劉 迪，崔秀文，黃天苗，李美玲，栗孟飛*，魏建和

? 藥材與資源?

當歸抽薹開花過程中赤霉素代謝水平及其關鍵酶基因克隆與表達分析

劉 迪1，崔秀文1，黃天苗1，李美玲1，栗孟飛1*，魏建和2*

1. 甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院 干旱生境作物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070 2. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193

對當歸16個赤霉素（gibberellins，GAs）進行含量測定、GAs代謝酶基因篩選并進行生物信息學分析、關鍵基因克隆及表達驗證，以期為調控當歸抽薹開花提供理論依據(jù)。利用HPLC-MS/MS對不同材料中GAs含量進行測定與分析，基于當歸全長轉錄組篩選直接參與GAs代謝酶基因，利用在線工具進行生物信息學分析，并對關鍵酶基因和表達水平進行qRT-PCR檢測。在所測定的16個GAs中，8個GAs含量在早薹植株中高于非早薹植株，13個GAs含量隨植株發(fā)育時期延長逐漸增加。當歸全長轉錄組中含有9個直接參與GAs代謝的酶基因，可分為6個亞家族，共含有6個保守基序，亞細胞定位于細胞質。和基因克隆片段由于插入序列與全長轉錄組測序片段存在長度差異?；蛟诔檗分仓?、隨種苗春化作用和植株發(fā)育時期延長呈現(xiàn)低表達，而在冷凍規(guī)避春化作用種苗中呈現(xiàn)高表達，基因則相反；和基因在葉和莖中相對于根均呈現(xiàn)高表達。當歸含有9個直接參與GAs代謝的酶基因，各成員理化性質和結構存在一定的差異，和基因表達水平與當歸抽薹開花生理調控一致。

當歸；赤霉素；赤霉素代謝基因；生物信息學；基因克隆；抽薹開花

當歸(Oliv.) Diels為我國大宗中藥材，不僅具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等傳統(tǒng)功效[1]，還具有消炎、抗癌和治療心腦血管疾病等現(xiàn)代藥理學作用[2]。目前，當歸年種植面積達4.35萬hm2[3-4]；然而，栽培生產過程中高達50%的植株早薹開花，使得肉質根木質化，不能入藥[5-6]。

赤霉素（gibberellins，GAs）是一類二萜類化合物，其合成和降解在植物生長發(fā)育過程中起到重要調節(jié)作用[7-8]。目前，在已鑒定出的136種GAs中，GA1、GA3、GA4、GA5、GA6和GA7等具有生物活性[7]；比如，GA4通過調控基因誘導花發(fā)育[9]，GA5和GA6參與花器官分生組織分化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，GAs生物合成主要分為3個階段，在第1階段，牻牛兒牻牛兒焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）先后通過內根-古巴焦磷酸合成酶（-copalyl-diphosphate synthase，CPS）和內根-貝殼杉烯合成酶（-kaurene synthase，KS）環(huán)化為內根-貝殼杉烯（-kaurene）。在第2階段，內根-貝殼杉烯先后通過內根-貝殼杉烯氧化酶（-kaurene oxidase，KO）和內根-貝殼杉烯酸氧化酶（-kaurenoic acid oxidase，KAO）形成GA12-7-醛（GA12-7-aldehyde）。在第3階段，以GA12-7-醛為中心主要由2條途徑合成其他GAs；在第1條途徑中，GA12-7-醛首先被氧化成GA12，其在GA20ox酶的作用下依次形成GA15、GA24和GA9，在GA13ox和GA20ox酶的作用下先后形成GA53、GA44、GA19和GA20；然后，GA9和GA20在GA3ox酶的作用下分別形成具有生物學活性的GA4和GA1，繼而在GA2ox酶的作用下分別形成非活性的GA34和GA8；另外，GA9在GA3ox酶的作用下也可形成GA7，GA20在GA2ox酶的作用下也可形成GA29、或在GA3ox酶的作用下形成GA5；在第2條途徑中，GA12-7-醛先后在GA7ox酶的作用下形成GA14-7-醛和GA14，后者也可形成有活性的GA4[7, 11-12]（圖1）。以上途徑表明，作為GA生物合成的限速步驟，GA2ox和GA20ox酶分別為失活和活性的關鍵酶，GA2ox6酶可以抑制-基因的表達延遲開花[13]；GA20ox1酶可以催化GA12轉變?yōu)镚A9，繼而促進活性GA4和GA7的生物合成促進莖的伸長[14]。

圖1 GAs生物合成途徑及其相關酶

前人研究發(fā)現(xiàn)，外源噴施GA3或抽薹開花過程中，當歸植株GA3含量存在顯著變化[15-16]。對當歸抽薹開花分子調控機制研究發(fā)現(xiàn)，約70個基因通過5條途徑參與抽薹開花，包括春化作用、光周期、自主、年齡、以及GA途徑[17-21]。到目前為止，對當歸抽薹開花過程中多個GAs代謝水平和酶基因生物信息學分析、關鍵酶基因克隆與表達等方面的研究鮮見報道。因此，本研究基于前期當歸全長轉錄組測序結果，開展了16個GAs代謝水平測定、直接參與GAs代謝酶基因生物信息學分析、關鍵酶基因（和）克隆及表達驗證，旨在深入揭示GAs代謝的生物學功能，為有效抑制抽薹開花提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

樣品取自本實驗室?80 ℃保存的岷歸1號兩年生早薹（EB）與非早薹（Un-EB）植株、三年生不同時期［營養(yǎng)生長期（S1）、營養(yǎng)生長到生殖生長過渡期（S2）、抽薹初期（S3）和抽薹伸長期（S4）］植株的葉片和側根，樣品原植物均由甘肅農業(yè)大學栗孟飛教授鑒定為當歸(Oliv.) Diels，植株生長環(huán)境及樣品信息詳見課題組前期實驗[18-19]。GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA7、GA8、GA9、GA14、GA15、GA19、GA20、GA24、GA44、GA51、GA53對照品購自Sigma公司，質量分數(shù)均大于98%，色譜甲醇購自Tedia公司。

1.2 儀器

Aglient 1290型高效液相色譜儀，美國Aglient公司；QTRAP 6500型質譜儀，美國AB公司；UYC-200型全溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造公司；氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司；臺式高速離心機，德國SORVAL公司；ABI QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；超微量分光光度計，上海寶予德科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 GAs含量的測定

2.1.1 赤霉素對照品溶液制備 分別稱取GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA7、GA8、GA9、GA14、GA15、GA19、GA20、GA24、GA44、GA51、GA53對照品，以甲醇為溶劑配制梯度為0.1、0.2、0.5、2、5、20、50和200 ng/mL標準溶液。每個質量濃度2次重復。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取新鮮樣品1.0 g，研磨后加入10 mL乙腈溶液4 ℃震蕩8 h，4 ℃、13 000 r/min離心5 min取上清，沉淀再次加入10 mL乙腈溶液，重復上述操作取上清，合并2次上清液，避光，以氮氣吹干有機相，400 μL甲醇溶解。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 HPLC-MS/MS條件 使用高效液相色譜儀（Aglient 1290）-質譜儀（QTRAP 6500，AB SCIEX）。（1）HPLC條件：色譜柱為Poroshell 120 SB-C18反相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫30 ℃；進樣量2 μL；流動相為甲醇/0.1%甲酸（A）-水/0.1%甲酸（B）；梯度洗脫（0～1 min，20%A；1～9 min，20%～80% A；9～10 min，80% A；10～10.1 min， 80%～20% A，10.1～15 min，20% A）；體積流量1 mL/min。（2）MS條件：采用電噴霧（electron spray ionization，ESI）離子源負離子電離模式，掃描方式為多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，霧化器壓力447.85 kPa，輔助氣壓力482.30 kPa，霧化溫度400 ℃，氣簾氣103.35 kPa，毛細管電壓4500 V。

2.1.4 標準曲線的繪制及含量測定 將“2.1.1”和“2.1.2”項中標準溶液和供試樣品溶液用0.22 μm濾膜濾過，利用HPLC-MS/MS分別檢測標準溶液和供試品溶液的峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標（），GAs質量濃度為橫坐標（）進行線性回歸計算。根據(jù)16個GAs線性回歸方程和相關系數(shù)，表明對照品在0.1～200 ng/mL內線性良好（表1）。

表1 16個GAs的標準曲線

按照公式計算赤霉素含量（）。

＝×/

為GAs的質量濃度，為樣品最終溶解時所用的溶液體積，為稱取的樣品質量

2.1.5 統(tǒng)計分析 每個實驗重復3次，運用SPSS軟件（檢驗）進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析（＜0.05）；使用Origin 2021軟件進行數(shù)據(jù)繪圖。

2.2 GAs關鍵酶基因的生物信息學分析

2.2.1 基因序列來源 數(shù)據(jù)庫來源于不同品種（岷歸1號和岷歸2號）全長轉錄組（NCBI access：PRJNA782300）[22]；岷歸1號種苗春化作用過程中[T1（0 ℃，14 d；未通過春化）、T2（0 ℃，60 d；通過春化）和T3（?3 ℃，125 d；低溫規(guī)避春化)]全長轉錄組（NCBI access：PRJNA789039）[17]。利用關鍵詞“gibberellins”和“GA”直接檢索，初步篩選GA代謝相關基因，去除重復；然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫進行功能鑒定，去除非相關基因。

2.2.2 直接參與GAs代謝相關蛋白質序列鑒定及理化性質分析 蛋白質序列（包括氨基酸長度、相對分子質量和理論等電點）分析利用ExPASy在線工具；亞細胞定位利用Cell-PLoc在線工具；蛋白質二級結構預測利用PRABI-Gerland在線工具；蛋白質3D建模利用Phyre 2在線工具。

2.2.3 直接參與GAs代謝相關蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構建 在NCBI數(shù)據(jù)庫選擇10個物種（擬南芥(L.) Heynh.黃胡蘿卜Hoffm.、藍果樹Oliv.、可可L.、芝麻L.、陸地棉L.、茶樹(L.) O. Kuntze、葡萄L.、煙草L、番茄L）中置信度較高的82個蛋白，利用MEGA11.0軟件鄰接法（neighbor-Joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（重復次數(shù)1000次，其他參數(shù)為默認值）。蛋白質保守基序分析利用MEME軟件，并利用TBtools進行可視化。利用DNAMAN軟件進行蛋白質多序列比對（深藍色表示相似度100%、粉色＞75%、淺藍色＞50%）。

2.3 當歸GA2ox6和GA20ox1基因克隆

以岷歸1號溫室栽培植株功能葉片為材料（T2期，移栽生長40 d）[21]?？俁NA提取利用Plant RNA Kit R6827試劑盒，其純度和濃度檢測使用超微量分光光度計；RNA反轉錄使用First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒得到cDNA；利用NCBI Primer-BLAST設計引物（表2）。擴增產物利用1%TAE瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；膠回收使用瓊脂糖凝膠純化試劑盒TIANgel Midi Purification Kit試劑盒?；蚩寺∈褂闷侥┒丝寺≡噭┖衟HANDY?-Blunt Cloning Kit試劑盒；引物合成及陽性克隆測序由蘭州天啟基因生物科技有限公司完成。

表2 GA2ox6和GA20ox1 PCR擴增和qRT-PCR驗證的引物序列

2.4 當歸GA2ox6和GA20ox1基因表達分析

樣品取自岷歸1號兩年生大田EB和Un-EB植株、三年生不同時期（S1～S4）植株、不同春化期（T1～T3）根莖頂端分生組織[17-19]、以及不同器官（根、莖和葉）。利用NCBI Primer-BLAST設計和基因qRT-PCR表達引物（表2），以作為內參基因[24]。RNA提取及反轉錄參照利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）進行qRT-PCR 檢測。利用2–??Ct法計算和基因的相對表達水平[25]。

3 結果與分析

3.1 當歸兩年生EB和Un-EB植株中GAs含量的變化

通過對兩年生EB和Un-EB植株中16個GAs進行HPLC-MS/MS測定（圖2），以及含量變化進行分析（圖3），結果顯示，除GA1、GA4、GA7和GA24外，12個GAs含量存在顯著差異。EB植株中4個GAs（GA6、GA9、GA14、GA20）含量顯著高于Un-EB植株，增加1.32（GA7）～22.4（GA14）倍；其他8個GAs（GA3、GA5、GA8、GA15、GA19、GA44、GA51和GA53）含量顯著降低，降低0.23 （GA44）～0.67倍（GA8）。

圖2 當歸EB和Un-EB植株提取液HPLC-MS/MS色譜圖

*表示同一GAs在EB與Un-EB植株之間 P＜0.05水平下達到顯著性差異

3.2 當歸三年生不同生長期植株中GAs含量的變化

通過對三年生不同生長期（S1、S2、S3和S4）植株中16個GAs進行HPLC-MS/MS測定（圖4），以及含量變化進行分析（圖5），結果顯示，16個GAs含量也存在較大差異，在S1～S4時期，GA19含量最高（9.34 ng/g），依次為GA6（3.78 ng/g）和GA24（3.45 ng/g）。S4相對于S1，14個GAs（GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA8、GA9、GA15、GA19、GA20、GA24、GA44、GA51和GA53）增加1.35（GA4）～7.18（GA9）倍，而GA14和GA7分別下降0.36和0.96倍。除GA3、GA7和GA14外，13個GAs含量隨生長時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加且在S4時期達到最大，而GA3、GA7和GA14分別在S2、S3和S2時期達到最大（圖5）。

3.3 參與當歸GAs代謝的關鍵酶基因生物信息學

3.3.1 當歸GAs代謝相關基因鑒定及理化性質 通過對當歸不同品種葉片和葉柄、種苗春化作用過程中根莖頂端分生組織的全長轉錄組進行篩選，發(fā)現(xiàn)有9個基因直接參與和18個基因間接參與GAs代謝（表3）。進一步對直接參與GAs代謝基因所編碼的蛋白質序列和亞細胞定位分析，結果顯示，9個蛋白質序列長度為189（GA2ox1-2）～552（GA2ox8）、相對分子質量為21 550～63 400、等電點為5.47（GA3ox2）～8.68（GA2ox8），亞細胞均定位于細胞質（表4）。

圖4 當歸三年生不同生長期植株提取液HPLC-MS/MS色譜圖

*表示同一GAs在S1和S4之間P＜0.05水平下達到顯著性差異

表3 當歸全長轉錄組中直接和間接參與GAs代謝的基因

表4 直接參與當歸GAs代謝蛋白質的特征及亞細胞定位

3.3.2 直接參與當歸GAs代謝蛋白質的結構分析 通過對9個直接參與GAs代謝基因所編碼的蛋白質進行二級結構預測以及3D建模，結果顯示，蛋白質二級結構由α螺旋、延伸鏈、β轉角和無規(guī)則卷曲組成（表5），無規(guī)則卷曲是構成二級結構的主要組成部分，占比30.25%（GA2ox8）～45.56%（GA2ox1-1），其次是α螺旋和延伸鏈，分別占比27.76%（GA2ox7）～41.12%（GA2ox8）和15.20%（GA3ox2）～22.22%（GA2ox1-2）；有些蛋白質三級結構較為相似（如GA20ox1和GA20ox3），但有些空間結構差異較大（如GA2ox1-2、GA2ox6和GA20ox1等）（圖6）。

表5 直接參與當歸GAs代謝9個蛋白質的二級結構

圖6 直接參與當歸GAs代謝9個蛋白質的三級結構

3.3.3 直接參與當歸GAs代謝蛋白質的進化樹構建 通過對9個直接參與當歸GAs代謝蛋白質、以及模式植物擬南芥等10個物種的82個GAs代謝蛋白質進行系統(tǒng)進化樹構建，基于蛋白質序列相似性，這91個蛋白質被分成6個亞族Group I～VI，其中GA2ox6和GA20ox1分別位于GroupI和GroupIII亞族（圖7）。

3.3.4 直接參與當歸GAs代謝的蛋白質基序 通過對以上91個蛋白質進行結構域和基序分析，結果發(fā)現(xiàn)，這91個蛋白質分為6個亞族，與系統(tǒng)進化樹關系一致（圖7），序列含有6個保守基序（表6）；直接參與當歸GAs代謝的同一亞家族蛋白質基序具有高度相似性，其中，GA2ox6亞族均含有Motif 1～Motif 4和Motif 6；GA20ox1亞族均含有Motif 1～Motif 6；而不同亞族蛋白質基序存在較大差異，比如，Motif 5只存在于Group III亞族（圖8）。

圖7 當歸和擬南芥等11個物種GAs代謝蛋白質的系統(tǒng)進化樹

表6 直接參與GAs代謝蛋白質6個保守基序及其序列

3.3.5 當歸GA2ox6和GA20ox1蛋白質多序列比對 通過將當歸AsGA2ox6和AsGA20ox1與NCBI中擬南芥和黃胡蘿卜等物種中同源性較高的5個蛋白質進行多序列比對，結果顯示，GA2ox6與同科黃胡蘿卜同源性最高，相似性達到89.74%（XP_017243791.1），依次為藍果樹71.55%（KAA8532306.1）、茶樹68.84%（AVZ45857.1）、煙草66.57%（XP_019242512.1）和番茄65.98% （XP_004237179.2）（圖9-A）；GA20ox1也與黃胡蘿卜同源性最高，達到82.95%（XP_017239190.1），依次為番茄69.13%（NP_001234070.1）、芝麻67.94%（XP_011076268.1）、藍果樹67.09%（KAA8539854.1）和煙草66.33%（XP_019225201.1）（圖9-B）。

圖8 當歸和擬南芥等11個物種GAs代謝蛋白質的保守基序

3.4 當歸GA2ox6和GA20ox1基因克隆

為了保證全長轉錄組中當歸和基因堿基序列的準確性，基于全長轉錄組中和基因堿基序列設計擴增引物，以岷歸1號功能葉片中RNA反轉錄所得的cDNA為模板，進行和基因克隆。瓊脂糖凝膠電泳顯示，和基因擴增片段大小為1000～2000 bp（圖10）；產物回收與堿基測序顯示，基因克隆長度為1477 bp（458 bp和777 bp處插入了95 bp和370 bp）；基因克隆長度為1455 bp（558 bp和880 bp處插入了108 bp和199 bp）；通過與全長轉錄組測序獲得的和進行序列比對，除了插入2個片段外，其他相似度為100%（圖11）。

圖9 當歸GA2ox6（A）和GA20ox1（B）蛋白質與5個其他物種蛋白質的多序列比對

圖10 當歸GA2ox6和GA20ox1基因擴增產物

3.5 當歸GA2ox6和GA20ox1基因表達分析

為了進一步驗證和基因的生物學功能，對當歸不同材料中和基因的表達水平進行了qRT-PCR檢測與分析，結果（圖12）顯示，EB相對于Un-EB，呈現(xiàn)低表達，而呈現(xiàn)高表達；不同生長期植株中，表達水平隨著時間延長呈現(xiàn)逐漸降低，而呈現(xiàn)逐漸增加；不同春化期種苗根莖頂端分生組織中，T2相對T1，表達水平降低，而T3相對T1表達增加，而則相反；不同器官中，和在莖和葉相對于根均呈現(xiàn)高表達。

圖11 當歸GA2ox6(A)和GA20ox1 (B) 基因克隆與全長轉錄組測序的序列比對

圖12 當歸GA2ox6和GA20ox1基因在不同材料中的相對表達水平

4 討論

目前，EB開花導致根木質化不能入藥仍是困擾當歸生產、質量和效益提升的重大難題[4]。大量研究表明，GA調控植物生長發(fā)育過程——種子萌發(fā)、莖的伸長、花的發(fā)育、果實的形成和種子的發(fā)育，其含量的變化受到特定環(huán)境因素和生物合成酶基因的影響[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，16個GAs含量在當歸EB相對于Un-EB植株、不同生長發(fā)育時期植株中存在顯著差異；基于當歸全長轉錄組，發(fā)現(xiàn)9個基因直接參與GAs代謝；另外，克隆獲得的關鍵酶基因和表達水平與相應的GAs代謝水平一致。

大量研究表明，GA最顯著的作用是通過促進細胞伸長和分裂進而誘發(fā)植物莖的伸長[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，外源噴施GA3可顯著促進當歸提前抽薹開花[15]；在抽薹分化前期植株中含量較高[16]；在種苗春化作用過程中顯著升高，而冷凍回避春化作用顯著降低[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，GA3含量在EB植株低于Un-EB植株，生長發(fā)育過程中S1～S4時期呈“上升-下降-上升”趨勢，這與前人的研究結果存在一定差異。可能原因是：S1～S2時期植株處于生長旺盛階段，植株營養(yǎng)物質積累有利于GA3的生物合成，進而誘發(fā)抽薹，當植株開始抽薹，較多的GA3轉運至莖，促進花器官形成和果實發(fā)育[26]。另外，研究證實在菠菜中噴施赤霉素抑制劑BX-112，導致了GA1和GA8水平降低從而積累了GA20，抑制菠菜莖的伸長。這與本研究結果一致，在當歸發(fā)育過程中GA1、GA4和GA20逐漸升高。較高的GA1通過促進細胞分裂來增加頂端分生組織的生命活力使節(jié)間數(shù)增多，同時促進微管組織和葉片發(fā)育，從而加速植物生長速率促進抽薹[27]。然而，GA4在調控抽薹開花過程中，集中在花器官中，調控雄蕊的發(fā)育等，因此葉片和側根GA4含量可能低于其它GAs[9]。此外，活性GAs（如GA1、GA4、GA6和GA7）在EB植株中顯著高于Un-EB植株，而非活性GAs相反；在不同生長期16個GAs中，除GA3、GA7和GA14外，13個GAs隨生長發(fā)育時間延長含量逐漸增加。

為了進一步了解GAs參與當歸抽薹開花的機制，本研究對9個直接參與GAs代謝基因進行了生物信息學分析和關鍵基因克隆及表達驗證。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥含有16個GA氧化酶基因（和）[28]；蘋果含有41個GA氧化酶基因（，和）[29]；葡萄含有24個GA氧化酶基因（、和）[30]。本研究基于當歸全長轉錄組，發(fā)現(xiàn)有9個GA氧化酶基因（、、、和-3）。本課題組獲得的9個GA氧化酶與擬南芥、蘋果和葡萄等[28-30]氧化酶二級結構基本一致；蘋果、葡萄和黃瓜等[29-31]其他物種亞細胞定位于細胞核或細胞質，本研究中的有9個GA氧化酶均定位于細胞質。

通過對擬南芥、蘋果和葡萄等[28-30]物種研究發(fā)現(xiàn)，GA2ox、GA3ox和GA20ox基因家族根據(jù)結構的差異分布在不同的亞族中，表明植物GA氧化酶基因進化關系相近的保守結構相似，同一亞族在進化上具有一定的保守性，且進化關系越近的亞族，其保守基序的同源性越高。本研究基于系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，GA20ox1和GA20ox3位于GroupⅢ亞族，而GA2ox1-1、GA2ox7和GA3ox2位于GroupⅣ亞族，其中，GA20ox1和GA20ox3含有相同的保守基序（Motif 1～6），而GA2ox1-1、GA2ox7和GA3ox2含有相同的保守基序（Motif 1～3，Motif 6）。同時，本研究中當歸GA2ox6和GA20ox1蛋白質序列與同科植物胡蘿卜的相似度最高，親緣關系最近。另外，基因克隆獲得的和序列與轉錄組結果存在一定差異，表明本研究所獲得的序列可能尚不完整。

在當歸EB相對Un-EB植株研究中發(fā)現(xiàn)，基因表達量較高，而基因表達量沒有顯著變化[21]；本研究發(fā)現(xiàn)，基因在EB植株中低表達，這與GA8在EB植株中含量低于Un-EB植株的結果一致；基因在EB植株中高表達，這與GA1、GA4、GA9和GA20在EB植株中含量低于高于Un-EB植株的結果一致。在植物不同器官研究中發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜中基因主要在根和葉中表達[32]，擬南芥中基因在葉中表達量顯著高于根[33]，枳橙中主要在節(jié)間、葉片和種子中表達[34]，黃瓜中基因在葉中表達量顯著高于根和莖[31]，這與本研究中當歸和基因表達量在葉＞莖＞根的結果一致。同時，在本研究不同生長期發(fā)現(xiàn)，基因表達量隨植株生長發(fā)育時期延長和在種苗春化作用中顯著降低，在冷凍回避春化作用種苗中顯著升高，而基因表達量相反。大量研究表明，GA2ox6通過催化GA20、GA4和GA1分別形成非活性的GA29、GA34和GA8調節(jié)植株抽薹開花[32]；因此，本研究不同材料中參與GAs酶基因表達量的變化，會直接引起相應GAs含量水平的變化，最終呈現(xiàn)出抽薹開花的生理差異。

綜合以上研究表明，本實驗首次對當歸抽薹開花過程中16個GAs含量進行了測定、對篩選的9個直接參與GAs代謝的酶基因進行了生物信息學分析、并對關鍵酶基因（和）進行了克隆及表達驗證。但對關鍵酶基因（和）片段的完整性、以及其它GAs生物合成相關基因（如、和）的生物學特性等還需要進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on gibberellins metabolic level, key enzyme genes clone and expression pattern during bolting and flowering plants in

LIU Di1, CUI Xiu-wen1, HUANG Tian-miao1, LI Mei-ling1, LI Meng-fei1, WEI Jian-he2

1. College of Life Science and Technology/Key Laboratory of Aridland Crop Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To determine the contents of 16 gibberellins (GAs), screen the genes involved in GAs metabolism and analyze their bioinformatics, as well as clone the key genes and validate their expression level, so as to provide theoretical basis for regulating bolting and flowering of.The GAs contents in different materials were determined by HPLC-MS/MS. The genes directly involved in GAs metabolism were screened based on the full-length transcriptomes of, the bioinformatics was analyzed using the online tools, and the expression levels of theandgenes were validated by qRT-PCR.Among of the 16 GAs, the contents of eight GAs were higher in bolted plants than unbolted plants, and the contents of 13 GAs were increased with the extension of plant development. A total of nine genes directly involved in GAs metabolism were identified from, with six subfamily classified, six motifs included, and the sub-cellular located in the cytoplasm. There was a certain difference in the base sequences between the cloned fragment ofandwith the full-length transcriptomes, due to the inserted fragments in the sequence ofand. The expression levels ofgene were down-regulated in the bolted plants compared to unbolted plants, and with the extension of seedlings vernalization and plants development, while up-regulated in the seedlings with frozen-avoided vernalization; but thegene showed opposite results; and the expression levels ofandgenes in leaves and stems were higher than roots.There are nine genes directly involved in GAs metabolism in, and certain differences in physical and chemical properties and structure among the nine members; the expression levels of theandgenes are in accordance with the physiological regulation of bolting and flowering of.

(Oliv.) Diels; gibberellins; gibberellins metabolic gene; bioinformatics; gene clone; bolting and flowering

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0222 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.024

2022-05-06

國家自然科學基金項目（32160083）；干旱生境作物學國家重點實驗室（甘肅農業(yè)大學）基金項目（GSCS-2021-Z03）；道地藥材生態(tài)種植與質量保障項目（202103003）；財政部和農業(yè)農村部：國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS-21）

劉 迪（1997—），女，山西運城人，碩士研究生，主要從事當歸抽薹開花調控方面研究。E-mail: liudi9728@163.com

通信作者：栗孟飛（1980—），男，河南駐馬店人，博士，教授，主要從事藥用植物學研究。E-mail: lmf@gsau.edu.cn

魏建和（1970—），男，福建建陽人，博士，教授，主要從事藥用植物栽培、分子育種和次生代謝產物調控研究。E-mail: jhwei@implad.ac.cn

[責任編輯 時圣明]