魏波，叢雁方，?？※i，劉曉婧，蔣貽海

（青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東 青島 266114）

0 引言

干擾素是動(dòng)物抵御病毒入侵的第一道防線，是動(dòng)物機(jī)體感染病毒或接種疫苗后產(chǎn)生的一類具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白[1-2]。目前將干擾素分為3類，它們根據(jù)核苷酸序列、與特定受體的相互作用、染色體位置、結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分類[3]。 重組豬α干擾素（recombinant porcine interferon-a，rPoIFN-α）是利用大腸桿菌原核表達(dá)的一種重組蛋白，具有天然豬α干擾素抗病毒活性[4]。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種以母豬不孕、晚期胎兒木乃伊、流產(chǎn)、死胎和弱胎、對(duì)仔豬產(chǎn)出后發(fā)生呼吸道疫病和繼發(fā)感染而很快死亡的傳染病[5]。有報(bào)道重組豬a干擾素（rPoIFN-a）制劑可以治療高致病性豬繁殖與呼吸綜合征[6]。成功開發(fā)rPoIFN-α制劑，主要在體外細(xì)胞水平驗(yàn)證rPoIFN-α對(duì)PRRSV陽(yáng)性血清中和PRRSV的影響作用，為rPoIFN-α應(yīng)用在PRRSV防控和凈化上提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）TCID50為10-6.89/mL、PRRSV陽(yáng)性血清（中和效價(jià)為1∶37.6）、rPoIFN-α、Marc-145細(xì)胞、MDBK細(xì)胞由青島蔚藍(lán)生物制品有限公司保存。

1.2 方法

1.2.1 rPoIFN-a的活性測(cè)定

采用細(xì)胞病變抑制法。按常規(guī)方法將MDBK細(xì)胞傳代，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，滴加96孔板。待細(xì)胞長(zhǎng)至單層。用含2.0%血清的DMEM培養(yǎng)基將被檢樣品作10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7共4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種5孔，0.1 mL/孔，在37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。棄去上清液，每孔加入水皰性口炎病毒（VSV）0.1 mL（約100TCID50），另設(shè)病毒對(duì)照孔和正常細(xì)胞對(duì)照孔，各5孔；在37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待病毒對(duì)照孔75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，判定記錄結(jié)果。按Reed-Muench法計(jì)算，能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞不發(fā)生病變的最高稀釋度即為干擾素效價(jià)（生物學(xué)活性）。比活性為生物學(xué)活性與蛋白含量之比。

1.2.2 rPoIFN-a增強(qiáng)PRRSV陽(yáng)性血清對(duì)PRRSV病毒的中和作用

（1）PRRSV陽(yáng)性血清工作液的制備。PRRSV陽(yáng)性血清倍比稀釋，選擇2-5、2-6、2-7、2-8共4個(gè)稀釋度試驗(yàn)。

（2）PRRSV病毒工作液的制備。PRRSV以無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋至2×105TCID50/100 μL、2×104TCID50/100 μL、2×103TCID50/100 μL、2×102TCID50/100 μL病毒滴度，即病毒工作液。

（3）rPoIFN-a工作液的制備。rPoIFN-a工作液稀釋為20 000 U/mL。

（4）每個(gè)試驗(yàn)組作4個(gè)復(fù)孔，具體樣品分組如下：①正常細(xì)胞對(duì)照組：200 μL/孔的無血清DMEM培養(yǎng)液。②PRRS病毒對(duì)照組：PRRSV病毒工作液100 μL/孔+無血清DMEM培養(yǎng)液100 μL/孔。③Ab組：PRRSV陽(yáng)性血清100 μL/孔+PRRSV病毒工作液100 μL/孔。④IFN組：rPoIFN-a工作液（20 000 U/mL）100 μL/孔+PRRSV病毒工作液100 μL/孔。⑤Ab+IFN組：（PRRSV陽(yáng)性血清50 μL+40 000 U/mL rPoIFN-a工作液50μL）100 μL/孔+PRRSV病毒工作液100 μL/孔。

（5）中和。將所有樣品混勻后置37 ℃中和1 h。

（6）接種細(xì)胞。樣品中和后每孔各取200 μL平行加入提前準(zhǔn)備好的Marc-145細(xì)胞96孔培養(yǎng)板。置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，觀察細(xì)胞CPE情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDBK/VSV系統(tǒng)的rPoIFN-a活性測(cè)定結(jié)果

采用細(xì)胞病變抑制法，檢測(cè)系統(tǒng)為MDBK/VSV細(xì)胞系統(tǒng)，通過重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算出rPoIFN-a的活性效價(jià)為107.5U/mL。

2.2 rPoIFN-a增強(qiáng)PRRSV陽(yáng)性血清對(duì)PRRSV病毒的中和作用

單獨(dú)加IFN組可以中和103個(gè)TCID50PRRSV，Ab組中和效價(jià)1∶1.175可以保護(hù)103TCID50PRRSV感染孔沒有病變。Ab+IFN組在1∶0.588和1∶1.175時(shí)均可以完全保護(hù)104TICD50PRRSV感染，同時(shí)保護(hù)3/4的孔數(shù)105TCID-50PRRSV未感染。由此得出，1∶0.588和1∶1.175的Ab+IFN組明顯增強(qiáng)Ab中和病毒的能力，見表1。

表1 rPoIFN-a增強(qiáng)PRRSV陽(yáng)性血清對(duì)PRRSV的中和作用

3 討論與結(jié)論

rPoIFN-α在體內(nèi)和體外對(duì)PRRSV均敏感，考慮干擾素可以作為抗病毒藥物PRRS病疾進(jìn)行緊急預(yù)防和治療。豬感染PRRSV后，能使失活干擾素啟動(dòng)子刺激元件并且抑制干擾素調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，抑制豬體內(nèi)IFN-α/β的產(chǎn)生，使豬體內(nèi)檢不出IFN-α。體外試驗(yàn)證明IFN-α能抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞上增殖[7]。本研究結(jié)果同早期應(yīng)用rPoIFN-α可以活化JAK-STAT通路，從而產(chǎn)生抗病毒蛋白抑制PRRSV的增殖結(jié)論相符。

本試驗(yàn)中每孔rPoIFN-α可以抑制103個(gè)TCID50PRRSV的增殖，PRRSV陽(yáng)性血清在達(dá)到1∶2.35時(shí)也可以完全中和105個(gè)TCID50PRRSV病毒，但在PRRSV陽(yáng)性血清中和效價(jià)在1∶0.588，協(xié)同加上rPoIFN-α，中和PRRSV的能力會(huì)保護(hù)到105個(gè)TCID50PRRSV病毒的3/4的孔數(shù)。其中可以看到單獨(dú)加rPoIFN-α可以保護(hù)103個(gè)TCID50孔未感染。PRRSV陽(yáng)性血清中和效價(jià)1∶1.175，試驗(yàn)孔的保護(hù)未感染趨勢(shì)是一樣的。由此得出rPoIFN-α?xí)鰪?qiáng)PRRSV陽(yáng)性血清中和PRRSV的能力。