周建設，扎西拉姆，王萬良，孫帥杰，張 馳

( 1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院 水產(chǎn)科學研究所，西藏 拉薩 850032； 2.河南農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，河南 鄭州 450002 )

季節(jié)性繁殖周期包括性腺組織的年再生，主要由激素調(diào)節(jié)途徑介導[1]。越來越多的證據(jù)表明，節(jié)律性和繁殖行為是互相關聯(lián)的，生物鐘定時系統(tǒng)通過激素和神經(jīng)途徑影響多種生理系統(tǒng)，生物鐘基因表達的中斷會導致動物模型的繁殖行為和代謝變化，生物鐘還影響著多種生殖激素的血清濃度[2]。魚類同其他脊椎動物一樣，生殖腺的發(fā)育是周期性的，特定地區(qū)每年的繁殖季節(jié)固定，這便是魚類季節(jié)性的繁殖行為[3]。異齒裂腹魚(Schizothoraxo′connori)屬裂腹魚亞科，廣布于雅魯藏布江[4]，在中國脊椎動物紅色名錄中被評估為“無危種”，但其近緣物種如巨須裂腹魚(S.macropogon)、拉薩裂腹魚(S.waltoni)等被評估為“易危種”[5]。異齒裂腹魚集群產(chǎn)卵期為每年的3—5月[6]，表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性繁殖行為。已有大量的研究證實，魚類繁殖行為存在節(jié)律的變化[7-8]。

Clock基因是生物鐘基因的核心基因，被認為是自然選擇塑造日節(jié)律以及與動物繁殖等生活史特性有關的潛在目標基因[9]。Clock基因為節(jié)律振蕩器編碼出Clock蛋白，在Clock蛋白的氨基酸序列中存在多個保守序列，包括C端富含谷氨酰胺(Q)的結構域(Poly-Q)[10]，這個谷氨酰胺富集區(qū)起著轉(zhuǎn)錄激活的作用，同時C端谷氨酰胺重復區(qū)域的長度決定了Clock蛋白的轉(zhuǎn)錄激活潛能[11]，因此，它可以影響與動物晝夜節(jié)律相關的行為和生理功能[12- 13]。

研究表明，在各種有機體中，一切生理和行為都是由生物鐘控制的節(jié)律性活動[14]，大腦以外廣泛組織生物鐘基因轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)，表明細胞節(jié)律性可能具有更廣泛的生物學意義[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Clock基因在小鼠妊娠后期的子宮胎膜和胎盤中表達，可以調(diào)控小鼠的發(fā)情周期和妊娠情況[15-16]，在家禽中Clock等節(jié)律基因能夠通過促黃體生成素調(diào)控雞的排卵時期，同時在雞胚胎發(fā)育過程也發(fā)揮作用[17-18]。也有研究表明，馬崗鵝產(chǎn)蛋高峰期Clock基因表達水平在“下丘腦-垂體-性腺”軸組織中均高于休產(chǎn)期和就巢期[19]。魚類的生殖系統(tǒng)發(fā)育和繁殖性能跟禽類一樣，主要受性腺軸調(diào)控[20-21]，表明Clock基因可能在調(diào)控魚類的繁殖周期節(jié)律變化方面發(fā)揮重要作用。異齒裂腹魚在繁殖行為上表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性，Clock基因在其季節(jié)性繁殖中的調(diào)控作用有待于進一步研究。

筆者以雅魯藏布江中的異齒裂腹魚為研究載體，克隆異齒裂腹魚Clock基因全長cDNA，分析其組織表達特征，旨在探明Clock基因的組織表達模式，為從理論上揭示青藏高原裂腹魚Clock基因在季節(jié)性繁殖生理上的作用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用異齒裂腹魚于2019年2—3月采自雅魯藏布江拉薩流域，這個季節(jié)雅魯藏布江拉薩流域異齒裂腹魚即將進入繁殖季節(jié)，性腺大多處于Ⅳ期[6]。該階段被認為是人工激素誘導排卵的最佳階段，這個階段伴隨著卵母細胞核和細胞質(zhì)的幾個成熟過程，直到Ⅴ期卵母細胞成熟，包括生發(fā)囊泡的破裂、染色體凝聚、減數(shù)分裂紡錘體的組裝和第一極體的形成，并受到促性腺激素(促黃體生成激素、促卵泡成熟激素)、成熟誘導激素和成熟促進因子的調(diào)控，也是性腺發(fā)育過程中變化最大的一個階段[22]。

試驗魚用魚苗袋充氧運回實驗室，放入經(jīng)過清洗消毒處理的水泥池暫養(yǎng)過夜后，用三卡因間氨苯酸乙脂甲磺酸鹽(魚安定)麻醉后解剖判定性腺發(fā)育情況，為避免性別和年齡對試驗的影響[23]，挑選體質(zhì)量(1.42±0.23) kg、體長(36.34±0.34) cm的雌性個體3尾和體質(zhì)量(0.93±0.56) kg、體長(28.44±0.31) cm雄性個體3尾，性腺發(fā)育均處于Ⅳ期健康的異齒裂腹魚，采集心臟、脾臟、性腺、肝臟、肌肉和腦組織保存在液氮中，用于Clock基因全長克隆和組織分布研究。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按Trizol提取試劑盒(上海生物工程)說明提取樣本總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，每個樣本取1 μL RNA用U-3010紫外-可見分光光度計測定其濃度，要求1.82。用RevertAid Premium Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher)合成cDNA。

1.3 異齒裂腹魚Clock基因cDNA的克隆

1.3.1 引物設計

以異齒裂腹魚全長轉(zhuǎn)錄組測序結果(PRJ NA527715)調(diào)取Clock基因編碼序列設計特異性引物，引物序列見表1。

表1 引物名稱及序列

1.3.2 Clock基因cDNA全長的克隆

以3′adaptor為反轉(zhuǎn)錄引物的cDNA為模版，進行巢式PCR，反應體系見表2，反應程序見表3。以特異性引物RC595-RT1/RC595-RT2反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，經(jīng)RNase H和TdT處理后，進行巢氏PCR，反應體系見表2，反應程序見表3。

表2 3′RACE和5′RACE反應體系 μL

表3 PCR反應程序

巢式PCR結果以1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。目的片段連接轉(zhuǎn)化后，將克隆送上海生物工程測序，測序結果用軟件DNAMAN 8.0拼接。

1.4 異齒裂腹魚Clock基因組織分布特征

雌、雄異齒裂腹魚各3尾采集的心臟、脾臟、性腺、肝臟、肌肉和腦組織，按1.2所述合成cDNA，使用Oligo軟件設計特異性引物(clock-qPCR-f：5′-GCCACCTTCGCACAAGACC-3′；clock-qPCR-r：5′-ATAACTGCACCACACGCCAT-3′)，并以異齒裂腹魚β-actin序列設計內(nèi)參引物(β-actin-f：5′-CCCAGAGGAGCACCCCGTC-3′;β-actin-r：5′-AC GACCAGAGGCATACAGGGACA-3′)進行實時熒光定量反應。實時熒光定量反應體系為20 μL，其中：2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，引物(樣本引物：clock-qPCR-f和clock-qPCR-r；內(nèi)參引物：β-actin-f和β-actin-r)各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)。每個樣品設置3個技術重復，以縮小系統(tǒng)誤差。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實時熒光定量結果采用2-ΔΔCt法分析，Clock基因各組織相對表達量的定量結果通過SPSS 16.0軟件進行處理，顯著性檢驗采用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

1.6 系統(tǒng)進化樹

使用MEGA 6.0，鄰接法構建異齒裂腹魚Clock蛋白系統(tǒng)進化樹，檢驗各分支的置信度用自舉法重復1000次。

2 結果與分析

2.1 異齒裂腹魚Clock基因cDNA的克隆

通過cDNA末端快速擴增技術獲得異齒裂腹魚Clock基因cDNA 5′端和3′端(圖1)。拼接后Clock基因cDNA全長為4291 bp，5′非編碼區(qū)為539 bp、3′非編碼區(qū)為1046 bp、編碼區(qū)為2706 bp，異齒裂腹魚clock基因cDNA全長已上傳至Genbank數(shù)據(jù)庫(MT774361)。異齒裂腹魚Clock基因cDNA序列含有起始密碼子ATG及3′端Poly(A)結構，表明克隆到的異齒裂腹魚Clock基因核苷酸信息完整。

圖1 巢式PCR電泳結果

2.2 異齒裂腹魚Clock基因及蛋白序列分析

異齒裂腹魚Clock基因共編碼901個氨基酸(圖2)，所編碼的氨基酸與其他脊椎動物Clock蛋白一樣，在末端具有典型的Poly-Q結構。與其他魚類相比，異齒裂腹魚和尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewarti)的Clock蛋白存在大片段的插入，尤以尖裸鯉為典型。通過美國國家生物技術信息中心的BLAST分析，選取白甲魚(Onychostomamacrolepis)、金魚(Carassiusauratus)、撫仙金線鲃(Sinocyclocheilusgrahami)、斑馬魚(Daniorerio)等18種魚Clock蛋白的氨基酸序列構建鄰接樹(圖3)，與物種進化程度一致，異齒裂腹魚Clock蛋白與白甲魚Clock蛋白具有較高的同源性。

圖2 異齒裂腹魚Clock基因推導的氨基酸序列

圖3 異齒裂腹魚Clock基因推導的蛋白序列與近源種系統(tǒng)進化樹

2.3 異齒裂腹魚Clock基因在不同組織中的表達情況

采用實時熒光定量檢測Clock基因在異齒裂腹魚心臟、脾臟、性腺、肝臟、肌肉和腦中的表達分布情況，結果見圖4，其中，性腺組織的Clock基因表達量在雌魚和雄魚間差異顯著(P<0.05)，肌肉、全腦、肝臟、心臟和脾臟組織的Clock基因在雌、雄個體間差異不顯著(P>0.05)，除心臟組織的Clock基因相對表達量雄魚高于雄魚外，其他組織的相對表達量均表現(xiàn)為雌魚高于雄魚。在雌魚中，性腺和肌肉、全腦和肝臟、心臟和脾臟組織中Clock基因的相對表達量差異不顯著(P>0.05)，其余組織之間表達量差異極顯著或顯著(P<0.01，P<0.05)。以性腺中的相對表達量最高，顯著高于其他組織的相對表達量；其次為肌肉組織，其相對表達量顯著低于性腺組織，顯著高于其他組織；全腦中的相對表達量顯著低于性腺和肌肉，顯著高于脾臟和心臟。在雄魚中，肝臟和心臟、肝臟和全腦、心臟和全腦、性腺和肌肉中Clock基因相對表達量差異不顯著(P>0.05)，其余組織之間表達量差異極顯著或顯著(P<0.01；P<0.05)；以性腺中的相對表達量最高，顯著高于除肌肉外的其他組織；脾臟組織相對表達量最低，顯著低于其他組織。

圖4 異齒裂腹魚Clock基因在不同組織中的表達情況

3 討 論

3.1 異齒裂腹魚Clock基因結構特征

Clock基因是產(chǎn)生生物節(jié)律的核心基因[24-25]，異齒裂腹魚Clock基因編碼的Clock蛋白分子式為C4389H6978N1278O1405S37，為疏水性蛋白，與多個時鐘相關的蛋白互作，在物種進化上與撫仙金線鲃Clock蛋白具有較高的同源性[26]，筆者通過構建鄰接系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，異齒裂腹魚Clock蛋白與白甲魚Clock蛋白在進化上有較近的關系，其次為金線鲃屬魚類。武云飛[27]通過對裂腹魚類和鲃亞科魚類的外部形態(tài)、主要骨骼結構進行詳細比較后，認為裂腹魚類與鲃亞科魚類有著極近的親緣關系。本研究中，克隆到的Clock基因cDNA全長4291 bp，編碼區(qū)為2706 bp，編碼901個氨基酸；金線鲃魚類Clock基因編碼區(qū)全長2676 bp，編碼892個氨基酸，與其他物種Clock蛋白相似。異齒裂腹魚Clock蛋白在C端富含谷氨酰胺(Q)的結構域(Poly-Q)，共有44個谷氨酰胺；金線鲃Clock蛋白C端共有45個谷氨酰胺。有些物種的Ploy-Q長度隨緯度梯度的變化而變化，重要的是Poly-Q長度和緯度梯度變化與繁殖啟動的時間相關，緯度越高，Poly-Q長度相對較長[28]。有研究表明：Clock蛋白Poly-Q片段越短，亞洲短趾百靈(Calandrellaoheleensis)產(chǎn)卵開始的時間越早；而Poly-Q片段越長，產(chǎn)卵開始時間越晚[29]。O′Malley等[30]研究指出，Clock基因的變異拷貝數(shù)在秋季和春季產(chǎn)卵的大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)之間頻率顯著不同。異齒裂腹魚集中產(chǎn)卵時間集中在每年的3—5月，即使同一棲息地的異齒裂腹魚產(chǎn)卵時間也不盡相同，在個體水平上，魚類同一種群內(nèi)的不同個體繁殖時間也有差異，這便是表型多態(tài)性[29]。表型的多態(tài)范圍可能是物種應對環(huán)境變化的適應[31]。從異齒裂腹魚分布范圍來看，雅魯藏布江下游群體產(chǎn)卵開始時間早于中游和上游，這是由不同江段的水溫決定的，水溫越高產(chǎn)卵開始時間就越早[6]。而實際上，在同一江段群體中，雖然具有比較一致的溫度環(huán)境，但個體的產(chǎn)卵時間也有差異。因此，探討魚類生殖節(jié)律表現(xiàn)出來的個體差異是否與內(nèi)在的遺傳機制有關，對于了解魚類季節(jié)性繁殖行為能否通過微進化的方式應對環(huán)境變化具有現(xiàn)實意義[29]。異齒裂腹魚個體之間繁殖啟動時間的差異可能與Clock基因所編碼的蛋白C末端Poly-Q長度的變異有關，Poly-Q在許多轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活中起作用[32]。同時，值得注意的是，通過比較幾種魚類Clock基因所編碼的蛋白序列時發(fā)現(xiàn)，與其他魚類相比，異齒裂腹魚和尖裸鯉的Clock蛋白存在大片段的插入，尤以尖裸鯉為典型。曹文宣等[33]將裂腹魚亞科魚類劃分成適應于高原環(huán)境的3個特化等級，其中裂腹魚屬為原始等級，尖裸鯉屬為高度特化等級。不同等級的3個類群分布的海拔與每次高原隆起后達到的高度大體一致。從資源調(diào)查的結果看[34]，尖裸鯉的分布范圍最窄，僅在雅魯藏布江的仁布江段以上采集到，而異齒裂腹魚在整個雅魯藏布江中游均有分布。提示Clock蛋白在尖裸鯉和異齒裂腹魚中大片段的插入可能是為了適應高海拔某些條件而特化的。

3.2 異齒裂腹魚Clock基因組織表達特征

Clock基因廣泛分布于動物的各個器官組織中。筆者通過實時熒光定量PCR技術檢測了Clock基因在異齒裂腹魚雌、雄個體肝臟、脾臟、心臟、腦、性腺和肌肉中的表達情況。Clock基因在雌、雄異齒裂腹魚以上組織中都有表達，這一結果與其他物種(小鼠[35]、果蠅[36]、斑馬魚[37]和人[38])的研究結果一致。在果蠅中，自主的生理節(jié)律振蕩器存于全身[39]，說明異齒裂腹魚中心生物鐘和外周生物鐘也是同時存在的。本研究中，Clock基因在雌、雄個體性腺中的表達量均顯著高于其他組織，表明相對其他組織而言，Clock基因可能在調(diào)節(jié)異齒裂腹魚的繁殖方面發(fā)揮作用。也有研究證實，Clock基因的突變會打亂小鼠的發(fā)情周期[40]；Clock基因的突變可影響雌性果蠅的生殖健康和減少雄性果蠅精子輸出量[41]；Clock基因的突變可能會通過改變生物體對日節(jié)律的感知而對發(fā)情周期產(chǎn)生多重效應，進而影響交配時間[42]；通過候選基因定位方法，對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)產(chǎn)卵時間的QTL數(shù)據(jù)集進行分析發(fā)現(xiàn)，Clock基因明顯定位于虹鱒產(chǎn)卵時間的QTL區(qū)域內(nèi)[43]。Clock基因在異齒裂腹魚性腺中的高表達進一步提示，異齒裂腹魚繁殖時間在性腺決定的基礎上，還受Clock基因的微調(diào)影響。這種調(diào)控可能與其產(chǎn)卵開始時間關聯(lián)，而異齒裂腹魚Clock基因Poly-Q長度的變異與其繁殖啟動時間是否存在特定關系，及異齒裂腹魚Clock基因在不同季節(jié)各組織中的表達特征等，還有待進一步開展的工作。本研究中，異齒裂腹魚雌魚和雄魚肌肉組織中Clock基因的表達量僅次于性腺組織且差異不顯著，但極顯著高于其他組織，這一結果與同樣重要的內(nèi)源性生物鐘基因之一的Timeless基因在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[44]成蟹時期的表達情況一致，Timeless基因在成蟹時期的脂類儲存和脂類加工的重要器官中大量表達，以有效調(diào)控中華絨螯蟹在生殖洄游過程中的能量分配。魚類的繁殖是一個耗能過程，而肌肉組織是機體貯存能量的重要場所，在功能上主要承擔機體能量代謝、運動、有氧呼吸等[45]，在魚類繁殖過程中尤其是雌性個體，肌肉和性腺組織生物過程上的某些同步性是繁殖過程中能量供給的保障。Clock基因在雌魚性腺中的表達量顯著高于雄魚性腺，也進一步說明Clock基因在魚類的繁殖過程中對雌魚的調(diào)控作用更加顯著。在生物鐘環(huán)路中，Clock基因編碼的蛋白與Bmal1基因編碼的蛋白形成異源二聚體，在時鐘基因調(diào)控網(wǎng)絡中起到正向調(diào)控作用[46-48]，謝偉等[49]關于克氏原螯蝦Cyc基因(Bmal1基因在脊椎動物中的同源基因)的研究結果表明，Clock基因與Bmal1基因具有相似的mRNA表達水平，并受腦組織的支配，這與本研究中Clock基因在雌、雄魚全腦組織中相對表達量雖然差異不顯著，但雌魚高于雄魚的趨勢明顯這一結果基本符合，說明Clock基因在調(diào)控魚類繁殖節(jié)律的過程中受腦組織的支配。

4 結 論

筆者克隆了異齒裂腹魚Clock基因cDNA全長，其所編碼的氨基酸在末端具有典型的Poly-Q結構；Clock基因在異齒裂腹魚雌、雄個體的肝臟、脾臟、心臟、腦、性腺和肌肉中均有表達，雌、雄魚均是以性腺中的相對表達量最高，進一步提示Clock基因可能在異齒裂腹魚的繁殖過程中發(fā)揮更大的作用；推測異齒裂腹魚Clock蛋白C末端Poly-Q的長度的變異可能與其產(chǎn)卵開始時間關聯(lián)；Clock蛋白大片段的插入可能是為了適應高海拔某些條件而特化的。研究結果可為揭示青藏高原裂腹魚Clock基因在季節(jié)性繁殖生理上的作用提供科學依據(jù)。