高麗娜 董 燕 劉小玲 何曉春 張玉芳 張 莉 孫 俊 劉小暉

(甘肅省婦幼保健院產(chǎn)二科，甘肅省蘭州市 730050)

子癇前期是一種妊娠期常見的多系統(tǒng)功能紊亂疾病，占所有妊娠并發(fā)癥的5%～7%，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一[1]。目前普遍認(rèn)為子癇前期的發(fā)病機制是胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移不足，子宮螺旋動脈重構(gòu)受阻，胎盤缺血缺氧，導(dǎo)致炎性因子釋放到母體血液中，從而引起一系列臨床癥狀[2-3]。研究證實，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6是引起子癇前期患者全身血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和加重母體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[4]。研究表明，脂多糖可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)，參與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展[5-6]，但其具體機制尚不完全清楚。近年來有研究顯示，人體血清微量元素鋅參與機體多種物質(zhì)的合成和代謝，鋅代謝紊亂可引起機體免疫系統(tǒng)功能障礙及血管內(nèi)皮炎癥損傷，從而誘發(fā)子癇前期[7]。本研究通過探討子癇前期孕婦血清鋅水平與臨床指標(biāo)、炎癥指標(biāo)(TNF-α和IL-6)之間的相關(guān)性，同時采用脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)模擬子癇前期內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，探討鋅對HUVEC炎癥反應(yīng)的改善作用，為子癇前期的診斷和防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年10月在甘肅省婦幼保健院住院的105例子癇前期孕婦為子癇前期組，納入標(biāo)準(zhǔn)：符合子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選擇同期住院的100例健康孕婦作為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：因胎位不正 、瘢痕子宮、高齡、社會因素等原因行剖宮產(chǎn)。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并原發(fā)性腎臟疾病、糖尿病、甲狀腺疾病、高血壓病的患者；(2)雙胎或多胎妊娠；(3)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長受限、胎盤早剝、血栓形成等患者。子癇前期組孕婦年齡18～40(30.59±5.01)歲，入組時孕周32～40(36.93±2.76)周，身高153.0～170.5(165.20±5.19)cm，入組時體重62.5～85.5(76.70±8.67)kg。對照組孕婦年齡22～38(29.50±2.56)歲，入組時孕周36～40(37.50±1.16)周，身高150.5～168.5(164.20±5.45)cm，入組時體重55.3～80.3(69.70±7.16)kg。兩組孕婦的年齡、孕周、身高差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。所有孕婦均簽署知情同意書，本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)(2022GSFY倫審[21]號)。

1.2 主要試劑與材料 HUVEC(上海雅吉生物科技有限公司)；ZnSO4(Sigma Aldrich Lab & Production Materials公司，批號：M2643-500G)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：CA1210)；胎牛血清(Gibco公司，批號：26140079)，RPMI-1640高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：C11965500BT)；脂多糖(Sigma Aldrich Lab & Production Materials公司，批號：017M4112V)；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶消化液、總蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號：C0222、C0204、P0010S)；TNF-α兔抗人一抗[艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司，批號：PY19810]； IL-6兔抗人一抗[艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司，批號：PY6087]；β-actin(Santa Cruz公司，批號：sc-47778HRP)；GAPDH(沈陽萬類生物科技有限公司，批號：WL01114)；總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號：DP430]；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR037A、RR420A)；TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司，批號：300-01BH、AF-200-06)；引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 研究方法

1.3.1 檢測兩組孕婦血清鋅和炎癥因子水平：采集兩組孕婦入院時空腹肘靜脈血5 mL，靜置30 min后，以3 500 r/min離心5 min(離心溫度4 ℃)，吸取上層血清冷凍保存。取適量血清樣本用去離子水稀釋2倍后，置于原子吸收分光光度計(北京中興百匯科技有限公司，型號：BH2100T)上，采用原子吸收光譜法測定血清鋅水平。另取適量血清采用ELISA檢測TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 收集子癇前期組孕婦的臨床指標(biāo)及新生兒出生體重：收集子癇前期組孕婦入院時的血壓，測量前囑孕婦休息5 min并且排空膀胱，用水銀血壓計測量血壓兩次，取兩次讀數(shù)的平均值并記錄。收集子癇前期組孕婦入院后留取的24 h尿液作為尿蛋白檢測標(biāo)本，采取免疫比濁法檢測24 h尿蛋白。記錄子癇前期組新生兒的出生體重。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)：將HUVEC接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，待細(xì)胞密度達(dá)85%～90%時用0.25%胰蛋白酶消化后吹打細(xì)胞，將細(xì)胞接種至96孔板，待細(xì)胞融合至70%～80%進行后續(xù)實驗。

1.3.4 ZnSO4最佳干預(yù)濃度的篩選：將生長對數(shù)期的HUVEC以100 μL/孔接種至96孔板中，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時，分別加入不同濃度ZnSO4(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)處理24 h，然后每孔加入 10 μL CCK-8試劑，放至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共同孵育4 h，取出培養(yǎng)板，置于酶標(biāo)儀(北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司，型號：Epoch)上檢測各孔在波長490 nm處的吸光度值，以空白組(不加任何試劑)作為參照，計算存活率(%)=各組干預(yù)后24 h吸光度值/空白組干預(yù)前的吸光度值×100%。隨后在空白組及各個不同ZnSO4濃度組中加入100 ng/mL脂多糖，刺激12 h后再次檢測細(xì)胞在波長490 nm處的吸光度值， 以空白組作為參照，計算存活率(%)=各組干預(yù)后24 h吸光度值/空白組干預(yù)前吸光度值×100%。上述實驗均重復(fù)3次。

1.3.5 ZnSO4對脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC炎癥反應(yīng)的干預(yù)：對照組(無任何處理)、ZnSO4組(100 μmol/L ZnSO4處理24 h)、脂多糖組(100 ng/ mL脂多糖刺激12 h)、脂多糖+ZnSO4組(100 μmol/L ZnSO4處理24 h后再用100 ng/mL脂多糖刺激12 h)。細(xì)胞接受不同的刺激處理后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備后續(xù)實時熒光定量PCR檢測和Western blot檢測。各組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測各組HUVEC中TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平：按照總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(SimpliNano公司)分析RNA純度及濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(共20 μL)包括TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、RNase Free ddH2O 6.4 μL、cDNA 2 μL。IL-6上游引物為5′-ACTTCACAGAGGATACCAC-3′，下游引物為5′-GCATCATCGCTGTTCATAC-3′；TNF-α上游引物為5′-GGACTAGCCAGGAGGGAGAACAG-3′，下游引物為5′-GCCAGTGAGTGAAAGGGACAGAA-3′；GAPDH上游引物為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物為5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s、57 ℃退火34 s，擴增40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算TNF-α、IL-6 mRNA相對表達(dá)水平。上述實驗重復(fù)3次。

1.3.7 Western blot測定各組HUVEC中TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平：提取各組細(xì)胞的總蛋白，取30 μg蛋白樣品于12%分離膠和4%濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳；將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；用5%脫脂牛奶封閉2 h后，PBST洗滌3次，10 min/次；加入TNF-α、IL-6相應(yīng)一抗各10 μL(稀釋比均為1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次，10 min/次；加入10 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶5 000)，室溫孵育2 h；PBST洗滌3次，10 min/次。使用ECL發(fā)光顯色，以GAPDH為內(nèi)參(稀釋比為1 ∶5 000)，應(yīng)用Image Lab軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用Pearson檢驗分析指標(biāo)間的相關(guān)性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕婦血清鋅、TNF-α和IL-6水平的比較 子癇前期組孕婦血清鋅水平低于對照組，血清TNF-α和IL-6水平均高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組孕婦血清鋅、TNF-α和IL-6水平的比較(x±s)

2.2 子癇前期孕婦血清鋅水平與臨床指標(biāo)、炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析 子癇前期孕婦血清鋅水平與收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白水平和血清TNF-α、IL-6水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.374，P<0.001；r=-0.380，P<0.001；r=-0.396，P<0.001；r=-0.667，P<0.001；r=-0.723，P<0.001)，與新生兒出生體重呈正相關(guān)(r=0.292，P<0.001)。

2.3 不同濃度ZnSO4對 HUVEC存活率的影響 HUVEC存活率有隨ZnSO4濃度升高而降低的趨勢，與空白組比較，100 μmol/L ZnSO4組、150 μmol/L ZnSO4組和200 μmol/L ZnSO4組的存活率均降低(均P<0.05)，見表2。經(jīng)脂多糖刺激后HUVEC存活率均降低(均P<0.05)，其中在ZnSO4濃度為100 μmol/L時HUVEC的存活率最高(均P<0.05)，為干預(yù)細(xì)胞的最佳濃度，故選用100 μmol/L ZnSO4濃度進行后續(xù)實驗，見表3。

表2 不同濃度ZnSO4對HUVEC存活率的影響(x±s，%)

表3 不同濃度ZnSO4對脂多糖處理后的HUVEC存活率的影響(x±s，%)

2.4 ZnSO4對脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC炎癥反應(yīng)的影響 ZnSO4組TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；脂多糖組 TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組(均P<0.05)； 脂多糖+ZnSO4組TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于脂多糖組(均P<0.05)。見表4。

表4 4組HUVEC中TNF-α、IL-6的mRNA和蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

近年來，子癇前期的發(fā)生率和病死率不斷上升[9]，嚴(yán)重影響孕婦的生命健康及胎兒的生長發(fā)育，其發(fā)病機制至今仍未完全明確，因此尋找子癇前期的有效防治策略仍是世界性難題。子癇前期發(fā)病機制涉及多方面因素，包括血管內(nèi)皮功能障礙、過度炎性反應(yīng)、胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移不足、母胎免疫耐受異常等[8]。其中血管內(nèi)皮功能障礙及過度炎性反應(yīng)是引起子癇前期相關(guān)臨床表現(xiàn)的重要因素。在正常妊娠過程中，孕婦處于輕微持續(xù)炎癥狀態(tài)，而子癇前期孕婦體內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平明顯升高，抗炎細(xì)胞因子水平明顯下降，導(dǎo)致孕婦體內(nèi)出現(xiàn)過度的全身炎癥反應(yīng)[9]。研究證實，TNF-α和IL-6在子癇前期患者血清及胎盤組織中均呈高表達(dá)[10]。在胎盤形成時期，異常增高的TNF-α破壞胎盤結(jié)構(gòu)的發(fā)育，打破母體循環(huán)中血管舒張因子和血管收縮因子的平衡，而IL-6阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移，使子宮螺旋動脈重塑失敗，減少母體血管舒張因子的釋放[11]；在妊娠中晚期，TNF-α和IL-6共同影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)等血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使孕婦血壓進一步增高，加重腎臟功能損害[12]。有學(xué)者在腎素-血管緊張素系統(tǒng)障礙所誘發(fā)的子癇前期小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了TNF-α和IL-6異常增高[13]。在子癇前期患者的血管內(nèi)皮中，TNF-α和IL-6可以激活內(nèi)皮細(xì)胞以產(chǎn)生黏附分子，并上調(diào)血管收縮因子內(nèi)皮素-1水平，從而引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致全身血管內(nèi)皮功能障礙[14]。同時，TNF-α可破壞其他促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的平衡[15]，使子癇前期患者的病情進一步加重[16]。本研究結(jié)果顯示，子癇前期孕婦血清TNF-α和IL-6水平均高于正常孕婦(均P<0.05)，說明炎癥反應(yīng)在子癇前期的發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。炎性反應(yīng)被過度激活的過程受到多種因素的影響，尤其是微量元素[17]。近年來有研究顯示，微量元素是維持機體正常免疫應(yīng)答、免疫監(jiān)測和免疫自穩(wěn)的重要因素之一[18-19]。脂多糖可引起血管內(nèi)皮功能障礙[6]，可模擬子癇前期出現(xiàn)的血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)[5]，因此，本研究采用脂多糖誘導(dǎo)HUVEC炎癥反應(yīng)，探究鋅對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

鋅是妊娠期必需的微量營養(yǎng)素，其參與胎盤及胎兒的發(fā)育[20]，同時也是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞功能及免疫調(diào)節(jié)的必需元素[21]。鋅在體內(nèi)的代謝處于動態(tài)平衡，其代謝紊亂可引起機體免疫功能障礙，引發(fā)一系列與免疫損傷有關(guān)的癥狀[22]。子癇前期也是一種免疫炎性疾病， 鋅代謝失衡可能增加子癇前期易患性，并對子癇前期的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生一定影響[23]。Wibowo等[24]的研究顯示，與正常孕婦相比，妊娠期高血壓患者血清鋅水平明顯降低。本研究結(jié)果顯示，子癇前期孕婦血清鋅水平低于正常孕婦(P<0.05)，與上述研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦血清鋅水平與收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，與新生兒出生體重呈正相關(guān)(均P<0.05)，因此推測鋅可能參與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展，同時也參與胎兒生長發(fā)育的調(diào)控。鋅在體內(nèi)參與多種酶和活性因子的組成，可以直接促進蛋白質(zhì)之間的相互作用，并可調(diào)節(jié)基因表達(dá)和免疫炎性反應(yīng)等[25]。鋅是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，隨著細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，鋅的濃度也隨之發(fā)生改變，同時鋅也能改變細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)[26]。因此，鋅對于維持細(xì)胞正常生理活動及功能有著極其重要的作用。缺鋅可引起免疫缺陷，增加炎性因子的釋放，如IL-6、IL-1β及TNF-α等[27]。本研究結(jié)果顯示，子癇前期患者血清鋅水平與TNF-α、IL-6水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，提示鋅可能是子癇前期患者機體免疫炎性反應(yīng)被過度激活的重要信號因子。本研究采用ZnSO4處理 HUVEC 24 h 后再用脂多糖刺激12 h，結(jié)果顯示，脂多糖+ZnSO4組TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于脂多糖組(均P<0.05)，表明鋅可以下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC炎性因子表達(dá)水平，對HUVEC有一定保護作用，從而抑制子癇前期炎性反應(yīng)。

綜上所述，子癇前期患者血清鋅水平與臨床指標(biāo)、炎癥指標(biāo)存在相關(guān)性，鋅可減輕脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC炎癥反應(yīng)，鋅可能參與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。因此，對于子癇前期高危人群，動態(tài)監(jiān)測妊娠期間血清鋅水平，并指導(dǎo)孕婦合理攝入含鋅食物，對于預(yù)防子癇前期的發(fā)生具有重要的臨床意義。