司 霞，張 昕，王晨堯，朱瑞芳，曹 妍，馮耀清，韓世范，*

1.山西醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，山西 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院；3.山西醫(yī)學(xué)期刊社有限責(zé)任公司

代謝相關(guān)脂肪性肝?。╩etabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是一種臨床病理綜合征，其特征是在沒有過量飲酒和其他特定肝損害因素的情況下肝細(xì)胞中脂肪沉積過多[1]。近幾年，隨著人們生活水平的提高，我國脂肪肝患病率增高，一項(xiàng)Meta 分析檢索了2008 年—2018 年相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)MAFLD 全國患病率達(dá)29.2%[2]，且已有研究顯示，MAFLD 與心血管疾病[3]、糖尿病[4]、肝癌[5]等慢性病發(fā)病率呈正相關(guān)。目前尚無針對(duì)MAFLD 的理想治療方法，但越來越多的研究者認(rèn)為，有效的飲食干預(yù)可能是治療MAFLD 的重要新策略[6]，給予科學(xué)的飲食建議對(duì)制定預(yù)防與改善MAFLD 的飲食護(hù)理方案具有極其重要的意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，部分MAFLD 病人能夠通過食補(bǔ)苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲的方式改善MAFLD 癥狀，但沙棘醋飲、苦蕎醋飲均屬于新型發(fā)酵功能飲品，有關(guān)醋飲對(duì)MAFLD 的相關(guān)研究有限，確切的健康益處尚不清楚。本研究就苦蕎醋飲、沙棘醋飲和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲對(duì)MAFLD 斑馬魚幼魚的影響進(jìn)行研究，以期明確醋飲對(duì)MAFLD 的預(yù)防效果?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院斑馬魚實(shí)驗(yàn)室繁殖培養(yǎng)的野生型AB 斑馬魚，生長溫度為（28±1）℃，光照14 h 與黑暗10 h 交替循環(huán)。

1.2 醋飲與試劑 膽固醇[金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司]；血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針方法的活性氧物質(zhì)測定試劑盒（Beyotime，中國）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（索萊寶）；E3 培養(yǎng)基；亞甲基藍(lán)（生工）；沙棘醋飲與苦蕎醋飲（山西梁汾醋業(yè)）；核糖核酸（RNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)（TAKARA）；qPCR 引物（由武漢塞維爾生物科技有限公司合成）。

1.3 主要儀器 BPH-9082 恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（力康儀器公司）；低溫離心機(jī)（Gene SPEED）；超聲破碎儀（Qsonica）；體式顯微鏡（Nikon SMZ745）；體式熒光顯微鏡（OLYMPUS SZX16）；酶標(biāo)儀（美國柏騰 SynergyH1）；-80 ℃低溫冰箱（松下公司）；分析天平（SOPTOP/舜宇恒平）；超微量分光光度計(jì)NanoDrop One（Thermo Fisher 公司）；PCR 儀(東 勝-ETC821D)；CFX96TMReal-Time PCR Detection System 熒光定量PCR 儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.4 研究方法 配制斑馬魚幼魚高膽固醇飼料 準(zhǔn)備需要制備的幼魚飼料，按照5%的比例添加膽固醇，用液體乙醚將膽固醇充分溶解后再與幼魚飼料混合，進(jìn)行充分?jǐn)嚢柚敝烈颐讶繐]發(fā)。

1.5 斑馬魚幼魚分組與喂食 野生型AB 品系斑馬魚在E3 培養(yǎng)液中孵化至受精后5 d 時(shí)將斑馬魚更換至白色塑料小缸中，容量約1 L，鍛煉幼魚游泳能力。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后在體式顯微鏡下將發(fā)育正常、游泳能力好的幼魚按完全隨機(jī)分組的方法分為對(duì)照組、高膽固醇飲食組、苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組，每組100 條幼魚，所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置2 個(gè)平行組。對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料20 mg，高膽固醇組給予高膽固醇飼料20 mg，苦蕎醋飲組給予高膽固醇飼料20 mg+0.1%苦蕎醋飲，沙棘醋飲組給予高膽固醇飼料20 mg+0.1%沙棘醋飲，苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組給予高膽固醇飼料20 mg+0.05%苦蕎醋飲+0.05%沙棘醋飲。喂養(yǎng)后及時(shí)清理食物殘?jiān)?，每天換水1 次。連續(xù)干預(yù)1 周。

1.6 觀察指標(biāo)及其實(shí)驗(yàn)方法 ①存活率：連續(xù)干預(yù)1周后觀察并記錄各組斑馬魚幼魚存活條數(shù)，并計(jì)算百分率。②體重、體長：連續(xù)干預(yù)1 周后用0.02%三卡因(Tricane)將幼魚麻醉，用吸水紙將幼魚表面水分吸干，將10 條幼魚作為一組樣本采用分析天平測量體重；選取30 條斑馬魚幼魚，顯微鏡下采用Image 軟件測量斑馬魚幼魚體長。③三酰甘油、總膽固醇和丙二醛：連續(xù)干預(yù)1 周后，每組隨機(jī)選取斑馬魚幼魚50 條，按照試劑盒說明書測量幼魚體內(nèi)三酰甘油、總膽固醇和丙二醛濃度。④油紅O 染色與蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝內(nèi)脂質(zhì)積累情況及肝臟組織病理變化：連續(xù)干預(yù)1 周后，每組隨機(jī)選取10 條斑馬魚幼魚，用4%多聚甲醛固定斑馬魚幼魚，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（OCT）包埋，冰凍切片機(jī)上切片，用油紅O 和HE 染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。⑤熒光攝影觀察肝臟活性氧染色情況：DCFH-DA 本身并沒有熒光，但可以被活性氧氧化成有熒光產(chǎn)物，因此，根據(jù)其熒光信號(hào)強(qiáng)弱分析組織內(nèi)活性氧水平。每組隨機(jī)選取10 條斑馬魚幼魚，按照說明書將DCFH-DA 用魚水配制成10 μM/L 液體，在培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3 次，用0.02%Tricane 麻醉液麻醉，在熒光顯微鏡下拍照，所有照片采用相同參數(shù)，全程在暗室中進(jìn)行。⑥采用qPCR 法檢測脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)情況：每組隨機(jī)選取30 條斑馬魚幼魚置入冰上預(yù)冷的1.5 mL EP 管中，用trizol 法提取斑馬魚幼魚總RNA，提取溶解，使用超微量分光光度計(jì)檢測RNA 濃度，之后在PCR 儀上用TAKARA 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。qPCR 檢測基因相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性（95 ℃，30 s）1 個(gè)循環(huán)，PCR 反應(yīng)（95 ℃，5 s；60 ℃，30 s）40 個(gè)循環(huán)。各組基因相對(duì)表達(dá)差異以2-△△Ct值計(jì)算。目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)，先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用最小顯著差異法t檢驗(yàn)（LSD-t檢驗(yàn)），方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)。采用Graphpad Prism 8.0.1 軟件制圖。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚存活率的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組的斑馬魚存活率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組的斑馬魚幼魚存活率與對(duì)照組、高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚存活率的影響（±s） 單位：%

表2 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚存活率的影響（±s） 單位：%

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組試驗(yàn)次數(shù)33333存活率0.960±0.020 0.900±0.020 0.940±0.027 0.920±0.017 0.940±0.017

2.2 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚體重較對(duì)照組重（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體重較高膽固醇飲食組輕（均P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體重比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重的影響（±s） 單位：g/10 條

表3 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重的影響（±s） 單位：g/10 條

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組組數(shù)88888體重0.003 5±0.000 6 0.004 6±0.000 1①0.003 4±0.000 1②0.003 3±0.000 1③0.002 6±0.000 4④

高膽固醇飲食組與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與高膽固醇飲食組比較，②P＜0.05，③P＜0.01，④P＜0.001。

2.3 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體長的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚體長與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體長與高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表4。

表4 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體長的影響（±s） 單位：mm

表4 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體長的影響（±s） 單位：mm

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)30 30 30 30 30體長4.930±0.100 5.070±0.062 4.701±0.195 5.041±0.274 4.679±0.228

2.4 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚三酰甘油的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚三酰甘油較對(duì)照組高（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚三酰甘油與高膽固醇飲食組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表5。

表5 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚三酰甘油的影響（±s） 單位：mmol/L

表5 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚三酰甘油的影響（±s） 單位：mmol/L

① 高膽固醇飲食組與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)50 50 50 50 50三酰甘油0.011±0.001 0.017±0.001①0.019±0.001 0.017±0.001 0.016±0.001

2.5 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚總膽固醇的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚總膽固醇較對(duì)照組高（P＜0.05）；沙棘醋飲組斑馬魚幼魚總膽固醇較高膽固醇飲食組低（P＜0.05）。見表6。度的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚丙二醛較對(duì)照組高（P＜0.001）；苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚丙二醛較高膽固醇飲食組低（P＜0.001）。見表7。

表6 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚總膽固醇的影響（±s） 單位：mmoI/L

表6 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚總膽固醇的影響（±s） 單位：mmoI/L

高膽固醇飲食組與對(duì)照組比較，① P＜0.05；與高膽固醇飲食組比較，② P＜0.01。

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)50 50 50 50 50總膽固醇0.037±0.002 0.063±0.002①0.056±0.002 0.053±0.003②0.063±0.003

表7 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚丙二醛濃度的影響（±s） 單位：nmol/mgprot

表7 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚丙二醛濃度的影響（±s） 單位：nmol/mgprot

高膽固醇飲食組與對(duì)照組比較，① P＜0.001；與高膽固醇飲食組比較，② P＜0.001。

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)50 50 50 50 50丙二醛0.756±0.189 3.475±0.708①3.185±0.401 2.588±0.224 1.315±0.195②

2.6 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚丙二醛濃

2.7 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色的影響 干預(yù)1 周后，對(duì)照組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色呈淡紅色，邊界模糊；高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色呈紅色，邊界較清晰，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增多；苦蕎醋飲組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色面積和數(shù)量與高膽固醇飲食組相比未見明顯減少；沙棘醋飲組和苦蕎醋飲組聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色面積和數(shù)量與高膽固醇飲食組相比略有減少，但差異不顯著。說明喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟脂質(zhì)積累改善不明顯。見圖1。

圖1 喂食醋飲的高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟油紅O 染色圖

2.8 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟HE染色的影響 干預(yù)1 周后，對(duì)照組斑馬魚幼魚肝臟組織形態(tài)正常，排列緊密；高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚肝臟內(nèi)可見細(xì)胞間間隙較松散，出現(xiàn)大量空泡，脂肪變性占肝臟面積的60%以上，可診斷為發(fā)生MAFLD；喂食醋飲組斑馬魚幼魚肝臟內(nèi)仍可見細(xì)胞間間隙松散，較多空泡，說明喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟組織病理學(xué)改變不明顯。見圖2。

圖2 喂食醋飲的高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟HE 染色圖

2.9 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟活性氧（ROS）熒光染色的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚較對(duì)照組斑馬魚幼魚綠色熒光強(qiáng)度與面積增大；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組與高膽固醇飲食組相比，肝臟處綠色熒光面積較小，顏色較暗，見圖3。ROS 熒光定量分析顯示，苦蕎醋飲組和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組較高膽固醇飲食組低（P＜0.05）。見表8。

圖3 喂食醋飲的高膽固醇飲食斑馬魚幼魚熒光染色圖

表8 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚ROS熒光染色的影響（±s）

表8 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚ROS熒光染色的影響（±s）

與高膽固醇飲食組比較，① P＜0.01，② P＜0.05。

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)10 10 10 10 10 ROS 12.860±1.396 16.850±1.147 9.585±1.901①12.780±2.827 11.810±1.287②

2.10 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響 干預(yù)1 周后，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚HMGCRa、CYP51 mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組低（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚HMGCRa、CYP51 mRNA 表達(dá)與高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；各組CEBPA mRNA 表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表9。

表9 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響（±s）

表9 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響（±s）

高膽固醇飲食組與對(duì)照組比較，① P＜0.05，② P＜0.001。

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)30 30 30 30 30 HMGCRa mRNA 1.000 0±0.480 1 0.789 9±0.119 6①1.185 0±0.007 1 0.735 6±0.082 0 1.123 0±0.007 1 CYP51 mRNA 1.000 0±0.232 8 0.254 7±0.033 6②0.165 9±0.032 3 0.196 5±0.017 6 0.173 2±0.054 1 CEBPA mRNA 1.000 0±0.180 9 2.110 0±0.864 1 1.490 0±0.283 2 2.110 0±0.864 1 0.994 4±0.048 7

2.11 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響 干預(yù)1 周后，各組Keap1、Nrf2 mRNA 表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組高（均P＜0.05）；沙棘醋飲組斑馬魚幼魚TNF-α mRNA 表達(dá)水平較高膽固醇飲食組低（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚IL-1β mRNA 表達(dá)水平較高膽固醇飲食組低（均P＜0.05）。見表10。

表10 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響（±s）

表10 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響（±s）

高膽固醇飲食組與對(duì)照組比較，① P＜0.05，② P＜0.001；與高膽固醇飲食組比較，③ P＜0.05，④ P＜0.001。

組別對(duì)照組高膽固醇飲食組苦蕎醋飲組沙棘醋飲組苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組條數(shù)30 30 30 30 30 Keap1 mRNA 1.000±0.220 0.779±0.105 1.249±0.190 0.912±0.138 1.077±0.494 Nrf2 mRNA 1.000±0.480 0.601±0.338 0.764±0.588 0.736±0.082 0.563±0.785 TNF-α mRNA 1.000±0.063 1.907±0.420①1.562±0.023 1.092±0.155③1.839±0.246 IL-1β mRNA 1.000±0.232 10.110±0.841②0.661±0.074④0.916±0.040④1.017±0.124④

3 討論

MAFLD 被認(rèn)為是全球性的公共衛(wèi)生問題[7]。尋找有效的防控措施，對(duì)積極應(yīng)對(duì)MAFLD 意義重大。脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥是MAFLD 發(fā)生的重要原因。近年流行病學(xué)研究顯示，日常食物及食物中的功能成分可以有效應(yīng)用于疾病治療和預(yù)防[8]。醋在改善MAFLD 方面具有一定作用，已有學(xué)者對(duì)發(fā)酵醋飲進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其有很好的降脂[9]、抗氧化[10]等特性，能夠緩解脂肪性肝病。沙棘具有抗氧化、護(hù)肝等藥理活性，可能歸因于其高含量的多酚化合物，主要是黃酮類化合物[11]，目前已成為新功能食品的合適候選者[12]?？嗍w為藥食同源類糧食作物，起源于我國西南部地區(qū)，屬蓼科，富含黃酮類化合物，主要為蘆丁[13]，具有降血脂、降血糖、保護(hù)心血管等功效[14]。鑒于沙棘、苦蕎對(duì)人體健康有諸多益處，含豐富的生物活性物質(zhì)，本研究將沙棘醋飲、苦蕎醋飲納入研究，是在傳統(tǒng)老陳醋釀造的配料基礎(chǔ)上，將富含黃酮類化合物的藥食同源食物沙棘、苦蕎分別與老陳醋原料結(jié)合，經(jīng)過多次發(fā)酵、多菌共酵、后酵處理等工藝加工而成的藥食同源醋飲產(chǎn)品，既保持了原釀，還提高了其中生物活性物質(zhì)含量。

3.1 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚一般情況的影響 本研究結(jié)果顯示，干預(yù)1 周后，苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組的斑馬魚幼魚存活率與對(duì)照組、高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。對(duì)斑馬魚幼魚的體長進(jìn)行測量，結(jié)果顯示，各組間斑馬魚幼魚體長比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），與Ma 等[15]研究結(jié)果一致。提示體長可能不能作為高膽固醇飲食誘導(dǎo)斑馬魚MAFLD 相關(guān)實(shí)驗(yàn)的敏感指標(biāo)。但斑馬魚幼魚體重測量結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚體重較對(duì)照組重（P＜0.05）；苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚體重較高膽固醇飲食組輕（均P＜0.05），說明喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚具有減重作用。

3.2 喂食醋飲對(duì)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝的影響 脂質(zhì)積累是MAFLD 的基本病理特征，三酰甘油、總膽固醇是脂質(zhì)代謝的主要生化指標(biāo)。本研究對(duì)斑馬魚幼魚三酰甘油、總膽固醇含量進(jìn)行測量，結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組斑馬魚幼魚三酰甘油、總膽固醇均高于對(duì)照組，在5%高膽固醇飲食誘導(dǎo)下，醋飲干預(yù)組斑馬魚幼魚三酰甘油與高膽固醇飲食組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），提示本研究中的喂食醋飲劑量無法達(dá)到降低三酰甘油水平的效果。但沙棘醋飲組斑馬魚幼魚總膽固醇較高膽固醇飲食組低（P＜0.05），可能與沙棘醋飲中富含豐富的有機(jī)酸有關(guān)。此外，斑馬魚幼魚冰凍切片油紅O 染色與HE 染色結(jié)果顯示，喂食醋飲對(duì)斑馬魚幼魚肝臟脂質(zhì)積累與肝臟組織病理學(xué)改變改善效果不明顯。

為進(jìn)一步觀察喂食醋飲對(duì)斑馬魚幼魚肝臟脂質(zhì)積累的影響，對(duì)斑馬魚幼魚進(jìn)行q-PCR 實(shí)驗(yàn)，檢測喂食醋飲對(duì)斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)的mRNA 表達(dá)變化的影響，以期揭示喂食醋飲對(duì)斑馬魚幼魚MAFLD 脂質(zhì)代謝的潛在機(jī)制，結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組HMGCRa mRNA 表達(dá)較對(duì)照組下降（P＜0.05），可能是斑馬魚幼魚攝入過多外源性的高膽固醇飲食后反而抑制了肝內(nèi)內(nèi)源性膽固醇的合成。與戴文聰[16]采用高脂高膽固醇飲食喂食斑馬魚幼魚顯示HMGCRa 顯著下降結(jié)果一致。但本研究中，苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚HMGCRa mRNA 表達(dá)與高膽固醇飲食組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），提示喂食醋飲后斑馬魚幼魚體內(nèi)的膽固醇未能被小腸很好地吸收，因此HMGCRa mRNA 表達(dá)未見明顯下調(diào)。這種反饋性的調(diào)節(jié)機(jī)制還體現(xiàn)在對(duì)參與膽固醇生物合成的CYP51 調(diào)節(jié)方面，也有相關(guān)研究報(bào)道，肝細(xì)胞可以感知膽固醇水平的降低并上調(diào)CYP51以補(bǔ)償這種變化[17]。本研究結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組CYP51 mRNA 表達(dá)較對(duì)照組下降，可能是由于大量外源性膽固醇攝入抑制了膽固醇合成相關(guān)酶的活性，抑制了CYP51 基因表達(dá)。此外，本研究結(jié)果還顯示，醋飲組CYP51 mRNA 表達(dá)較高膽固醇飲食組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的基因CEBPA mRNA表達(dá)在各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。已有研究顯示，菠蘿醋[18]、椰子水醋[19]、蘋果醋[20]等發(fā)酵醋飲可以降低體重，提示醋飲可能通過參與其他基因表達(dá)調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝。因此，醋飲對(duì)MAFLD 斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝的影響有待進(jìn)一步研究。

3.3 喂食醋飲對(duì)斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激、炎癥的影響

氧化應(yīng)激在MAFLD 中起著至關(guān)重要的作用。MAFLD 病人的抗氧化系統(tǒng)受損，表現(xiàn)為脂質(zhì)過度積累導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，釋放ROS，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平升高。ROS 是機(jī)體應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的一種高活性分子，產(chǎn)生過多會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡。丙二醛含量通常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚丙二醛較高膽固醇飲食組低（P＜0.05），提示喂食苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲可以提高體內(nèi)抗氧化反應(yīng)水平，改善高膽固醇飲食斑馬魚幼魚肝臟氧化損傷，保護(hù)肝臟。原因可能為沙棘和苦蕎含豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抗氧化應(yīng)激活性[21]。

肝臟發(fā)生脂肪變性后會(huì)誘發(fā)MAFLD 的“二次打擊”，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞釋放趨化因子，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤，提高促炎細(xì)胞因子水平，包括TNF-α 和IL-1β，使肝臟發(fā)生炎癥，進(jìn)一步加劇對(duì)肝臟的損傷，使非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 進(jìn)展為肝硬化，最終發(fā)展為肝癌[22]。Keap1 與Nrf2 是氧化應(yīng)激通路中較重要的調(diào)節(jié)因子。TNF-α 可啟動(dòng)炎癥細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)肝細(xì)胞發(fā)起攻擊，TNF-α 水平高低與脂肪肝嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。IL-1β也是與炎癥相關(guān)的因子。本研究進(jìn)一步在分子水平對(duì)以上基因的mRNA 表達(dá)量進(jìn)行檢測，沙棘醋飲組斑馬魚幼魚TNF-α mRNA 表達(dá)水平較高膽固醇飲食組低（P＜0.05），苦蕎醋飲組、沙棘醋飲組、苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲組斑馬魚幼魚IL-1β mRNA 表達(dá)水平較高膽固醇飲食組低（均P＜0.05）。說明喂食醋飲有利于下調(diào)高膽固醇飲食斑馬魚幼魚炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，可以對(duì)肝臟起到一定的保護(hù)作用。與人參醋研究結(jié)果[23]一致，人參醋在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中抑制了促炎因子的表達(dá)，且研究結(jié)果顯示，與乙酸處理相比，人參醋處理對(duì)TNF-α和IL-6 水平的影響更明顯，說明促炎細(xì)胞因子不受乙酸處理影響，本研究中醋飲發(fā)揮的抗炎效果可能與醋飲中所含的生物活性物質(zhì)有關(guān)，苦蕎醋飲和沙棘醋飲中均富含黃酮類化合物。

4 小結(jié)

研究苦蕎醋飲、沙棘醋飲在MAFLD 斑馬魚幼魚中的作用有利于指導(dǎo)臨床護(hù)理人員對(duì)MAFLD 病人實(shí)施科學(xué)的飲食護(hù)理，幫助臨床護(hù)理人員適當(dāng)進(jìn)行醋飲干預(yù)，改善MAFLD 病人肝臟損傷。喂食醋飲對(duì)MAFLD 斑馬魚幼魚的基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，喂食醋飲有利于降低高膽固醇飲食斑馬魚幼魚體重，苦蕎醋飲和苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲有利于降低肝臟活性氧水平，苦蕎醋飲聯(lián)合沙棘醋飲有利于改善脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛對(duì)肝臟的損傷，沙棘醋飲有利于降低膽固醇水平，喂食醋飲有利于抑制高膽固醇飲食斑馬魚幼魚炎癥，提示喂食醋飲可能主要通過減輕氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)MAFLD 斑馬魚幼魚的保護(hù)作用，其對(duì)脂質(zhì)代謝的影響有待進(jìn)一步研究。