張志東 魏海龍 林振海 陳吉柏 彭 文（儋州市人民醫(yī)院胸心腫瘤外科，儋州 571700）

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有病例的80%［1-3］。過(guò)去十年中，驅(qū)動(dòng)癌基因靶向療法的普及徹底改變了晚期NSCLC的治療模式，而近年免疫療法在NSCLC治療中取得了驚人療效，使其備受關(guān)注［4-7］。多項(xiàng)具有里程碑意義的臨床試驗(yàn)表明，抗PD-1/PD-L1療法可顯著延長(zhǎng)患者總生存期，但總體而言，僅有約30%的NSCLC患者受益于單一抗PD-1/PD-L1療法［8-10］。因此，為使更多人群受益，需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的免疫療法。

過(guò)繼性嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面已顯示出驚人療效，但多種技術(shù)和生物學(xué)障礙限制了CAR修飾的T細(xì)胞治療實(shí)體瘤［11］。CAR通常包含3個(gè)模塊：細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和傳遞激活信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域。其中一代CAR的胞內(nèi)信號(hào)域通常僅由T細(xì)胞受體CD3ζ鏈組成，二代CAR往往額外包含來(lái)自CD28、4-1BB、OX40、CD27或ICOS共刺激蛋白的信號(hào)域。目前，含CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR使用最為廣泛［12］。是否存在新的共刺激蛋白組合可克服CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的障礙，是研究人員關(guān)心的問(wèn)題。

研究表明，ICOS共刺激信號(hào)可增強(qiáng)T細(xì)胞效應(yīng)功能和體內(nèi)持久性［13］。間皮素MSLN作為為數(shù)不多的CAR-T細(xì)胞針對(duì)實(shí)體瘤的靶標(biāo)，在包括肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，因此被選為本研究靶標(biāo)［14］。本研究擬將ICOS共刺激信號(hào)域整合至傳統(tǒng)二代CAR，探究新型CAR-T細(xì)胞是否可對(duì)肺癌治療產(chǎn)生積極響應(yīng)，為優(yōu)化CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的抗腫瘤活性以實(shí)現(xiàn)肺癌患者治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；過(guò)表達(dá)MSLN的A549細(xì)胞系（M-A549）為本實(shí)驗(yàn)先前保存，采用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)；4~6周齡雌性NSG小鼠由海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；Ficoll試劑購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；CD3/CD28激活磁珠購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；polybrene購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Anti-CD69-PE、Anti-CD8-PE、Anti-IFN-γ-BV421、Anti-PD-1-APC抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；蘇木精-伊紅試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染外周血單核細(xì)胞3例健康志愿者外周血取自儋州市人民醫(yī)院血液科，所有志愿者知情同意。按照制造商說(shuō)明，采用Ficoll試劑從外周血中分離PBMC，并與CD3/CD28激活磁珠1∶1混合，48 h后按MOI=10加入慢病毒，同時(shí)加入6 μg/ml polybrene，30℃、1 200 g離心60 min，培養(yǎng)24 h后更換正常培養(yǎng)基。本研究所用慢病毒由上海漢恒生物科技有限公司提供（圖1A）。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSLN-ICOSBBz CAR-T陽(yáng)性率和CD69、IFN-γ及PD-1表達(dá) 病毒感染T細(xì)胞72 h后，取3×105個(gè)T細(xì)胞，PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSLN-ICOSBBz CAR-T或MSLN-BBz CAR-T陽(yáng)性率，以未感染的T細(xì)胞為對(duì)照。共孵育實(shí)驗(yàn)：將1×104個(gè)M-A549細(xì)胞與2×104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞共孵育，24 h后收集上清，離心獲得效應(yīng)細(xì)胞，PBS清洗3次，加入5 μl Anti-CD69-PE抗體4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD69表達(dá)。腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞：取30 mg腫瘤組織，機(jī)械解離后采用1 mg/ml膠原酶Ⅰ37℃消化1 h，70μm濾膜過(guò)濾，加入Anti-CD8-PE和Anti-PD-1-APC抗體4℃避光孵育30 min，加入固定破膜試劑及Anti-IFN-γ-BV421 4℃避光孵育30 min，perm/wash buffer清洗3遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 CELigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)靶細(xì)胞毒性 腫瘤細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種，按效靶比1∶1加入效應(yīng)細(xì)胞，記錄阻抗信號(hào)50 h，間隔5 min。

1.2.4 活體成像檢測(cè)小鼠腫瘤大小 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)儋州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。將5×106個(gè)M-A549細(xì)胞皮下注射于NSG小鼠左側(cè)腋下，10 d后將15只小鼠隨機(jī)分為3組：PBS組、MSLN-ICOSBBz CAR-T組和MSLN-BBz CAR-T組，靜脈注射1×107個(gè)T細(xì)胞，回輸T細(xì)胞后第21天采用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)采集熒光圖像，解剖小鼠腫瘤，稱重。

1.2.5 HE染色 將新鮮的腫瘤組織固定于4%多聚甲醛，48 h后梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），脫蠟水合，根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行HE染色，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間樣本比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSLN-ICOSBBz CAR-T獲得 以4-1BB為共刺激分子的二代CAR-T細(xì)胞（MSLN-BBz CAR-T）為基礎(chǔ)，加入ICOS共刺激域構(gòu)建三代CAR-T細(xì)胞MSLNICOSBBz CAR-T，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，MSLN-BBz CAR-T和MSLN-ICOSBBz CAR-T均構(gòu)建成功，陽(yáng)性率約為40%（圖1B、C）。

圖1 MSLN-ICOSBBz CAR-T結(jié)構(gòu)Fig.1 Construction of MSLN-ICOSBBz CAR-T

2.2 MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T體外激活能力更強(qiáng) 效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T表面CD69表達(dá)較MSLN-BBz CAR-T更高，表明其激活更充分（P<0.001，圖2）。

圖2 MSLN-ICOSBBz CAR-T體外激活Fig.2 Activation of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vitro

2.3 MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T體外靶細(xì)胞裂解能力更強(qiáng) 效靶細(xì)胞共孵育后，T細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T共孵育組的T細(xì)胞較MSLN-BBz CAR-T共孵育組靶細(xì)胞裂解明顯增加，而正常T細(xì)胞組靶細(xì)胞裂解較少（P<0.001，圖3）。

圖3 MSLN-ICOSBBz CAR-T體外靶細(xì)胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vitro

2.4 MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T體內(nèi)抑瘤能力更強(qiáng) 活體成像結(jié)果顯示，MSLNICOSBBz CAR-T和MSLN-BBz CAR-T均能抑制小鼠體內(nèi)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T腫瘤抑制能力更強(qiáng)（圖4A）。瘤重比較結(jié)果也顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T治療組較MSLN-BBz CAR-T治療組腫瘤質(zhì)量更小（P<0.01，圖4B）。

圖4 體內(nèi)MSLN-ICOSBBz CAR-T抑瘤能力Fig.4 Tumor inhibition ability of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vivo

2.5 腫瘤浸潤(rùn)的MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLNBBz CAR-T擁有更顯著的抗腫瘤表型 回輸MSLNICOSBBz CAR-T的小鼠腫瘤組織中T細(xì)胞得到了更強(qiáng)的抗腫瘤表型，腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T IFN-γ表達(dá)水平更高（P<0.000 1，圖5A），同時(shí)免疫檢查點(diǎn)PD-1表達(dá)更低（P<0.001，圖5B），抗腫瘤活性更強(qiáng)。

圖5 腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞抗腫瘤表型Fig.5 Anti-tumor phenotype of tumor infiltrating T cells

2.6 MSLN-ICOSBBz CAR-T與MSLN-BBz CAR-T未對(duì)小鼠產(chǎn)生明顯器官毒性 主要器官HE結(jié)果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T與MSLN-BBz CAR-T均未對(duì)組織造成明顯損傷，表明其在體內(nèi)未產(chǎn)生嚴(yán)重毒性（圖6）。

圖6 主要器官HE染色結(jié)果Fig.6 HE staining results of main organs

3 討論

盡管CAR-T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤中取得了巨大成功，但其在實(shí)體瘤中療效有限［15］。本研究探討了通過(guò)優(yōu)化共刺激域增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)肺癌治療的有效性。

研究表明，ICOS共刺激信號(hào)可增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與二代CAR-T細(xì)胞相比，通過(guò)整合ICOS CAR介導(dǎo)的信號(hào)增加了MSLN-ICOSBBz CAR-T的激活狀態(tài)。此外，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育時(shí)，MSLN-ICOSBBz CAR-T靶細(xì)胞裂解能力顯著高于MSLN-BBz CAR-T。內(nèi)源性4-1BB信號(hào)可影響記憶CD8+T細(xì)胞數(shù)量和持久性，4-1BB刺激可將T細(xì)胞從無(wú)能和疲憊狀態(tài)中解救出來(lái)，且有助于T細(xì)胞長(zhǎng)期存活［17-18］。此外，也有研究報(bào)道，ICOS可誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化，刺激T細(xì)胞產(chǎn)生更多的效應(yīng)細(xì)胞因子，從而強(qiáng)化機(jī)體抗腫瘤免疫功能［19］。本研究表明，三代CAR中，通過(guò)結(jié)合4-1BB和ICOS信號(hào)域可進(jìn)一步提高4-1BB CAR激活信號(hào)，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞腫瘤細(xì)胞清除能力。同時(shí)體內(nèi)研究表明，腫瘤浸潤(rùn)的MSLN-ICOSBBz CAR-T PD-1表達(dá)更低，表明ICOS也可減輕CAR-T細(xì)胞抑制狀態(tài)。

BOLE-RICHARD等［20］發(fā)現(xiàn)，CD28置于細(xì)胞膜遠(yuǎn)端，而CD3ζ移動(dòng)至膜近端位置的結(jié)構(gòu)是無(wú)功能的。因此多數(shù)三代CAR將CD28放置于細(xì)胞膜近端［21］。ICOS和CD28均為CD28家族成員，具有獨(dú)特且重疊的功能，可協(xié)同調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化。研究表明，ICOS能夠比CD28更有效地激活PI3K信號(hào)傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致Akt信號(hào)傳導(dǎo)增加［22］。因此本研究將ICOS放置于膜近端，與4-1BB聯(lián)合顯示出協(xié)同增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，支持了優(yōu)化CAR T細(xì)胞共刺激的重要性。

盡管本研究構(gòu)建的MSLN-ICOSBBz CAR-T已展現(xiàn)出良好的肺癌細(xì)胞清除功能，但仍存在不足。本研究參考文獻(xiàn)［20］選擇了將ICOS置于近膜部位，但I(xiàn)COS在CAR中的其他定位需在后續(xù)研究中驗(yàn)證。此外，本研究通過(guò)主要臟器HE染色初步評(píng)估了MSLN-ICOSBBz CAR-T的體內(nèi)安全性，但更充分的毒理研究需在后續(xù)研究中進(jìn)行。

總之，本研究證明：選擇ICOS協(xié)同4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域可顯著提高CAR-T細(xì)胞對(duì)肺癌的抗腫瘤功能，可指導(dǎo)功能增強(qiáng)型和持久性增強(qiáng)型的下一代細(xì)胞療法設(shè)計(jì)，同時(shí)為MSLN-ICOSBBz CAR-T對(duì)肺癌治療的進(jìn)一步探索提供了依據(jù)。