調節(jié)ILC2s上下游細胞因子改善哮喘模型小鼠的氣道炎癥反應和病理變化，減少哮喘模型小鼠黏蛋白分泌和炎癥細胞對肺組織的浸潤，減輕哮喘模型小鼠的呼吸道損傷。