齊志濤，方建國，王娥娥，郝蘇云，高艷華，路 榮，趙麗霞， 范秀麗，張燕紅，杜宇榮，宋慶慶，陳九連

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010100)

塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)是近年來新發(fā)的一種豬傳染病，豬感染后發(fā)病癥狀與口蹄疫相似，典型癥狀為鼻盤、蹄冠出現(xiàn)腫脹、水皰或破潰[1]，在臨床上與口蹄疫難以區(qū)分。SVA在我國不同區(qū)域廣泛分布，隨著SVA在豬群當(dāng)中的不斷傳播，其毒力在逐漸減弱，造成豬群發(fā)生亞臨床感染[2]，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展及市場交易。目前我國尚無商品化疫苗用以預(yù)防該病的發(fā)生與傳播，相關(guān)產(chǎn)品還處于研發(fā)階段。在疫苗研發(fā)過程中，產(chǎn)品免疫效力的檢驗(yàn)是至關(guān)重要、不可或缺的環(huán)節(jié)，SVA滅活疫苗的效力檢驗(yàn)主要依靠本動物進(jìn)行。近年來，受非洲豬瘟的影響，豬的買賣和運(yùn)輸受限，造成實(shí)驗(yàn)豬的采購比較困難，導(dǎo)致SVA滅活疫苗的研發(fā)工作受阻。因此，為保障疫苗研發(fā)工作的順利進(jìn)行，同時也積極響應(yīng)3R原則[3]，本研究選用豚鼠和家兔這兩種數(shù)量多、價(jià)格低、運(yùn)輸便捷的動物，開展豚鼠、家兔與豬免疫SVA滅活疫苗后的血清中和抗體相關(guān)性研究，以期在節(jié)約成本、提高效率、保障動物福利的同時，為獸用疫苗效力檢驗(yàn)工作中實(shí)驗(yàn)動物替代方法的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 SVA滅活疫苗(懸浮培養(yǎng)，批號為2019001)、用于做中和試驗(yàn)的SVA病毒液CH/ZZ/2016株、PK-15細(xì)胞(豬腎細(xì)胞)，由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實(shí)驗(yàn)室保存。體重300～500 g的豚鼠和1.5～2.0 kg的家兔各50 只，購自呼和浩特某養(yǎng)殖場；60 日齡以上架子豬15 頭，購自呼和浩特市和林格爾縣某養(yǎng)豬場。

1.2 豚鼠免疫及SVA中和抗體檢測 將50只豚鼠隨機(jī)分為5組，分別以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫劑量對其中4組豚鼠采用腿部肌肉注射方式免疫，1組作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組豚鼠一并采血，分離血清，以《中華人民共和國獸藥典》中的中和試驗(yàn)法[4]測定SVA中和抗體，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式采用log2N表示。

1.3 家兔免疫及SVA中和抗體檢測 將50只家兔隨機(jī)分為5組，分別以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫劑量對其中4組家兔采用腿部肌肉注射方式免疫，1組作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組家兔一并采血，以中和試驗(yàn)法[4]測定SVA中和抗體，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式采用log2N表示。

1.4 豬免疫及SVA中和抗體檢測 選取15頭豬，將其中10頭以最佳免疫方法，即頸部肌肉注射方式免疫2.0 mL SVA滅活疫苗，另外5頭作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組豬一并采血，分離血清，以中和試驗(yàn)法[4]測定SVA中和抗體，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式采用log2N表示。

1.5 豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性分析 分別計(jì)算每組豚鼠及豬免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗體滴度，利用Microsoft Excel軟件對所得結(jié)果進(jìn)行整理，初步分析豚鼠、家兔與豬血清中SVA中和抗體之間的線性關(guān)系，并進(jìn)一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對線性關(guān)系的顯著性進(jìn)行分析。

1.6 家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性分析 分別計(jì)算每組家兔及豬免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗體滴度，利用Microsoft Excel軟件對所得結(jié)果進(jìn)行整理，初步分析豚鼠、家兔與豬血清中SVA中和抗體之間的線性關(guān)系，并進(jìn)一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對線性關(guān)系的顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豚鼠免疫后SVA中和抗體檢測結(jié)果 對照組豚鼠SVA中和抗體滴度為0，豚鼠免疫后SVA中和抗體滴度呈升高趨勢，高劑量免疫組豚鼠SVA中和抗體滴度高于低劑量免疫組；2.0 mL免疫組豚鼠SVA中和抗體上升速度較其他組快，且SVA中和抗體滴度最高，免疫后第28 d豚鼠SVA平均中和抗體滴度可達(dá)210.5，其次為1.0 mL免疫組，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度達(dá)210.3；0.5 mL免疫組在免疫后第28 d平均中和抗體滴度為28.3；0.25 mL免疫組平均抗體滴度最低，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度為26.3；對照組SVA中和抗體滴度為0(圖1)。結(jié)果表明，豚鼠免疫SVA滅活疫苗后，可產(chǎn)生SVA中和抗體，且隨著免疫劑量的增加和時間的延續(xù)，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

2.2 家兔免疫后SVA中和抗體檢測結(jié)果 家兔免疫后SVA中和抗體變化情況與豚鼠免疫后相似，各組家兔在免疫后SVA中和抗體滴度均呈升高趨勢，高劑量免疫組家兔SVA中和抗體滴度高于低劑量免疫組；2.0 mL免疫組家兔SVA中和抗體滴度高于其他組，在免疫后第28 d家兔SVA平均中和抗體滴度達(dá)210.0，其次為1.0 mL免疫組，免疫后第28 d平均中和抗體滴度達(dá)27.5；0.5 mL免疫組在免疫后第28 d平均中和抗體滴度為27.16；0.25 mL免疫組SVA平均中和抗體滴度最低，免疫后第28 d為25.0(圖2)。結(jié)果表明，家兔在免疫SVA滅活疫苗后，也可產(chǎn)生SVA中和抗體，且隨著免疫劑量的增加和時間的延續(xù)，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

圖1 各組豚鼠SVA中和抗體檢測結(jié)果Fig 1 Test results of SVA neutralizing antibodies of guinea pigs

圖2 各組家兔SVA中和抗體檢測結(jié)果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of rabbits

2.3 豬免疫后SVA中和抗體檢測結(jié)果 隨著時間的推移，免疫豬SVA中和抗體滴度逐漸上升，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度可達(dá)28.0，對照組中和抗體為0(圖3)。結(jié)果表明，豬免疫SVA滅活疫苗后可產(chǎn)生SVA中和抗體，且隨著免疫時間的延續(xù)，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

圖3 豬免疫后SVA中和抗體檢測結(jié)果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of pigs

2.4 豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性分析結(jié)果 以豬SVA平均中和抗體值為縱坐標(biāo)，分別以豚鼠0.25 mL免疫組、0.5 mL免疫組、1.0 mL免疫組及2.0 mL免疫組SVA平均中和抗體值為橫坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，繪制豬SVA中和抗體與各免疫組豚鼠SVA中和抗體的回歸曲線，對二者是否存在關(guān)系進(jìn)行初步判斷。圖4結(jié)果顯示，各組豚鼠在免疫后SVA中和抗體在一定程度上與免疫豬SVA中和抗體呈正相關(guān)，其中豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體與免疫豬SVA中和抗體極顯著相關(guān)(R2= 0.9942，P<0.01)；豚鼠0.5 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體顯著相關(guān)(R2= 0.9833，P<0.05)；豚鼠2.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體顯著相關(guān)(R2= 0.9818，P<0.05)；豚鼠0.25 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性不顯著(R2= 0.961，P>0.05)。結(jié)果表明，豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體存在線性相關(guān)關(guān)系，當(dāng)豚鼠免疫劑量為1.0 mL時，可通過線性回歸方程(y= 0.8131x-0.0971)評估該疫苗在豬體的SVA血清中和抗體水平及消長規(guī)律。

圖4 豚鼠與豬SVA中和抗體回歸曲線Fig 4 Regression curve SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對各組豚鼠與豬SVA中和抗體相關(guān)性的差異顯著性，結(jié)果見表1。各組豚鼠免疫后SVA中和抗體效價(jià)均與豬的中和抗體效價(jià)存在一定相關(guān)關(guān)系，其中，豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性最顯著，相關(guān)性為0.990(P<0.01)，屬于極顯著相關(guān)；豚鼠2.0 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性為0.988(P<0.05)，屬于顯著相關(guān)；豚鼠0.5 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性為0.973(P<0.05)，也屬于顯著相關(guān)；豚鼠0.25 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性為0.913(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性最顯著，且這種相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 豚鼠與豬SVA中和抗體相關(guān)性分析Tab 1 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

2.5 家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性分析結(jié)果 以豬SVA平均中和抗體值為縱坐標(biāo)，分別以家兔0.25 mL免疫組、0.5 mL免疫組、1.0 mL免疫組及2.0 mL免疫組SVA平均中和抗體值為橫坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，繪制豬SVA中和抗體與各免疫組家兔SVA中和抗體的回歸曲線，對二者是否存在關(guān)系進(jìn)行初步判斷，結(jié)果見圖5。各組家兔在免疫后SVA中和抗體在一定程度上與免疫豬SVA中和抗體呈正相關(guān)，其中家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體與免疫豬SVA中和抗體極顯著相關(guān)(R2=0.9942，P<0.01)；家兔2.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體極顯著相關(guān)(R2=0.9885，P<0.01)；家兔0.5 mL免疫組、0.25 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體存在線性相關(guān)關(guān)系，當(dāng)豚鼠免疫劑量為1.0 mL時，可通過線性回歸方程(y= 0.813x+0.0971)評估該疫苗在豬體的SVA中和抗體水平及消長規(guī)律。

圖5 家兔與豬SVA中和抗體回歸曲線Fig 5 Regression curve SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對各組家兔與豬SVA中和抗體相關(guān)性緊密程度進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。各組家兔免疫后SVA中和抗體效價(jià)均與豬的中和抗體效價(jià)存在一定相關(guān)關(guān)系，其中，家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性最顯著，相關(guān)性為0.998(P<0.01)，屬于極顯著相關(guān)；家兔2.0 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性為0.988(P<0.05)，也屬于極顯著相關(guān)；家兔0.5 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性為0.859(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)性不顯著；家兔0.25 mL免疫組SVA中和抗體效價(jià)與豬的SVA中和抗體效價(jià)相關(guān)性為0.920(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)性不顯著。結(jié)果表明，家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關(guān)性最顯著，且這種相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論與結(jié)論

應(yīng)用動物試驗(yàn)替代方法對獸用疫苗檢驗(yàn)逐漸發(fā)展為許多研究人員的共識，一些學(xué)者認(rèn)為，動物試驗(yàn)替代方法是疫苗檢驗(yàn)工作的必然發(fā)展趨勢[5]。理論上講，若替代動物對疫苗抗原的血清學(xué)反應(yīng)存在明確的量效關(guān)系，該動物即可成為疫苗效力檢驗(yàn)的替代動物[6]。疫苗的效力檢驗(yàn)不一定必須進(jìn)行本動物攻毒實(shí)驗(yàn)，替代方法建立的關(guān)鍵在于建立與傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法的平行關(guān)系，并且這種平行關(guān)系是穩(wěn)定的，不會隨著產(chǎn)品批次的變化而發(fā)生改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)等效替代，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]。

表2 家兔與豬SVA中和抗體相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

豚鼠和家兔是常用的試驗(yàn)動物，具有價(jià)格低、數(shù)量多、運(yùn)輸便捷等優(yōu)勢。歐洲獸藥典列出多種用豚鼠或家兔替代方法[7]，我國關(guān)于獸用疫苗效力檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)的替代方法也在不斷進(jìn)步，部分疫苗效力檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)中的本體動物逐漸被豚鼠、兔等實(shí)驗(yàn)動物替代[4]。比如，在豬瘟兔化弱毒疫苗的效力檢驗(yàn)中，通過兔體定型熱來代替豬體試驗(yàn)；在豬圓環(huán)病毒2型滅活苗檢驗(yàn)中，通過免疫鼠、兔替代本體動物，從而解決試驗(yàn)動物篩選難的問題[8]。

本研究以豚鼠和家兔為試驗(yàn)動物，以血清學(xué)試驗(yàn)評價(jià)SVA滅活疫苗免疫效力，發(fā)現(xiàn)豚鼠和家兔接種SVA滅活疫苗后，均可產(chǎn)生SVA中和抗體，并且抗體滴度隨著免疫劑量的增加而升高，說明豚鼠與家兔可對該疫苗產(chǎn)生血清學(xué)反應(yīng)，并且血清學(xué)反應(yīng)存在明顯量效關(guān)系，證明了用豚鼠或家兔替代豬檢驗(yàn)SVA滅活疫苗效力的可行性。在進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，豚鼠和家兔在免疫1.0 mL SVA滅活疫苗后，產(chǎn)生的SVA中和抗體與豬產(chǎn)生的SVA中和抗體具有顯著的線性關(guān)系，并且可獲得回歸方程。從而推測，可通過免疫豚鼠或家兔間接反應(yīng)SVA滅活疫苗在豬體的中和抗體水平，但具體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立還需要進(jìn)一步研究。