范振軍 張文婷 張 麗 張俊愛 趙祖國 徐軍發(fā)

（廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)研究所，東莞 523808）

B7-H4的mRNA在正常細(xì)胞中廣泛存在，但在正常細(xì)胞表面上的表達(dá)被限制［3］。B7-H4通過抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞周期，負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫逃逸［4-7］。B7-H4在腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病中異常表達(dá)。B7-H4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著極其重要的作用，包括細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡等［8-12］。B7-H4蛋白廣泛表達(dá)腎細(xì)胞癌、尿路上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、肺小細(xì)胞癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌，且與腫瘤大小、癌癥分期、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展、疾病預(yù)后不良、存活率降低和/或T細(xì)胞浸潤減少相關(guān)［13-21］。此外，B7-H4還具有很多其他免疫學(xué)功能，在保護(hù)ConA誘導(dǎo)的肝免疫損傷、維持母體對胎兒的免疫耐受、抗1型糖尿?。═1D）和胰島β細(xì)胞移植等方面均扮演重要角色［22-24］。

本研究采用人恒定區(qū)與鼠單抗可變區(qū)嵌合，獲得人鼠嵌合的人源化單抗，并研究單抗的結(jié)合活性，體外阻斷B7-H4抑制T細(xì)胞增殖的作用，以及應(yīng)用肽合成對抗體進(jìn)行表位分析，確定了抗體的大致結(jié)合表位，探討單抗發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機制，為抗體藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑1640培養(yǎng)基、胎牛血清、F12培養(yǎng) 基（Gibco）；LipofectamineTM3000、Trizol（Invitro‐gen）；HRP-羊抗鼠、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗人、Pro‐teinA/G（索萊寶）；重組人B7-H4、重組人B7-H4 Fc融合蛋白（義翹神州）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真Taq酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶（TaKaRa）；CD3+T細(xì)胞磁珠分離試劑盒（Easysep）；抗CD3、抗CD28（Biogem）；人淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋）；CCK-8試劑盒（日本株式會社）；兔抗B7-H4多抗（Santa Cruz）；CM5芯片（BIACORE）。

1.1.2 細(xì)胞株及質(zhì)粒pMD19-T質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DE3大腸桿菌（TaKaRa）；pET30a（+）質(zhì)粒（Novagen）；pFUSE2-CLIg-hk質(zhì)粒、pFUSE-CHIg-hG1質(zhì)粒（InvivoGen）；CHO-K1細(xì)胞系（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 抗體可變區(qū)基因擴增 復(fù)蘇保存的抗人B7-H4雜交瘤細(xì)胞株21E7，收集1×107個細(xì)胞，加入1 ml Trizol裂解液提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對抗體重鏈、輕鏈信號肽和FR4框架區(qū)分別設(shè)計特異性引物（表1），PCR擴增可變區(qū)基因，并回收試劑盒收集目的片段。將重、輕鏈片段分別連接在pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在X-gal瓊脂平板上。次日挑選白斑菌落，進(jìn)行PCR驗證。菌落PCR驗證正確的菌落送生工測序。將測序序列在Signal5.0進(jìn)行信號肽分析，在IMGT網(wǎng)站進(jìn)行抗體基因比對。

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表1 可變區(qū)擴增引物Tab.1 Variable region amplification primer

1.2.2 構(gòu)建嵌合表達(dá)載體 根據(jù)目的基因的序列，結(jié)合載體上下游酶切位點，設(shè)計擴增目的基因的正向、反向引物（表2），并引入相應(yīng)的酶切位點序列。引物由上海生工合成。重鏈質(zhì)粒與目的基因和輕鏈質(zhì)粒與目的基因分別進(jìn)行雙酶切并回收酶切片段，T4連接酶16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5α，挑選單個菌落進(jìn)行菌落PCR，將菌落PCR驗證正確的單菌落，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證。

表2 二次PCR擴增引物Tab.2 Secondary PCR amplification primer

1.2.3 轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞株，篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株并評估不同傳代次數(shù)分泌抗體能力 轉(zhuǎn)染前1 d將CHO細(xì)胞接種于6孔板，在含10%FBS、1%雙抗的F12培養(yǎng)基，37℃、5%CO2下培養(yǎng)。待細(xì)胞80%融合，加入2μg重鏈質(zhì)粒和3 μg輕鏈質(zhì)粒，加入LipofectamineTM3000 Transfection Reagent共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞系，48 h后 更 換 培 養(yǎng) 基，加 入5 μg/ml Blasticidin和200 μg/ml Zeocin維持21 d篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過抗生素篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，48 h收集上清，更換培養(yǎng)基。收集原代、第三代、第五代、第七代、第十代上清，將其稀釋50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1 600倍，檢測不同代數(shù)OD值變化。

1.2.4 人源化嵌合單抗純度鑒定 大量收集培養(yǎng)上清，12 000 r/min、4℃離心10 min，棄沉淀，采用0.45μm濾膜過濾除去細(xì)胞雜質(zhì)。上清通過Protein A/G親和層析柱收集洗脫液。取收集產(chǎn)物小樣用于SDS-PAGE檢測純化抗體純度，其余在PBS緩沖液中4℃透析過夜，凍干濃縮，復(fù)溶，BCA檢測濃度。

1.2.5 間接ELISA檢測人源化嵌合單抗與B7-H4的結(jié)合活性 使用包被液將人B7-H4抗原稀釋至0.5 μg/ml，每孔100 μl加至酶標(biāo)板，4℃包被過夜。除去包被液，PBST洗滌3次，每次3 min，加入200μl 5%BSA，37℃封閉2 h。除去封閉液，洗滌同上。用PBST稀釋人源化單抗CH7和鼠源單抗21E7，濃度依次為1 000、500、250、125、62.5、31.25、20.833、

13.889 、9.259、6.173、4.115、2.743、1.829、1.219、0.813、0.542 ng/ml，分別取100 μl加入酶標(biāo)板中，37℃孵育1 h。除去一抗，洗滌同上。人源化單抗組加入100 μl羊抗人IgG二抗稀釋液，鼠源單抗組加入100μl羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1 h。除去二抗，洗滌同上，每孔加入100μl TMB顯色底物，避光10 min，加入50 μl終止液，立即在酶標(biāo)儀中測定450 nm處吸光值（OD）。

1.2.6 離子表面共振（SPR）檢測單抗與B7-H4的親和力 將人B7-H4重組蛋白，偶聯(lián)在anti-His anti‐body的CM5芯片上，在PBS-P+緩沖液中的傳感器表面捕獲抗體。使用連續(xù)稀釋濃度（250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 nmol/ml）測試抗體。結(jié)合階段的流動持續(xù)時間為120 s，結(jié)合60 s，解離持續(xù)時間為300 s，Gly1.5再生30 s。使用BIAcore評估軟件計算結(jié)合率（Ka）、解離率（Kd）和親和力常數(shù)（KD）。

1.2.7 人源化單抗體外阻斷B7-H4抑制T細(xì)胞增殖 從健康志愿者外周血分離出PBMCs，用CD3陽性分磁珠分選出T細(xì)胞，接種1×105個細(xì)胞到預(yù)先包被激發(fā)型抗CD3（5 μg/ml）和抗CD28（2 μg/ml）的96孔板中，分別加入人B7H4-FC融合蛋白（5μg/ml）、人源化單抗（10μg/ml）或兩者混合物。每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后加入CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況。

1.2.8 抗原表達(dá)及肽段合成 將B7-H4胞外功能域的IgV（29~154）和IgC（155~258）兩個肽段分別構(gòu)建pET30a-IgV和pET30a-IgC原核表達(dá)載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DE3大腸桿菌，37℃搖菌，當(dāng)OD值達(dá)到0.6時，不加或加入1 mmol/ml的IPGT誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。4℃、10 000 r/min，離心15 min，收集菌體。超聲破碎細(xì)菌，10 000 r/min，20 min，4℃離心，分別收集上清與沉淀。配置12.5%的分離膠，取15 μl上樣，分別與抗His抗體和人源化單抗CH7 4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入TMB顯影劑，于曝光儀曝光。將IgC域分成4個肽段，S1（159~178 aa：YNASSETLRCEAPRWFPQPT）、S2（182~207 aa：ASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVT）、S3（211~227 aa：VSVLYNVTINNTYSCMI）、S4（233~253 aa：KATGDIKVTESEIKRRSHLQL），交由上海吉爾生化合成肽段，用肽段包被酶標(biāo)板，分別加入人源化嵌合單抗和兔多抗檢測。

1.2.9 三維建模及分子對接 從UniProt數(shù)據(jù)庫中下載AlphaFold預(yù)測B7-H4的三維結(jié)構(gòu)。使用Ro‐setta軟件對抗體可變區(qū)開始進(jìn)行建模，使用Pro‐check對三維模型進(jìn)行評估。使用Discovery Studio軟件中的ZDOCK程序?qū)乖贵w進(jìn)行對接，以相互作用主要在抗原233~253aa且打分最靠前的POSE作為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤可變區(qū)基因擴增及序列分析 從雜交瘤21E7中擴增出了重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，片段大小400 bp左右（圖1A）。目的基因與T載體連接，分別構(gòu)建了T-VH重鏈可變區(qū)T載體和T-VL輕鏈可變區(qū)T載體。單菌落PCR擴增出了一致大小的片段（圖1B、C）。如圖2A、B所示，重鏈基因前面57個堿基為信號肽，編碼19個氨基酸；輕鏈基因前面50個堿基為信號肽，編碼20個氨基酸。重鏈可變區(qū)全長354個堿基，功能性重鏈V基因?qū)儆谑驣GHV1-54*03（F）家族，匹配率為97.22%，J基因?qū)儆谑驣GHJ3*01F家族，D基因?qū)儆谑驣GHD2-4*01F家族。輕鏈可變區(qū)全長336個堿基。功能性輕鏈V基因?qū)儆谑驣GKV8-21*01（F）家族，匹配率為97.31%，J基因?qū)儆谑驣GKJ5*01F家族（圖2C）。

圖1 雜交瘤可變區(qū)基因擴增Fig.1 Amplification of variable region gene from hybridoma

圖2 抗體可變區(qū)序列分析Fig.2 Sequence analysis of variable region of antibody

2.2 嵌合表達(dá)載體的構(gòu)建pFUSE-CHIg-hG1質(zhì)粒帶有人IgG1恒定區(qū)，而pFUSE-CLIg-hk質(zhì)粒帶有人κ鏈恒定區(qū)，與相應(yīng)的抗體可變區(qū)基因連接，構(gòu)建了表達(dá)人鼠嵌合重鏈的載體pFUSE-mVH-hCH，表達(dá)人鼠嵌合輕鏈的載體pFUSE-mvl-hCL。菌落PC（圖3A）、酶切實驗（圖3B），均證實片段大小與擴增片段大小一致，證明人鼠嵌合表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 嵌合表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.3 Construction of chimeric expression vectors

2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)株不同傳代次數(shù)分泌抗體的能力評價利用載體上的抗性基因Blasticidin和Zeocin篩選出穩(wěn)定表達(dá)抗人B7-H4人鼠嵌合抗體的細(xì)胞株并命名為CH7。傳代培養(yǎng)10次后，培養(yǎng)上清效價無顯著性差異（圖4），說明穩(wěn)轉(zhuǎn)株能穩(wěn)定分泌抗體，隨著傳代次數(shù)增加其分泌抗體的能力未發(fā)生改變。

圖4 穩(wěn)轉(zhuǎn)株不同傳代次數(shù)分泌抗體的能力Fig.4 Ability of stable strain to secrete antibody at different times of passage

2.4 人源化單抗純度鑒定及BCA測定濃度 使用SDS-PAGE對抗體的純度鑒定結(jié)果可以看出人源化抗體在SDS-PAGE膠上分成兩條清楚的條帶，分子量分別在50 kD和25 kD附近，并沒有明顯的雜帶（圖5），說明成功得到了純化抗體，且抗體純度和完整性良好。凍干復(fù)溶后，BCA法測得人源化單抗?jié)舛葹?.82 mg/ml。

圖5 SDS-PAGE鑒定純化后抗體純度Fig.5 Purity of purified antibody was determined by SDS-PAGE

2.5 嵌合單抗與人B7-H4的結(jié)合活性 間接ELISA測定嵌合單抗CH7與B7-H4的結(jié)合活性（圖6）。表明使用ELISA測定人源化單抗CH7與鼠源單抗21E7的效價，嵌合單抗在稀釋到9.259 ng/ml時，OD>1，效價為1.97×105左右，與鼠源親本效價相差不大。SRP結(jié)果顯示，嵌合單抗親和力為3.72×10?9kD，鼠抗為1.52×10?9kD，嵌合單抗具有很好的結(jié)合活性（圖7）。ELISA和SPR的結(jié)果均表明嵌合單抗可以與人B7-H4進(jìn)行很好地結(jié)合，且保留了鼠源親本單抗的大部分活性。

圖6 ELISA檢測單抗效價Fig.6 Detection of titer of monoclonal antibody by ELISA

圖7 SPR測定單抗的親和力Fig.7 SPR assays affinity of monoclonal antibodies

2.6 嵌合單抗體外阻斷B7-H4抑制T細(xì)胞增殖如圖8所示，人外周血T細(xì)胞在激發(fā)型單抗CD3和CD28體外激發(fā)培養(yǎng)體系中加入B7-H4 Fc融合蛋白后，明顯抑制了T細(xì)胞體外增殖作用（P<0.01）；加入嵌合單抗后顯著逆轉(zhuǎn)了B7-H4介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)（P<0.05），說明嵌合單抗在體外具有一定阻斷B7-H4對T細(xì)胞增殖抑制的作用。

圖8 T細(xì)胞增殖抑制實驗Fig.8 T cell proliferation inhibition assay

2.7 嵌合單抗體表位驗證 實驗證明嵌合單抗可以用于Western blot（圖9A），因此，為了進(jìn)一步弄清楚單抗在阻斷B7-H4抑制T細(xì)胞增殖的作用分子機制，分別表達(dá)了包含人B7-H4的胞外V結(jié)構(gòu)域（29154 aa）和包含胞外C結(jié)構(gòu)域（155~258 aa）的蛋白（圖9B）。pET30a載體上帶有His標(biāo)簽，用抗His抗體孵育表達(dá)產(chǎn)物，證實成功表達(dá)了這兩段抗原，且是在包涵體中表達(dá)（圖9C）。用嵌合單抗孵育抗原發(fā)現(xiàn)，只有胞外C結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)條帶，說明單抗結(jié)合位點在胞外C結(jié)構(gòu)域中（圖9D）。將胞外C結(jié)構(gòu)域分成四段肽，合成肽并用于包被酶標(biāo)板，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)S1、S2、S4均能與商品化兔多抗結(jié)合，而S3不能結(jié)合。嵌合單抗只與S4結(jié)合，證明單抗結(jié)合表位在S4中（圖9E）。

圖9 抗體表位分析Fig.9 Antibody epitope analysis

2.8 生物信息學(xué)建模 抗體建模通過Rosetta從頭開始建模，Ramachandran plot表明在允許區(qū)域內(nèi)占99%，因此模型較理想?？贵w可變區(qū)模型表明可變區(qū)得CDR區(qū)具有β折疊片層和環(huán)結(jié)構(gòu)，所有CDR區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)由大量的疏水性氨基酸組成，重鏈和輕鏈之間的CDR區(qū)域形成疏水性空腔。從UniProt數(shù)據(jù)庫下載AlphaFold預(yù)測B7-H4的結(jié)構(gòu)，使用Dis‐covery Studio軟件中的ZDOCK程序?qū)乖贵w進(jìn)行對接。對接顯示，輕鏈CDR2環(huán)上Ser-58L2與Arg-247，Arg-60L2與Arg-247，Arg-60L2與Ser-249形成了氫鍵；重鏈CD3環(huán)上的Asp-101H3與Met-235，Tyr-102H3與PRO-236形成了氫鍵。同時存在大量疏水性氨基酸（Leu-33H1、Ile-34H1、Val-50H2、

Ile-51H2、Pro-53H2、Phe-105H3、Ala-106H3、Leu-29L1、Ala-40L1、Trp-56L2、Val-57L2、Leu-100L3）形成疏水性凹槽，推動B7-H4分子與之緊密結(jié)合。對接結(jié)果表明，抗原與抗體的相互作用依賴于氫鍵和疏水作用，見附圖1（www.immune99.com）。

3 討論

免疫檢查點阻斷是激活抗腫瘤免疫的有效策略之一，近年來PD-1/PD-L1免疫療法在多種惡性腫瘤的治療中取得了顯著成效，并獲得2018年諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎［25］。但仍存在部分患者治療無效以及不良事件，其治療效果及治療安全性仍需進(jìn)一步探討［26-27］。B7-H4是一種免疫檢查點配體，表達(dá)于腫瘤和APCs表面，抑制T細(xì)胞活化和增殖，在抗腫瘤免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用［3］。B7-H4信號被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞介導(dǎo)殺傷的重要機制。因此，靶向腫瘤相關(guān)的B7-H4可能為增強抗腫瘤反應(yīng)提供一種新的治療策略。FPA150是首個具有增強ADCC效應(yīng)的B7-H4阻斷抗體，目前正在進(jìn)行的臨床試驗已證明其良好安全性［28］。

本實驗室多年來關(guān)注B7-H4靶點研究，制備了高親和力的鼠單抗。為降低抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)，本研究采用人IgG1恒定區(qū)取代了鼠恒定區(qū)。IgG1靶向于腫瘤細(xì)胞，具有更強的CDC和ADCC效應(yīng)，穩(wěn)定性更好。利用輕鏈和重鏈的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染了CHO-K1細(xì)胞系，經(jīng)過抗生素篩選，獲得了能穩(wěn)定表達(dá)抗B7-H4人源化單克隆抗體的CHO細(xì)胞株。間接ELISA和SPR證實了嵌合抗體具有很高的結(jié)合活性，保留了鼠源親本絕大部分活性。B7-H4-Ig抑制了T細(xì)胞的增殖，而當(dāng)加入人源化嵌合抗體CH7時，這種抑制作用被抵消了。人源化嵌合抗體CH7通過阻斷B7-H4促進(jìn)了T細(xì)胞的活化與增殖，顯示出用于腫瘤治療的潛力。本課題分段表達(dá)了抗原，確定抗體與IgC域結(jié)合，之后把IgC域分成了四段多肽，ELISA結(jié)果確定抗體與233~253 aa發(fā)生作用，因而可以更精準(zhǔn)地模擬抗原抗體如何發(fā)生作用。分子模擬證明了抗體主要通過氫鍵和疏水作用力與B7-H4結(jié)合，氫鍵主要形成于Arg-247、Ser-249上，與實驗結(jié)果相互印證?？贵w建模和分子對接，解釋了抗體的生物活性機理，為下一步治療提供基礎(chǔ)。

總之，本研究初步證實了人源化單抗CH7在體外可以阻斷B7-H4抑制T細(xì)胞增殖抑制作用。后續(xù)工作中，將進(jìn)一步人源化，對體內(nèi)阻斷作用進(jìn)行探索，觀察體內(nèi)外對腫瘤細(xì)胞株生長的抑制作用。