張志東 魏海龍 林振海 陳吉柏 彭 文（儋州市人民醫(yī)院胸心腫瘤外科，儋州 571700）

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有病例的80%［1-3］。過去十年中，驅動癌基因靶向療法的普及徹底改變了晚期NSCLC的治療模式，而近年免疫療法在NSCLC治療中取得了驚人療效，使其備受關注［4-7］。多項具有里程碑意義的臨床試驗表明，抗PD-1/PD-L1療法可顯著延長患者總生存期，但總體而言，僅有約30%的NSCLC患者受益于單一抗PD-1/PD-L1療法［8-10］。因此，為使更多人群受益，需進一步開發(fā)新的免疫療法。

過繼性嵌合抗原受體T細胞免疫療法在治療血液系統惡性腫瘤方面已顯示出驚人療效，但多種技術和生物學障礙限制了CAR修飾的T細胞治療實體瘤［11］。CAR通常包含3個模塊：細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和傳遞激活信號的細胞內信號域。其中一代CAR的胞內信號域通常僅由T細胞受體CD3ζ鏈組成，二代CAR往往額外包含來自CD28、4-1BB、OX40、CD27或ICOS共刺激蛋白的信號域。目前，含CD28或4-1BB共刺激結構域的CAR使用最為廣泛［12］。是否存在新的共刺激蛋白組合可克服CAR-T細胞在實體瘤中的障礙，是研究人員關心的問題。

研究表明，ICOS共刺激信號可增強T細胞效應功能和體內持久性［13］。間皮素MSLN作為為數不多的CAR-T細胞針對實體瘤的靶標，在包括肺癌在內的多種實體瘤中高表達，因此被選為本研究靶標［14］。本研究擬將ICOS共刺激信號域整合至傳統二代CAR，探究新型CAR-T細胞是否可對肺癌治療產生積極響應，為優(yōu)化CAR-T細胞在實體瘤中的抗腫瘤活性以實現肺癌患者治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞A549購自中科院上海細胞庫；過表達MSLN的A549細胞系（M-A549）為本實驗先前保存，采用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)；4~6周齡雌性NSG小鼠由海南醫(yī)學院動物實驗中心提供；Ficoll試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；CD3/CD28激活磁珠購自美國Invitrogen公司；polybrene購自美國Sigma公司；Anti-CD69-PE、Anti-CD8-PE、Anti-IFN-γ-BV421、Anti-PD-1-APC抗體購自美國Biolegend公司；蘇木精-伊紅試劑購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染外周血單核細胞3例健康志愿者外周血取自儋州市人民醫(yī)院血液科，所有志愿者知情同意。按照制造商說明，采用Ficoll試劑從外周血中分離PBMC，并與CD3/CD28激活磁珠1∶1混合，48 h后按MOI=10加入慢病毒，同時加入6 μg/ml polybrene，30℃、1 200 g離心60 min，培養(yǎng)24 h后更換正常培養(yǎng)基。本研究所用慢病毒由上海漢恒生物科技有限公司提供（圖1A）。

1.2.2 流式細胞術檢測MSLN-ICOSBBz CAR-T陽性率和CD69、IFN-γ及PD-1表達 病毒感染T細胞72 h后，取3×105個T細胞，PBS清洗3次，流式細胞儀檢測MSLN-ICOSBBz CAR-T或MSLN-BBz CAR-T陽性率，以未感染的T細胞為對照。共孵育實驗：將1×104個M-A549細胞與2×104個效應細胞共孵育，24 h后收集上清，離心獲得效應細胞，PBS清洗3次，加入5 μl Anti-CD69-PE抗體4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，流式細胞儀檢測CD69表達。腫瘤浸潤T細胞：取30 mg腫瘤組織，機械解離后采用1 mg/ml膠原酶Ⅰ37℃消化1 h，70μm濾膜過濾，加入Anti-CD8-PE和Anti-PD-1-APC抗體4℃避光孵育30 min，加入固定破膜試劑及Anti-IFN-γ-BV421 4℃避光孵育30 min，perm/wash buffer清洗3遍，流式細胞儀檢測。

1.2.3 CELigence實時細胞分析系統檢測靶細胞毒性 腫瘤細胞以1×104個/孔的密度接種，按效靶比1∶1加入效應細胞，記錄阻抗信號50 h，間隔5 min。

1.2.4 活體成像檢測小鼠腫瘤大小 動物實驗經儋州市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。將5×106個M-A549細胞皮下注射于NSG小鼠左側腋下，10 d后將15只小鼠隨機分為3組：PBS組、MSLN-ICOSBBz CAR-T組和MSLN-BBz CAR-T組，靜脈注射1×107個T細胞，回輸T細胞后第21天采用Xenogen IVIS成像系統采集熒光圖像，解剖小鼠腫瘤，稱重。

1.2.5 HE染色 將新鮮的腫瘤組織固定于4%多聚甲醛，48 h后梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），脫蠟水合，根據制造商說明進行HE染色，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學處理，計量數據采用±s表示，組間樣本比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSLN-ICOSBBz CAR-T獲得 以4-1BB為共刺激分子的二代CAR-T細胞（MSLN-BBz CAR-T）為基礎，加入ICOS共刺激域構建三代CAR-T細胞MSLNICOSBBz CAR-T，流式細胞術結果表明，MSLN-BBz CAR-T和MSLN-ICOSBBz CAR-T均構建成功，陽性率約為40%（圖1B、C）。

圖1 MSLN-ICOSBBz CAR-T結構Fig.1 Construction of MSLN-ICOSBBz CAR-T

2.2 MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T體外激活能力更強 效應細胞與靶細胞共孵育后，流式細胞術結果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T表面CD69表達較MSLN-BBz CAR-T更高，表明其激活更充分（P<0.001，圖2）。

圖2 MSLN-ICOSBBz CAR-T體外激活Fig.2 Activation of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vitro

2.3 MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T體外靶細胞裂解能力更強 效靶細胞共孵育后，T細胞增殖結果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T共孵育組的T細胞較MSLN-BBz CAR-T共孵育組靶細胞裂解明顯增加，而正常T細胞組靶細胞裂解較少（P<0.001，圖3）。

圖3 MSLN-ICOSBBz CAR-T體外靶細胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vitro

2.4 MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T體內抑瘤能力更強 活體成像結果顯示，MSLNICOSBBz CAR-T和MSLN-BBz CAR-T均能抑制小鼠體內肺癌細胞生長，而MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T腫瘤抑制能力更強（圖4A）。瘤重比較結果也顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T治療組較MSLN-BBz CAR-T治療組腫瘤質量更?。≒<0.01，圖4B）。

圖4 體內MSLN-ICOSBBz CAR-T抑瘤能力Fig.4 Tumor inhibition ability of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vivo

2.5 腫瘤浸潤的MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLNBBz CAR-T擁有更顯著的抗腫瘤表型 回輸MSLNICOSBBz CAR-T的小鼠腫瘤組織中T細胞得到了更強的抗腫瘤表型，腫瘤浸潤T細胞流式檢測結果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T較MSLN-BBz CAR-T IFN-γ表達水平更高（P<0.000 1，圖5A），同時免疫檢查點PD-1表達更低（P<0.001，圖5B），抗腫瘤活性更強。

圖5 腫瘤浸潤性T細胞抗腫瘤表型Fig.5 Anti-tumor phenotype of tumor infiltrating T cells

2.6 MSLN-ICOSBBz CAR-T與MSLN-BBz CAR-T未對小鼠產生明顯器官毒性 主要器官HE結果顯示，MSLN-ICOSBBz CAR-T與MSLN-BBz CAR-T均未對組織造成明顯損傷，表明其在體內未產生嚴重毒性（圖6）。

圖6 主要器官HE染色結果Fig.6 HE staining results of main organs

3 討論

盡管CAR-T細胞療法在血液系統腫瘤中取得了巨大成功，但其在實體瘤中療效有限［15］。本研究探討了通過優(yōu)化共刺激域增強CAR-T細胞對肺癌治療的有效性。

研究表明，ICOS共刺激信號可增強效應T細胞介導的抗腫瘤活性［16］。本研究發(fā)現，與二代CAR-T細胞相比，通過整合ICOS CAR介導的信號增加了MSLN-ICOSBBz CAR-T的激活狀態(tài)。此外，當效應細胞與靶細胞共孵育時，MSLN-ICOSBBz CAR-T靶細胞裂解能力顯著高于MSLN-BBz CAR-T。內源性4-1BB信號可影響記憶CD8+T細胞數量和持久性，4-1BB刺激可將T細胞從無能和疲憊狀態(tài)中解救出來，且有助于T細胞長期存活［17-18］。此外，也有研究報道，ICOS可誘導Th細胞分化，刺激T細胞產生更多的效應細胞因子，從而強化機體抗腫瘤免疫功能［19］。本研究表明，三代CAR中，通過結合4-1BB和ICOS信號域可進一步提高4-1BB CAR激活信號，增強CAR-T細胞腫瘤細胞清除能力。同時體內研究表明，腫瘤浸潤的MSLN-ICOSBBz CAR-T PD-1表達更低，表明ICOS也可減輕CAR-T細胞抑制狀態(tài)。

BOLE-RICHARD等［20］發(fā)現，CD28置于細胞膜遠端，而CD3ζ移動至膜近端位置的結構是無功能的。因此多數三代CAR將CD28放置于細胞膜近端［21］。ICOS和CD28均為CD28家族成員，具有獨特且重疊的功能，可協同調節(jié)T細胞分化。研究表明，ICOS能夠比CD28更有效地激活PI3K信號傳導，從而導致Akt信號傳導增加［22］。因此本研究將ICOS放置于膜近端，與4-1BB聯合顯示出協同增強的抗腫瘤效應，支持了優(yōu)化CAR T細胞共刺激的重要性。

盡管本研究構建的MSLN-ICOSBBz CAR-T已展現出良好的肺癌細胞清除功能，但仍存在不足。本研究參考文獻［20］選擇了將ICOS置于近膜部位，但ICOS在CAR中的其他定位需在后續(xù)研究中驗證。此外，本研究通過主要臟器HE染色初步評估了MSLN-ICOSBBz CAR-T的體內安全性，但更充分的毒理研究需在后續(xù)研究中進行。

總之，本研究證明：選擇ICOS協同4-1BB共刺激結構域可顯著提高CAR-T細胞對肺癌的抗腫瘤功能，可指導功能增強型和持久性增強型的下一代細胞療法設計，同時為MSLN-ICOSBBz CAR-T對肺癌治療的進一步探索提供了依據。