魏勝華，沈琪，秦夢茹，張慧云，湯中勛，李松，孟娜

(安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖，241000)

雙酚A(bisphenol A, BPA)，又名二酚基丙烷，是一種具有雌激素效應的環(huán)境污染物，微量的BPA就可對水體生物和人類健康產(chǎn)生極大的危害，該物質(zhì)與許多疾病的發(fā)生有著密切的關系[1]。然而，在現(xiàn)實生活中BPA與人們的生活又緊密相關，是制造嬰兒奶瓶、食品包裝盒以及微波爐飯盒的起始材料。伴隨著BPA生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴大，制造與應用過程中產(chǎn)生的廢水排放以及BPA制品分解導致的環(huán)境污染越來越引起人們的重視[2]。目前人們采取了多種方法來消除水體中BPA的污染，包括化學氧化[3]、物理吸附[4]、光催化[5]及生物降解等手段[6-7]。

漆酶(laccase, E.C.1.10.3.2)是一種含有銅離子的多酚氧化酶，該酶能利用分子氧為最終電子受體，實現(xiàn)多種化合物的高效氧化，在治理環(huán)境污染方面具有廣闊的應用前景[8-10]。漆酶能夠催化BPA形成苯氧自由基的中間體，而后這些具有活性的中間體在酶促反應位點外發(fā)生共價耦合，生成不同形態(tài)的多聚體，其往往是高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量的混合物，高分子質(zhì)量的不溶性低聚物常沉淀在水溶液中，可以采用過濾、沉淀或者離心等方法與水相分離，低分子質(zhì)量的化合物一般可以進一步代謝成為有機酸，總體上看，所降解產(chǎn)物的毒性都較低或者無毒，且后期易于處理，具有去除效果顯著和環(huán)境友好的優(yōu)點[11-13]。然而由于漆酶的穩(wěn)定性差，難以重復使用，使其在含BPA廢水的處理中的應用受到了限制。

提高酶穩(wěn)定性最有效的方法是酶的固定化，包埋法是常用的技術(shù)手段之一，通過將酶蛋白限制在高聚物的網(wǎng)格之中實現(xiàn)酶的固定化。其制備過程較為簡單，酶蛋白本身的特性改變小，固定化顆粒適合在多種反應器中進行催化反應。海藻酸鈉是一種常用的固定化材料，是由古洛糖酸與甘露糖醛酸為單元結(jié)構(gòu)連接而成的一種多糖，其與二價陽離子反應時可以很快形成多孔凝膠從而實現(xiàn)對酶的包埋[14]。為了有利于物質(zhì)的傳遞，擴大膠體顆粒的內(nèi)部的固定化空間，提高其機械強度，人們往往采用海藻酸鈉和明膠進行協(xié)同固定化，目前在果糖轉(zhuǎn)移酶[15]、L-阿拉伯糖異構(gòu)酶[16]、S-腺苷甲硫氨酸合成酶[17]等酶的固定化中都有應用的報道，然而由于其孔徑的增大，會造成反應過程中酶的泄露，從而使酶活力損失、催化效率下降。

本文采用戊二醛預先處理漆酶溶液，使酶分子預先交聯(lián)形成較大的體積，然后以海藻酸鈉-明膠為材料進行包埋，所制備的固定化交聯(lián)酶顆粒具有不易泄露、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，而且底物和產(chǎn)物的傳遞受到的阻遏作用較小，有助于酶對底物的快速降解。重點研究了影響固定化交聯(lián)酶制備的主要因素，探究了固定化交聯(lián)酶的穩(wěn)定性，考察了固定化交聯(lián)酶在鼓泡式反應器中對BPA的降解能力，為漆酶在治理內(nèi)分泌干擾物污染方面提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漆酶，來源于Trametessp.LS-10C(CCTCC NO:M2015191)通過固態(tài)發(fā)酵制得[18]；BPA(分析純)阿拉丁試劑有限公司；海藻酸鈉、明膠、戊二醛、愈創(chuàng)木酚、醋酸和醋酸鈉等其他試劑，均為分析純，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化交聯(lián)酶的制備

海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化交聯(lián)漆酶制備的過程見圖1，具體過程如下：將一定質(zhì)量分數(shù)的戊二醛溶液加入10 mL的粗漆酶溶液中，在25 ℃下磁力攪拌反應2 h后，然后在4 ℃下透析去除未反應的戊二醛，得到交聯(lián)的漆酶溶液；分別稱取明膠0.4 g、海藻酸鈉0.4 g于100 mL燒杯中加入20 mL純凈水，85 ℃加熱攪拌溶解，待溶解完全后，冷卻至室溫，將上述得到的交聯(lián)漆酶溶液以10%(體積分數(shù))的量加入其中，充分攪拌無氣泡后用注射器通過16號針頭將明膠-海藻酸鈉和交聯(lián)漆酶混勻的溶液滴入500 mL的質(zhì)量濃度為15 g/L CaCl2溶液中，過程中采用磁力攪拌使顆粒之間不黏連在一起，并保持固化1 h后過濾洗滌，得到固定化交聯(lián)酶的顆粒，所制備的固定化酶稱為固定化交聯(lián)酶；作為對照，以不經(jīng)過戊二醛處理后的酶而直接制備的固定化酶稱為固定化游離酶。

圖1 海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化交聯(lián)漆酶的過程Fig.1 Process of immobilized cross-linked laccase by sodium alginate-gelatin

1.2.2 固定化交聯(lián)酶穩(wěn)定性的研究

pH穩(wěn)定性：取一定量的固定化酶和游離酶分別放置在pH 3.0(50 mmol/L檸檬酸鹽)緩沖液和pH 8.0(50 mmol/L醋酸鹽)緩沖液中，靜置不同的時間后取樣測定酶活力，計算其剩余的催化活力。

溫度穩(wěn)定性：取一定量的固定化酶和游離酶放置在40～70 ℃的恒溫水浴中，靜置60 min后取樣測定酶活力，計算其剩余的催化活力。

操作穩(wěn)定性：將固定化酶置于pH 4.0的醋酸鹽緩沖溶液中室溫下進行振蕩，定時取樣，然后過濾洗滌，考察其剩余的催化活力。

1.2.3 BPA的降解

固定化酶降解BPA的反應在鼓泡式反應器中進行，反應器規(guī)格為高22 cm，直徑9 cm，置于水浴鍋中保持溫度恒定，空氣用壓縮機通過濾膜從底部打入，采用空氣流量計控制進氣的速率。反應體系中含有1 L的質(zhì)量濃度為10 μg/mL的BPA溶液，20 g固定化酶顆粒，反應pH為4.0，溫度30 ℃，通氣量0.5 L/min。

1.2.4 分析檢測

漆酶活力的測定采用比色法，以愈創(chuàng)木酚為底物[19]，固定化率的計算如公式(1)所示：

(1)

BPA的含量采用4-氨基安替吡啉顯色法檢測[20]，降解率的計算如公式(2)所示：

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化交聯(lián)漆酶條件的選擇

2.1.1 戊二醛的濃度對固定化的影響

圖2顯示了戊二醛對固定化酶制備的影響，隨著戊二醛濃度的增加，固定化酶的活力和固定化率都是逐漸增加的，當戊二醛的質(zhì)量分數(shù)為2.0%時，固定化酶的活力和固定化率都達到最高。但是由于戊二醛的活性較強，進一步增加戊二醛的濃度會使酶蛋白過度交聯(lián)，影響活性中心的構(gòu)象，造成酶的活力有較大的損失[21]。通常包埋法是直接將游離酶與固定化的載體材料混合在一起，由于單個酶分子直徑較小，很容易從固定化凝膠顆粒的網(wǎng)格中游離出去，因此在反應的過程中會有酶的泄露，從而造成酶活力的損失，在本實驗中利用戊二醛與酶蛋白反應形成席夫堿可以使酶分子之間形成交聯(lián)，從而增大了酶分子的體積，這樣就降低了酶蛋白從固定化顆粒中泄露的幾率[22]。戊二醛作為一種交聯(lián)劑常用在酶的固定化中，其常規(guī)操作是在酶被包埋以后，再加入戊二醛進行交聯(lián)，這種方法雖然能夠增加酶與載體的結(jié)合強度，但是在固定化過程中酶的流失依然無法避免[23]。

圖2 戊二醛濃度對固定化的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on immobilization

2.1.2 載體對固定化的影響

圖3顯示了海藻酸鈉和明膠的質(zhì)量比對固定化效果的影響，添加一定量的明膠對于改善固定化的效果是比較明顯的，但是明膠的含量不能太高，否則會使固定化凝膠的網(wǎng)格過大和凝膠的強度下降，當兩者質(zhì)量比為1∶1時效果最好。近年來，復配材料越來越多地應用在酶和細胞的固定化中，復配可結(jié)合各種固定化載體材料的優(yōu)點，使固定化效果達到最佳[24]。包埋法固定化酶由于聚合物的阻遏作用，使其難以有效調(diào)控傳質(zhì)，影響底物、產(chǎn)物和氧的傳遞，特別是漆酶降解BPA以及其他化合物過程中會形成大分子的聚合體，必須要及時地從固定化酶凝膠顆粒內(nèi)部擴散出來。添加明膠可以在保持固定化顆粒完整性和強度的基礎上減少海藻酸鈉的使用量，相應地增大了凝膠網(wǎng)格的孔徑，有利于提高固定化酶的催化效率[25]。

圖3 海藻酸鈉和明膠質(zhì)量比對固定化酶的影響Fig.3 Effect of the mass ratio of sodium alginate to gelatin on immobilized enzyme

2.1.3 CaCl2濃度對固定化的影響

圖4顯示了CaCl2濃度對固定化的影響，多孔隙網(wǎng)狀空間的海藻酸鈣凝膠結(jié)構(gòu)形成的過程是Na+與溶液中Ca2+在羧基部位進行離子交換，隨后Ca2+將兩側(cè)海藻酸分子鏈上的羧酸基團相連從而形成交聯(lián)，當CaCl2質(zhì)量濃度達到15 g/L時，固定化率與固定化酶活力趨于穩(wěn)定，表明此時形成的海藻酸鈣致密網(wǎng)格結(jié)構(gòu)能夠?qū)⒚傅鞍籽杆侔?，酶的流失較少。Ca2+濃度不足，其與Na+不能實現(xiàn)有效的交換而導致交聯(lián)的程度不高，固定化顆粒整體的機械強度較低，無法耐受后期反應過程中剪切力的作用；隨著Ca2+濃度的增加，固定化顆粒的交聯(lián)度也隨之上升，機械強度也逐步增強；但是過高的Ca2+濃度使滴入海藻酸鈉液珠的表面迅速交聯(lián)形成致密的凝膠層，造成后續(xù)的Ca2+較難進一步滲入到凝膠內(nèi)部，形成外硬內(nèi)軟的空心結(jié)構(gòu)[26]。

圖4 CaCl2濃度對固定化酶的影響Fig.4 Effect of CaCl2 concentration on immobilized enzyme

綜上，固定化交聯(lián)漆酶時戊二醛的質(zhì)量分數(shù)為2.0%、m(海藻酸鈉)∶m(明膠)=1∶1、CaCl2質(zhì)量濃度為15 g/L時的效果最好，固定化酶的酶活力為0.13 U/g。

2.2 固定化交聯(lián)酶穩(wěn)定性的研究

2.2.1 pH穩(wěn)定性

圖5為固定化酶的pH穩(wěn)定性。

a-pH 3.0；b-pH 8.0圖5 固定化酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of immobilized enzyme

經(jīng)固定化的處理后，酶對酸堿的耐受性得到了一定程度的提高，這得益于載體所構(gòu)建的微環(huán)境的保護作用，相比較而言固定化交聯(lián)漆酶的穩(wěn)定性要好于固定化游離酶，這可能是由于戊二醛的交聯(lián)作用增強了酶的剛性結(jié)構(gòu)，使其更能抵抗環(huán)境中的pH的變化。

2.2.2 溫度穩(wěn)定性

由圖6可知，固定化交聯(lián)酶對高溫的耐受性更強，在70 ℃時處理60 min后游離酶活力損失較大，固定化酶耐熱性較強，還剩余58.84%的酶活力，而固定化交聯(lián)酶剩余68.75%的酶活力，這可能是一方面戊二醛交聯(lián)增加了酶分子的穩(wěn)定性，另一方面可能是海藻酸鈉作為多糖本身就可以提高酶蛋白的抗逆性[27]。

圖6 固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of immobilized enzyme

2.2.3 操作穩(wěn)定性

圖7顯示了固定化酶在連續(xù)振蕩的操作條件下酶活力保留情況。

圖7 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.7 Operation stability of immobilized enzyme

通過振蕩作用可以加速凝膠內(nèi)部的酶分子向顆粒外部擴撒，長時間的振蕩會使固定化酶活力降低，在固定化顆粒保持完整的情況下，這只能是振蕩作用使酶的擴散泄露所造成的結(jié)果。隨著時間的延長，酶的泄露也會越多，從而造成酶活力的進一步降低。但與固定化游離酶相比，固定化交聯(lián)酶的剩余酶活力相對要高些，說明其酶蛋白的泄露較少。在30 h的振蕩后，固定化交聯(lián)酶的剩余酶活力為62.52%，高于固定化游離酶的45.28%，顯示其操作的穩(wěn)定性得到了進一步地提高。

2.3 鼓泡式反應器中降解BPA

鼓泡式反應器具有傳質(zhì)效果好、剪切力小，反應過程中固定化顆粒不易破裂的優(yōu)點，特別適用于機械強度一般的固定化酶的顆粒[28]。如圖8所示，固定化交聯(lián)酶和固定化游離酶的催化性能基本相似，反應3 h后的降解率達到85%以上。

圖8 BPA的降解過程Fig.8 Degradation process of BPA

圖9顯示了固定化酶在連續(xù)批次反應中的情況， 2種固定化酶的穩(wěn)定性差別較大，連續(xù)5個批次的反應以后固定化交聯(lián)酶剩余酶活力為34.93%，BPA的降解率仍能達到71.13%，分別是固定化游離酶的7.97倍和4.43倍，這說明采用先交聯(lián)后包埋的固定化策略，可以有效地解決酶的泄露，保持固定化酶的穩(wěn)定性，有利于催化劑的反復使用。

圖9 固定化酶重復使用的性能Fig.9 Reusability of immobilized enzyme

3 結(jié)論

本文以海藻酸鈉與明膠按照1∶1的質(zhì)量比例為載體材料協(xié)同固定化漆酶，吸取了2種固定化材料的優(yōu)點，通過添加明膠，增大了固定化酶凝膠顆粒的孔徑，克服了常規(guī)的海藻酸鈉固定化酶中由于凝膠孔徑較小而對傳質(zhì)的阻遏。

在常規(guī)的包埋法固定化的基礎上，通過預先將酶用質(zhì)量分數(shù)為2.0%的戊二醛經(jīng)過適當?shù)奶幚?，使酶聚集在一起，增大酶蛋白的體積，有效地解決了現(xiàn)有的酶在固定化以及反應過程中，由于酶流失造成的活力下降，使固定化酶的操作穩(wěn)定性得以提高，而且酶分子所形成的較大體積更適用于大孔徑的固定化凝膠，有利于大分子物質(zhì)的進出。

通過對固定化酶的各項穩(wěn)定性研究表明，所制備的固定化交聯(lián)漆酶在穩(wěn)定性上較固定化游離酶有了較大的提高；在鼓泡式反應器中對BPA進行降解試驗，結(jié)果表明，連續(xù)5個批次的反應以后固定化交聯(lián)酶剩余酶活力為34.93%，BPA的降解率仍能達到71.13%，分別是固定化游離酶的7.97倍和4.43倍，表明本文所建立的海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化交聯(lián)漆酶的方法適合重復性和連續(xù)性的操作，具有一定的應用潛力。