范振軍 張文婷 張 麗 張俊愛 趙祖國 徐軍發(fā)
(廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術(shù)學院檢驗醫(yī)學研究所,東莞 523808)
B7-H4的mRNA在正常細胞中廣泛存在,但在正常細胞表面上的表達被限制[3]。B7-H4通過抑制T細胞增殖、細胞因子分泌和細胞周期,負向調(diào)節(jié)T細胞免疫應答,促進免疫逃逸[4-7]。B7-H4在腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病中異常表達。B7-H4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著極其重要的作用,包括細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡等[8-12]。B7-H4蛋白廣泛表達腎細胞癌、尿路上皮癌、前列腺癌、乳腺癌、肺小細胞癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌,且與腫瘤大小、癌癥分期、轉(zhuǎn)移、進展、疾病預后不良、存活率降低和/或T細胞浸潤減少相關[13-21]。此外,B7-H4還具有很多其他免疫學功能,在保護ConA誘導的肝免疫損傷、維持母體對胎兒的免疫耐受、抗1型糖尿?。═1D)和胰島β細胞移植等方面均扮演重要角色[22-24]。
本研究采用人恒定區(qū)與鼠單抗可變區(qū)嵌合,獲得人鼠嵌合的人源化單抗,并研究單抗的結(jié)合活性,體外阻斷B7-H4抑制T細胞增殖的作用,以及應用肽合成對抗體進行表位分析,確定了抗體的大致結(jié)合表位,探討單抗發(fā)揮生物學功能的分子機制,為抗體藥物研發(fā)奠定基礎。
1.1 材料
1.1.1 主要試劑1640培養(yǎng)基、胎牛血清、F12培養(yǎng) 基(Gibco);LipofectamineTM3000、Trizol(Invitro‐gen);HRP-羊抗鼠、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗人、Pro‐teinA/G(索萊寶);重組人B7-H4、重組人B7-H4 Fc融合蛋白(義翹神州);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真Taq酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶(TaKaRa);CD3+T細胞磁珠分離試劑盒(Easysep);抗CD3、抗CD28(Biogem);人淋巴細胞分離液(天津灝洋);CCK-8試劑盒(日本株式會社);兔抗B7-H4多抗(Santa Cruz);CM5芯片(BIACORE)。
1.1.2 細胞株及質(zhì)粒pMD19-T質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細胞、DE3大腸桿菌(TaKaRa);pET30a(+)質(zhì)粒(Novagen);pFUSE2-CLIg-hk質(zhì)粒、pFUSE-CHIg-hG1質(zhì)粒(InvivoGen);CHO-K1細胞系(ATCC)。
1.2 方法
1.2.1 抗體可變區(qū)基因擴增 復蘇保存的抗人B7-H4雜交瘤細胞株21E7,收集1×107個細胞,加入1 ml Trizol裂解液提取RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對抗體重鏈、輕鏈信號肽和FR4框架區(qū)分別設計特異性引物(表1),PCR擴增可變區(qū)基因,并回收試劑盒收集目的片段。將重、輕鏈片段分別連接在pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,涂在X-gal瓊脂平板上。次日挑選白斑菌落,進行PCR驗證。菌落PCR驗證正確的菌落送生工測序。將測序序列在Signal5.0進行信號肽分析,在IMGT網(wǎng)站進行抗體基因比對。
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表1 可變區(qū)擴增引物Tab.1 Variable region amplification primer
1.2.2 構(gòu)建嵌合表達載體 根據(jù)目的基因的序列,結(jié)合載體上下游酶切位點,設計擴增目的基因的正向、反向引物(表2),并引入相應的酶切位點序列。引物由上海生工合成。重鏈質(zhì)粒與目的基因和輕鏈質(zhì)粒與目的基因分別進行雙酶切并回收酶切片段,T4連接酶16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5α,挑選單個菌落進行菌落PCR,將菌落PCR驗證正確的單菌落,擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,進行酶切驗證。
表2 二次PCR擴增引物Tab.2 Secondary PCR amplification primer
1.2.3 轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞株,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株并評估不同傳代次數(shù)分泌抗體能力 轉(zhuǎn)染前1 d將CHO細胞接種于6孔板,在含10%FBS、1%雙抗的F12培養(yǎng)基,37℃、5%CO2下培養(yǎng)。待細胞80%融合,加入2μg重鏈質(zhì)粒和3 μg輕鏈質(zhì)粒,加入LipofectamineTM3000 Transfection Reagent共轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞系,48 h后 更 換 培 養(yǎng) 基,加 入5 μg/ml Blasticidin和200 μg/ml Zeocin維持21 d篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過抗生素篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株進行傳代培養(yǎng),48 h收集上清,更換培養(yǎng)基。收集原代、第三代、第五代、第七代、第十代上清,將其稀釋50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1 600倍,檢測不同代數(shù)OD值變化。
1.2.4 人源化嵌合單抗純度鑒定 大量收集培養(yǎng)上清,12 000 r/min、4℃離心10 min,棄沉淀,采用0.45μm濾膜過濾除去細胞雜質(zhì)。上清通過Protein A/G親和層析柱收集洗脫液。取收集產(chǎn)物小樣用于SDS-PAGE檢測純化抗體純度,其余在PBS緩沖液中4℃透析過夜,凍干濃縮,復溶,BCA檢測濃度。
1.2.5 間接ELISA檢測人源化嵌合單抗與B7-H4的結(jié)合活性 使用包被液將人B7-H4抗原稀釋至0.5 μg/ml,每孔100 μl加至酶標板,4℃包被過夜。除去包被液,PBST洗滌3次,每次3 min,加入200μl 5%BSA,37℃封閉2 h。除去封閉液,洗滌同上。用PBST稀釋人源化單抗CH7和鼠源單抗21E7,濃度依次為1 000、500、250、125、62.5、31.25、20.833、
13.889 、9.259、6.173、4.115、2.743、1.829、1.219、0.813、0.542 ng/ml,分別取100 μl加入酶標板中,37℃孵育1 h。除去一抗,洗滌同上。人源化單抗組加入100 μl羊抗人IgG二抗稀釋液,鼠源單抗組加入100μl羊抗鼠IgG二抗,37℃孵育1 h。除去二抗,洗滌同上,每孔加入100μl TMB顯色底物,避光10 min,加入50 μl終止液,立即在酶標儀中測定450 nm處吸光值(OD)。
1.2.6 離子表面共振(SPR)檢測單抗與B7-H4的親和力 將人B7-H4重組蛋白,偶聯(lián)在anti-His anti‐body的CM5芯片上,在PBS-P+緩沖液中的傳感器表面捕獲抗體。使用連續(xù)稀釋濃度(250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 nmol/ml)測試抗體。結(jié)合階段的流動持續(xù)時間為120 s,結(jié)合60 s,解離持續(xù)時間為300 s,Gly1.5再生30 s。使用BIAcore評估軟件計算結(jié)合率(Ka)、解離率(Kd)和親和力常數(shù)(KD)。
1.2.7 人源化單抗體外阻斷B7-H4抑制T細胞增殖 從健康志愿者外周血分離出PBMCs,用CD3陽性分磁珠分選出T細胞,接種1×105個細胞到預先包被激發(fā)型抗CD3(5 μg/ml)和抗CD28(2 μg/ml)的96孔板中,分別加入人B7H4-FC融合蛋白(5μg/ml)、人源化單抗(10μg/ml)或兩者混合物。每組設3個復孔,培養(yǎng)72 h后加入CCK-8檢測細胞增殖情況。
1.2.8 抗原表達及肽段合成 將B7-H4胞外功能域的IgV(29~154)和IgC(155~258)兩個肽段分別構(gòu)建pET30a-IgV和pET30a-IgC原核表達載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DE3大腸桿菌,37℃搖菌,當OD值達到0.6時,不加或加入1 mmol/ml的IPGT誘導,繼續(xù)培養(yǎng)6 h。4℃、10 000 r/min,離心15 min,收集菌體。超聲破碎細菌,10 000 r/min,20 min,4℃離心,分別收集上清與沉淀。配置12.5%的分離膠,取15 μl上樣,分別與抗His抗體和人源化單抗CH7 4℃孵育過夜,TBST洗滌3次,每次10 min,5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,加入相應二抗孵育1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,加入TMB顯影劑,于曝光儀曝光。將IgC域分成4個肽段,S1(159~178 aa:YNASSETLRCEAPRWFPQPT)、S2(182~207 aa:ASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVT)、S3(211~227 aa:VSVLYNVTINNTYSCMI)、S4(233~253 aa:KATGDIKVTESEIKRRSHLQL),交由上海吉爾生化合成肽段,用肽段包被酶標板,分別加入人源化嵌合單抗和兔多抗檢測。
1.2.9 三維建模及分子對接 從UniProt數(shù)據(jù)庫中下載AlphaFold預測B7-H4的三維結(jié)構(gòu)。使用Ro‐setta軟件對抗體可變區(qū)開始進行建模,使用Pro‐check對三維模型進行評估。使用Discovery Studio軟件中的ZDOCK程序?qū)乖贵w進行對接,以相互作用主要在抗原233~253aa且打分最靠前的POSE作為最終結(jié)果。
1.3 統(tǒng)計學處理 采用Graph Pad Prism 8.0軟件進行t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 雜交瘤可變區(qū)基因擴增及序列分析 從雜交瘤21E7中擴增出了重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,片段大小400 bp左右(圖1A)。目的基因與T載體連接,分別構(gòu)建了T-VH重鏈可變區(qū)T載體和T-VL輕鏈可變區(qū)T載體。單菌落PCR擴增出了一致大小的片段(圖1B、C)。如圖2A、B所示,重鏈基因前面57個堿基為信號肽,編碼19個氨基酸;輕鏈基因前面50個堿基為信號肽,編碼20個氨基酸。重鏈可變區(qū)全長354個堿基,功能性重鏈V基因?qū)儆谑驣GHV1-54*03(F)家族,匹配率為97.22%,J基因?qū)儆谑驣GHJ3*01F家族,D基因?qū)儆谑驣GHD2-4*01F家族。輕鏈可變區(qū)全長336個堿基。功能性輕鏈V基因?qū)儆谑驣GKV8-21*01(F)家族,匹配率為97.31%,J基因?qū)儆谑驣GKJ5*01F家族(圖2C)。
圖1 雜交瘤可變區(qū)基因擴增Fig.1 Amplification of variable region gene from hybridoma
圖2 抗體可變區(qū)序列分析Fig.2 Sequence analysis of variable region of antibody
2.2 嵌合表達載體的構(gòu)建pFUSE-CHIg-hG1質(zhì)粒帶有人IgG1恒定區(qū),而pFUSE-CLIg-hk質(zhì)粒帶有人κ鏈恒定區(qū),與相應的抗體可變區(qū)基因連接,構(gòu)建了表達人鼠嵌合重鏈的載體pFUSE-mVH-hCH,表達人鼠嵌合輕鏈的載體pFUSE-mvl-hCL。菌落PC(圖3A)、酶切實驗(圖3B),均證實片段大小與擴增片段大小一致,證明人鼠嵌合表達載體構(gòu)建成功。
圖3 嵌合表達載體的構(gòu)建Fig.3 Construction of chimeric expression vectors
2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)株不同傳代次數(shù)分泌抗體的能力評價利用載體上的抗性基因Blasticidin和Zeocin篩選出穩(wěn)定表達抗人B7-H4人鼠嵌合抗體的細胞株并命名為CH7。傳代培養(yǎng)10次后,培養(yǎng)上清效價無顯著性差異(圖4),說明穩(wěn)轉(zhuǎn)株能穩(wěn)定分泌抗體,隨著傳代次數(shù)增加其分泌抗體的能力未發(fā)生改變。
圖4 穩(wěn)轉(zhuǎn)株不同傳代次數(shù)分泌抗體的能力Fig.4 Ability of stable strain to secrete antibody at different times of passage
2.4 人源化單抗純度鑒定及BCA測定濃度 使用SDS-PAGE對抗體的純度鑒定結(jié)果可以看出人源化抗體在SDS-PAGE膠上分成兩條清楚的條帶,分子量分別在50 kD和25 kD附近,并沒有明顯的雜帶(圖5),說明成功得到了純化抗體,且抗體純度和完整性良好。凍干復溶后,BCA法測得人源化單抗?jié)舛葹?.82 mg/ml。
圖5 SDS-PAGE鑒定純化后抗體純度Fig.5 Purity of purified antibody was determined by SDS-PAGE
2.5 嵌合單抗與人B7-H4的結(jié)合活性 間接ELISA測定嵌合單抗CH7與B7-H4的結(jié)合活性(圖6)。表明使用ELISA測定人源化單抗CH7與鼠源單抗21E7的效價,嵌合單抗在稀釋到9.259 ng/ml時,OD>1,效價為1.97×105左右,與鼠源親本效價相差不大。SRP結(jié)果顯示,嵌合單抗親和力為3.72×10?9kD,鼠抗為1.52×10?9kD,嵌合單抗具有很好的結(jié)合活性(圖7)。ELISA和SPR的結(jié)果均表明嵌合單抗可以與人B7-H4進行很好地結(jié)合,且保留了鼠源親本單抗的大部分活性。
圖6 ELISA檢測單抗效價Fig.6 Detection of titer of monoclonal antibody by ELISA
圖7 SPR測定單抗的親和力Fig.7 SPR assays affinity of monoclonal antibodies
2.6 嵌合單抗體外阻斷B7-H4抑制T細胞增殖如圖8所示,人外周血T細胞在激發(fā)型單抗CD3和CD28體外激發(fā)培養(yǎng)體系中加入B7-H4 Fc融合蛋白后,明顯抑制了T細胞體外增殖作用(P<0.01);加入嵌合單抗后顯著逆轉(zhuǎn)了B7-H4介導的T細胞增殖抑制效應(P<0.05),說明嵌合單抗在體外具有一定阻斷B7-H4對T細胞增殖抑制的作用。
圖8 T細胞增殖抑制實驗Fig.8 T cell proliferation inhibition assay
2.7 嵌合單抗體表位驗證 實驗證明嵌合單抗可以用于Western blot(圖9A),因此,為了進一步弄清楚單抗在阻斷B7-H4抑制T細胞增殖的作用分子機制,分別表達了包含人B7-H4的胞外V結(jié)構(gòu)域(29154 aa)和包含胞外C結(jié)構(gòu)域(155~258 aa)的蛋白(圖9B)。pET30a載體上帶有His標簽,用抗His抗體孵育表達產(chǎn)物,證實成功表達了這兩段抗原,且是在包涵體中表達(圖9C)。用嵌合單抗孵育抗原發(fā)現(xiàn),只有胞外C結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)條帶,說明單抗結(jié)合位點在胞外C結(jié)構(gòu)域中(圖9D)。將胞外C結(jié)構(gòu)域分成四段肽,合成肽并用于包被酶標板,ELISA檢測發(fā)現(xiàn)S1、S2、S4均能與商品化兔多抗結(jié)合,而S3不能結(jié)合。嵌合單抗只與S4結(jié)合,證明單抗結(jié)合表位在S4中(圖9E)。
圖9 抗體表位分析Fig.9 Antibody epitope analysis
2.8 生物信息學建模 抗體建模通過Rosetta從頭開始建模,Ramachandran plot表明在允許區(qū)域內(nèi)占99%,因此模型較理想。抗體可變區(qū)模型表明可變區(qū)得CDR區(qū)具有β折疊片層和環(huán)結(jié)構(gòu),所有CDR區(qū)域的環(huán)結(jié)構(gòu)由大量的疏水性氨基酸組成,重鏈和輕鏈之間的CDR區(qū)域形成疏水性空腔。從UniProt數(shù)據(jù)庫下載AlphaFold預測B7-H4的結(jié)構(gòu),使用Dis‐covery Studio軟件中的ZDOCK程序?qū)乖贵w進行對接。對接顯示,輕鏈CDR2環(huán)上Ser-58L2與Arg-247,Arg-60L2與Arg-247,Arg-60L2與Ser-249形成了氫鍵;重鏈CD3環(huán)上的Asp-101H3與Met-235,Tyr-102H3與PRO-236形成了氫鍵。同時存在大量疏水性氨基酸(Leu-33H1、Ile-34H1、Val-50H2、
Ile-51H2、Pro-53H2、Phe-105H3、Ala-106H3、Leu-29L1、Ala-40L1、Trp-56L2、Val-57L2、Leu-100L3)形成疏水性凹槽,推動B7-H4分子與之緊密結(jié)合。對接結(jié)果表明,抗原與抗體的相互作用依賴于氫鍵和疏水作用,見附圖1(www.immune99.com)。
免疫檢查點阻斷是激活抗腫瘤免疫的有效策略之一,近年來PD-1/PD-L1免疫療法在多種惡性腫瘤的治療中取得了顯著成效,并獲得2018年諾貝爾醫(yī)學與生理學獎[25]。但仍存在部分患者治療無效以及不良事件,其治療效果及治療安全性仍需進一步探討[26-27]。B7-H4是一種免疫檢查點配體,表達于腫瘤和APCs表面,抑制T細胞活化和增殖,在抗腫瘤免疫反應的負調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[3]。B7-H4信號被認為是腫瘤細胞逃避T細胞介導殺傷的重要機制。因此,靶向腫瘤相關的B7-H4可能為增強抗腫瘤反應提供一種新的治療策略。FPA150是首個具有增強ADCC效應的B7-H4阻斷抗體,目前正在進行的臨床試驗已證明其良好安全性[28]。
本實驗室多年來關注B7-H4靶點研究,制備了高親和力的鼠單抗。為降低抗鼠抗體(HAMA)反應,本研究采用人IgG1恒定區(qū)取代了鼠恒定區(qū)。IgG1靶向于腫瘤細胞,具有更強的CDC和ADCC效應,穩(wěn)定性更好。利用輕鏈和重鏈的真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染了CHO-K1細胞系,經(jīng)過抗生素篩選,獲得了能穩(wěn)定表達抗B7-H4人源化單克隆抗體的CHO細胞株。間接ELISA和SPR證實了嵌合抗體具有很高的結(jié)合活性,保留了鼠源親本絕大部分活性。B7-H4-Ig抑制了T細胞的增殖,而當加入人源化嵌合抗體CH7時,這種抑制作用被抵消了。人源化嵌合抗體CH7通過阻斷B7-H4促進了T細胞的活化與增殖,顯示出用于腫瘤治療的潛力。本課題分段表達了抗原,確定抗體與IgC域結(jié)合,之后把IgC域分成了四段多肽,ELISA結(jié)果確定抗體與233~253 aa發(fā)生作用,因而可以更精準地模擬抗原抗體如何發(fā)生作用。分子模擬證明了抗體主要通過氫鍵和疏水作用力與B7-H4結(jié)合,氫鍵主要形成于Arg-247、Ser-249上,與實驗結(jié)果相互印證??贵w建模和分子對接,解釋了抗體的生物活性機理,為下一步治療提供基礎。
總之,本研究初步證實了人源化單抗CH7在體外可以阻斷B7-H4抑制T細胞增殖抑制作用。后續(xù)工作中,將進一步人源化,對體內(nèi)阻斷作用進行探索,觀察體內(nèi)外對腫瘤細胞株生長的抑制作用。