孔 丹，李 偉

( 長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025 )

醛酮還原酶(AKR)超家族是一類動力學(xué)相似的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，醛酮還原酶家族成員多數(shù)以37 ku的單體形式存在，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、植物、原生動物、動物中，是一類在醛和酮還原中具有多種功能的依賴還原型輔酶Ⅱ的氧化還原酶[1]。所有已知的醛酮還原酶家族成員都有一個保守的(β/α)8或丙糖磷酸異構(gòu)酶(TIM)桶基序，以及一些決定底物特異性的可變環(huán)和螺旋[2]。醛酮還原酶成員在生物體中對醛酮類化合物起到很重要的解毒作用，可分為醛糖還原酶、醛酮還原酶、乙醛還原酶、強(qiáng)化類固醇脫氫酶和二氫二醇脫氫酶，與癌癥侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性等問題的發(fā)生密切相關(guān)[3]。醛酮還原酶基因作為應(yīng)激調(diào)節(jié)基因，參與氧化脅迫下的解毒調(diào)節(jié)機(jī)制，影響生物體內(nèi)氧化應(yīng)激與免疫調(diào)節(jié)[4]。目前，對于魚類這些低等脊椎動物的醛酮還原酶基因及其功能報道非常匱乏，亟需深入研究。

重金屬脅迫對魚類免疫調(diào)控以及氧化應(yīng)激過程有重要作用，即使低劑量的重金屬也對水生動物有巨大傷害。鎘嚴(yán)重影響了生物的生長性能、組織學(xué)、行為、發(fā)育以及生產(chǎn)生理學(xué)[5]。鎘的暴露可以改變酶的活性和基因的表達(dá)[6]，誘導(dǎo)肝細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生以及發(fā)揮其毒性[7]；能夠造成線粒體功能障礙，對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致許多疾病發(fā)生[8]。

黃鱔(Monopterusalbus)廣泛分布于東亞和南亞多個國家的泥塘、沼澤、稻田中，環(huán)境中的重金屬污染會影響其氧化還原代謝和機(jī)體的生理功能。有報道指出，魚類在養(yǎng)殖過程中會因水環(huán)境中藥物濫用和有毒化合物暴露發(fā)生“肝膽綜合征”[9]，其實質(zhì)就是魚類會因脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激而產(chǎn)生嚴(yán)重的肝損傷[10]。由于底棲生活的習(xí)性，黃鱔受到水環(huán)境中重金屬的影響程度更深，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。雖然王全禾等[11]制備了黃鱔醛酮還原酶的多克隆抗體并檢測了其特異性和效價，闞延澤等[12]發(fā)現(xiàn)，黃鱔醛酮還原酶可以提高細(xì)胞抗逆境脅迫的能力，但對該基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)譜的研究尚未見相關(guān)報道，其在重金屬誘導(dǎo)下的氧化應(yīng)激作用亟需深入了解。因此，筆者擬探究重金屬鎘處理對黃鱔醛酮還原酶(Eakr)基因表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步分析魚類醛酮還原酶基因在抗氧化應(yīng)激中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

原核表達(dá)載體pET-28a購自Novagen公司，大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)DH5α、BL21(DE3)等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，pET-28a-Eakr的BL21(DE3)菌株由本實驗室構(gòu)建并保存于長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所。

1.1.2 主要試劑盒

DNA凝膠回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Trizol柱純化總RNA提取試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)；2×SYBR Green PCR MIX試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)；SMARTer?RACE 5′/3′ Kit試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗樣品采集

試驗用黃鱔購自荊州水產(chǎn)市場，平均體質(zhì)量(50±10) g。在正式開展試驗前，使用經(jīng)過曝氣的自來水將黃鱔飼養(yǎng)于實驗室水箱中，飼養(yǎng)過程中連續(xù)曝氣并定期更換水。飼養(yǎng)馴化1周后用于后期的試驗。

隨機(jī)選取馴化后的黃鱔4尾，解剖后取腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃11個組織，將組織轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中，并在液氮中冷凍。冰箱-80 ℃保存，并用于后續(xù)試驗分析。

隨機(jī)選取36尾飼養(yǎng)馴化后的黃鱔[平均體質(zhì)量(50±10) g]，隨機(jī)分為對照組與處理組，每組各18尾。處理組的黃鱔暴露于Cd2+終質(zhì)量濃度為15 mg/L[13]的曝氣自來水中，對照組的黃鱔置于相同條件未添加Cd2+的曝氣自來水中。暴露0、3、6、9、12、24 h后，兩組分別隨機(jī)選取3尾黃鱔進(jìn)行解剖，用Microcontrifuge Tube收集黃鱔肝臟，保存于-80 ℃并用于后續(xù)試驗分析。

使用DNA分離試劑盒從黃鱔組織中分離基因組DNA，使用RNA提取試劑盒從黃鱔組織中提取RNA。提取的RNA使用紫外分光光度計測定濃度和質(zhì)量之后，由HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。

1.2.2 黃鱔Eakr基因cDNA克隆及基因結(jié)構(gòu)的獲得

根據(jù)GenBank 公布的其他物種基因cDNA序列，設(shè)計簡并引物AKR-F和oligod(T)-R引物(表1)，用于黃鱔Eakr基因 cDNA片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10 μL 2×Taq Mix，0.5 μL F上游引物，0.5 μL R下游引物，8 μL ddH2O，1 μL cDNA模板。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳驗證，送交生工生物工程(上海)股份有限公司武漢分公司進(jìn)行測序。為了研究黃鱔Eakr的基因組結(jié)構(gòu)，筆者用表1中的引物對Eakr基因的內(nèi)含子進(jìn)行了擴(kuò)增，引物對I1F/R、I2F/R、I3F/R、I4F/R、I5F/R、I6F/R分別用于擴(kuò)增內(nèi)含子。

表1 引物序列及用途

利用DNAMAN 6.0軟件，根據(jù)所得cDNA片段設(shè)計基因特異性RACE引物AKRGSP5和AKRGSP3，分別用于基因的5′和3′RACE擴(kuò)增；RACE反轉(zhuǎn)錄按照SMARTer?RACE 5′/3′ Kit User Manual(TaKaRa公司)說明書進(jìn)行；Touchdown擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，70 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，5個循環(huán)；94 ℃預(yù)變性1 min，64 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測經(jīng)切膠回收純化后，與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取3個陽性克隆進(jìn)行序列測定。

利用DNAMAN 6.0軟件，將所得cDNA序列與5′和3′末端所得cDNA序列進(jìn)行拼接，得到黃鱔Eakr基因全長cDNA序列；采用基因特異性引物PCR擴(kuò)增各內(nèi)含子序列，克隆測序后，運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件將獲得序列結(jié)果與cDNA序列進(jìn)行拼接與分析，獲得黃鱔基因組DNA。

1.2.3 熒光定量PCR

根據(jù)黃鱔Eakr基因cDNA全長序列，設(shè)計熒光定量引物(表1)。以β-actin基因的表達(dá)作為內(nèi)參。測定保存的腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃11個組織中Eakr基因mRNA相對表達(dá)量，以此分析Eakr基因在黃鱔各組織中的特異性表達(dá)。測定15 mg/L Cd2+處理后，肝臟中Eakr基因與Nrf2基因mRNA相對表達(dá)量的變化趨勢。提取黃鱔各組織總RNA并合成cDNA，以黃鱔各組織cDNA為模板，使用2×SYBR Green PCR Mix試劑(simgen公司)檢測Eakr基因mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)在CFX96TM Real-Time PCR Detection System擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×SYBR Green PCR Mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，57 ℃退火45 s， 40個循環(huán)。采用2-△△Ct法分析Eakr基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 斑點法測定重組菌株的生長活力

使用斑點法分析在不同濃度Cd2+的脅迫下，pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株與pET-28a空質(zhì)粒菌株生長活力與存活率的區(qū)別。將pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株用LB培養(yǎng)基37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至600 mn 光密度約0.6時，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取5個Eppendorf管，各加入1 mL誘導(dǎo)后菌液，同時加入CdCl2，使其終濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)1 h。離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體后，使用1 mL新鮮LB重懸。取5 μL處理后的菌液點在LB平板(含50 μg/mL卡那霉素) 上于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后將平板放入菌落分析儀中拍照并保存。將含pET-28a空質(zhì)粒菌株做以上相同處理，每個處理重復(fù)3次。將上述菌液進(jìn)行100倍的稀釋后，取50 μL均勻涂在含CdCl2(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)的LB平板(含50 μg/mL卡那霉素)上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，使用菌落分析儀計算菌落數(shù)目。將pET-28a空質(zhì)粒菌株在不含CdCl2的平板上生長的菌落數(shù)計為100%，以此為基準(zhǔn)計算不同處理下的菌落數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

基因測序結(jié)果用美國國家生物技術(shù)中心上的BLAST進(jìn)行比對(http: //www．ncbi．nlm．nih．gov．BLAST/)，試驗結(jié)果均記錄為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用SPSS 20軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Origin 7.5 軟件繪制柱狀圖，當(dāng)P<0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eakr基因序列

Eakr基因cDNA全長為4468 bp，包含1026 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼341個氨基酸，5′端非編碼區(qū)長度為74 bp，3′端非編碼區(qū)長度為195 bp。通過比較黃鱔AKR基因的cDNA序列(GenBank序列號KF819395.1)克隆測序后，運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件將獲得序列結(jié)果與cDNA序列進(jìn)行拼接與分析，獲得黃鱔基因組DNA。Eakr基因由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，內(nèi)含子分別為373、841、540、514、112、766 bp(圖1)。

圖1 Eakr基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 Eakr基因組織表達(dá)分析

熒光定量PCR分析Eakr基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Eakr基因在黃鱔各個組織中均有表達(dá)，在腸道、腎臟、肝臟、性腺和胃組織中表達(dá)量相對較高，其中肝臟組織中表達(dá)最高，肌肉中表達(dá)量最低(圖2)。

圖2 Eakr mRNA在黃鱔不同組織中的相對表達(dá)量

2.3 Cd2+脅迫下黃鱔肝臟中Eakr與Nrf2基因的表達(dá)差異分析

使用15 mg/L的CdCl2處理黃鱔，隨后通過熒光定量PCR檢測黃鱔肝臟組織中Eakr與Nrf2基因的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示：CdCl2處理后，Eakr mRNA在各個時間點均有顯著升高(P<0.001)(圖3a)；CdCl2處理后，Nrf2 mRNA表達(dá)水平呈波動趨勢，相比對照組，Nrf2在3 h和24 h表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而在處理后3、6 h和12 h Nrf2 mRNA表達(dá)量達(dá)到極顯著水平(P<0.001)(圖3b)。結(jié)果表明，Cd2+處理會誘導(dǎo)Nrf2基因和其下游Eakr基因的表達(dá)。

圖3 氯化鎘暴露后黃鱔肝臟Eakr基因(a)和Nrf2基因(b)的相對表達(dá)

2.4 Eakr基因?qū)d2+脅迫下大腸桿菌生物活力的影響

使用CdCl2處理Eakr基因重組菌株與pET-28a空質(zhì)粒菌株，用LB平板培養(yǎng)12 h后，分析菌株的生長情況與存活率，以此鑒定Eakr基因在體外是否具有耐脅迫性。結(jié)果顯示，不同濃度Cd2+脅迫下，Eakr基因重組菌株均比空白質(zhì)粒菌株生長旺盛，當(dāng)Cd2+濃度升至2.0 mmol/L時，空白質(zhì)粒菌株已無明顯菌落，但是Eakr基因表達(dá)菌株仍有部分存活(圖4a)。隨著Cd2+濃度的不斷升高，Eakr基因重組菌株和空白質(zhì)粒菌株的存活率均有下降，但是空白質(zhì)粒菌株下降更顯著，且Eakr基因重組菌株存活率均高于空白質(zhì)粒菌株，當(dāng)Cd2+濃度升至1.5 mmol/L和2.0 mmol/L時，Eakr基因重組菌株的存活率顯著高于含空白質(zhì)粒菌株(P<0.001)(圖4b)。結(jié)果表明，Eakr基因的表達(dá)可以在一定程度上提高大腸桿菌的生長活力與存活率。

圖4 Cd2+脅迫下重組黃鱔Eakr對大腸桿菌生長活力與存活率的影響

3 討 論

醛酮還原酶是在醛和酮還原中具有多種功能的依賴還原型輔酶Ⅱ的氧化還原酶，通過還原型輔酶Ⅱ提供還原力，可以將醛酮類化合物通過加氫的方式還原成相對應(yīng)的醇類化合物，從而降低其毒害作用。醛酮還原酶AKR基因作為應(yīng)激反應(yīng)基因，受氧化、親電、滲透脅迫和熱激調(diào)節(jié)[14]，不僅參加機(jī)體防御工作還作為防御酶存在[8]，與機(jī)體抗氧化應(yīng)激相關(guān)。

3.1 Eakr結(jié)構(gòu)分析

目前國內(nèi)外對魚類醛酮還原酶鮮見報道，僅有Hassanin等[15]對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)醛酮還原酶AKR1A1的報道，發(fā)現(xiàn)苯并芘可以誘導(dǎo)羅非魚肝臟中AKR1A1基因的表達(dá)，醛酮還原酶AKR1A1可能對水生生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在的苯并芘具有解毒作用。黃鱔醛酮還原酶擁有(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合域、輔酶結(jié)合域和保守的催化中心。大多數(shù)醛酮還原酶共有催化四分體，由(Asp-Tyr-Lys-His)組成，而黃鱔醛酮還原酶催化四分體由(Asp-Tyr-Ala-His)組成。

3.2 Eakr轉(zhuǎn)錄本表達(dá)特征

醛酮還原酶基因表達(dá)具有組織廣泛性。Macleod等[16]利用Western blot技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AKR基因在小鼠的脾臟、肝臟、腎臟和肺部等組織中均有表達(dá)；Ge等[17]發(fā)現(xiàn)，AKR1B7基因在人精管、腎上腺、眼睛、腸道、肝臟、腎臟和睪丸等組織中均有表達(dá)。在水生動物中，醛酮還原酶基因也在多個組織中表達(dá)。Mochizuki等[18]從皺紋盤鮑(Haliotisdisushannai)肝胰臟中檢測出AKR基因的表達(dá)；在尼羅羅非魚的各個組織中均能檢測到該基因的表達(dá)，并且肝臟中的表達(dá)量最高[15]。筆者采用熒光定量PCR檢測了Eakr基因在黃鱔腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃等11個組織中的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，Eakr基因在黃鱔各個組織中都有表達(dá)，且在肝組織中表達(dá)量最高。由此可見，水產(chǎn)動物中醛酮還原酶基因的表達(dá)規(guī)律為：在各個組織均有表達(dá)，且在肝臟(肝胰臟)中表達(dá)量最高。組織表達(dá)差異性與組織的生物學(xué)功能有關(guān)，肝臟(肝胰臟)是魚類脂肪合成、氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要發(fā)生場所，所以筆者推測，該基因可能參與了肝臟細(xì)胞的發(fā)育過程與解毒抗氧化過程。

3.3 鎘暴露下黃鱔Eakr基因和Nrf2基因的表達(dá)分析

鎘是自然界中主要的應(yīng)激源之一，Cd2+誘導(dǎo)會導(dǎo)致魚類活性氧的產(chǎn)生促使細(xì)胞死亡，為了保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化損傷，細(xì)胞會上調(diào)抗氧化的能力。淡水魚通過鰓和皮膚攝入Cd2+，在血漿中利用蛋白與金屬離子結(jié)合，完成對金屬離子的利用，儲存和排泄后，多余的Cd2+在以肝臟和腎臟為主的器官中聚集，導(dǎo)致脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙等產(chǎn)生。在鯉(Cyprinuscarpio)抗氧化應(yīng)激過程的研究中發(fā)現(xiàn)，Cd2+暴露會導(dǎo)致鯉脾臟免疫受到抑制，產(chǎn)生氧化應(yīng)激[19]，誘導(dǎo)肝臟和肝細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生。為了應(yīng)對非生物脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷，生物機(jī)體通常會提高細(xì)胞體內(nèi)醛酮還原酶的活性，以減輕氧化損傷。曾有研究表明，AKR7A在對乙酰氨基酚/對苯二酚亞胺暴露后顯著上調(diào)，從而顯著提高抵御乙酰氨基酚/對苯二酚亞胺誘導(dǎo)的肝毒性的能力[20]。目前，Cd2+暴露下對AKR基因表達(dá)影響的研究較少，但是在其他非生物因子脅迫下，AKR相關(guān)基因的表達(dá)情況有相應(yīng)的報道。如：在厭氧脅迫下誘發(fā)AKR11B基因表達(dá)；在高滲透壓、過氧化氫脅迫下誘發(fā)AKR2B6基因表達(dá)等[21]。有學(xué)者自注射苯并芘的尼羅羅非魚中檢測到了AKR1A1基因的cDNA，并發(fā)現(xiàn)膽汁和肝臟中AKR1A1基因的mRNA表達(dá)量最高，這表明暴露于苯并芘中會誘導(dǎo)羅非魚中醛酮還原酶相關(guān)基因的表達(dá)[15]；Agrawal等[22]研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫導(dǎo)致魚腥藻(Anabaenasp．)的AKR17A1基因表達(dá)量升高，分析發(fā)現(xiàn)，醛酮還原酶可以對鎘脅迫產(chǎn)生的活性羰基物質(zhì)進(jìn)行解毒來提供耐應(yīng)力性。

越來越多的研究顯示，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激條件下，Keap-1-Nrf2-ARE信號通路被激活，來調(diào)節(jié)多種抗氧化蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減輕細(xì)胞所受損害[23]。Matsunaga等[24]研究證實，AKR1C1和AKR1C3通過Keap-1-Nrf2-ARE信號通路進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，醛酮還原酶作為Nrf2的下游信號因子，受到Nrf2的調(diào)控。結(jié)合上述熒光定量PCR結(jié)果推測，Eakr基因參與黃鱔應(yīng)對Cd2+脅迫導(dǎo)致的活性氧代謝過程，也表明Keap-1-Nrf2-ARE信號通路可能參與黃鱔醛酮還原酶表達(dá)調(diào)控過程。本試驗中熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，暴露于Cd2+的黃鱔各組織中的Eakr基因與Nrf2基因的表達(dá)量顯著高于對照組，表明Nrf2和醛酮還原酶等被Cd2+誘導(dǎo)產(chǎn)生，Cd2+處理會誘導(dǎo)Eakr基因和Nrf2基因的表達(dá)，可能是由于Cd2+誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而開啟Nrf2-Keap1抗氧化信號通路，導(dǎo)致Nrf2基因及其下游Eakr基因的表達(dá)。

3.4 Cd2+脅迫下Eakr基因?qū)Υ竽c桿菌生物活力的影響分析

闞延澤等[12]發(fā)現(xiàn)，Eakr基因重組菌株生長活力明顯高于陰性對照菌株；AKR17A1基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)會使菌體在非生物因子如高溫、紫外線B和鎘的脅迫下表現(xiàn)出更好的生長態(tài)勢[25]；野生大麥表達(dá)外源基因擬南芥AKR4C9的過程中，顯著提高了對鉻和鹽脅迫的耐受性[26]；醛酮還原酶ALDRXV4基因的表達(dá)同樣增強(qiáng)了大腸桿菌對鹽和重金屬等的耐受性。筆者用斑點法測定pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株(Eakr基因重組菌株)與pET-28a空質(zhì)粒菌株(空白質(zhì)粒菌株)的存活率，結(jié)果顯示，隨著Cd2+濃度的提高，Eakr基因重組菌株與空白質(zhì)粒菌株的存活率均有降低，但同等條件下Eakr基因重組菌株的存活率始終高于空白質(zhì)粒菌株。試驗結(jié)果表明，黃鱔醛酮還原酶可以在體外對細(xì)胞起到保護(hù)作用，以減少重金屬對細(xì)胞的毒害作用，增強(qiáng)在非生物脅迫下的耐受性。

4 結(jié) 論

綜上所述，筆者克隆了黃鱔醛酮還原酶(Eakr)基因并闡明了其結(jié)構(gòu)，熒光定量PCR技術(shù)檢測到Eakr基因在黃鱔的腦、血細(xì)胞、心臟、腸道、腎臟、肝臟、肌肉、性腺、皮膚、脾臟、胃中表達(dá)，且肝臟表達(dá)水平最高；Cd2+誘導(dǎo)下Eakr基因表達(dá)水平上升，且Nrf2基因表達(dá)水平也顯著提高。研究結(jié)果顯示，重組大腸桿菌生長活力在同等生長環(huán)境下明顯高于對照組，表明Eakr基因可對抗因Cd2+誘導(dǎo)而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。研究結(jié)果可為黃鱔應(yīng)對環(huán)境脅迫及重金屬毒理學(xué)研究提供重要參考。