張洪偉，焦義然，陳文燁，董福雙，杜進民，王海波，周 碩

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北保定 071001；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北石家莊 050051；3.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050051)

禾谷類作物的抽穗期是其發(fā)育完全的幼穗從旗葉中抽出的時間，是決定其產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。在六倍體小麥中，該性狀主要受到三類因素的影響，即春化需求、光周期敏感性以及自身早熟性。春化需求是小麥需要經(jīng)歷長時間的低溫才能開花的性質(zhì)；光周期敏感性是小麥只有在合適的光周期條件下才能開花的性質(zhì)；滿足春化需求和光周期條件后，不同小麥品種間的抽穗期仍有差異，這些差異由自身早熟性(earliness，Eps)決定。

在小麥中，關(guān)鍵的春化調(diào)控基因包括、以及，其中和是開花促進基因，是開花抑制基因。小麥基因主要在頂端分生組織和葉片中表達，隨春化時間的持續(xù)而逐漸上調(diào)，是擬南芥定的同源基因；VRN1蛋白可以直接結(jié)合基因的啟動子，在長日照條件下促進基因在葉片維管束細(xì)胞中的大量表達。作為擬南芥Flowering Locus T(FT)的同源蛋白，小麥VRN3被運輸?shù)巾敹朔稚M織(shoot apical meristem，SAM)，同F(xiàn)lowering Locus D-like 2(FDL2)和14-3-3蛋白互作，進一步促進表達。小麥VRN1在促進表達的同時，還可以結(jié)合的啟動子，直接抑制其表達，從而解除該基因?qū)π←滈_花的抑制作用。小麥及均可被長日照誘導(dǎo)，而且，VRN2可與CONSTANS 2(CO2)競爭結(jié)合Heme Activator Protein 3(HAP3)蛋白，形成VRN2/HAP3/HAP5三元復(fù)合物，解除CO2對表達的促進作用，只有當(dāng)被春化所抑制時，CO2才可以結(jié)合啟動子而促進開花。

除、及基因外，還有其他基因和小麥春化有關(guān)。小麥的是擬南芥關(guān)鍵春化基因()的同源基因，是春化相關(guān)的開花抑制基因，可被抑制。擬南芥中Vernalization-Insensitive 3(VIN3)所介導(dǎo)的染色質(zhì)甲基化狀態(tài)改變是導(dǎo)致擬南芥FLC表達變化的主要原因之一，在小麥中發(fā)現(xiàn)，的同源基因()、和的表達均被春化上調(diào)。另外，小麥Vernalization-related 2(VER2)可與Glycine-rich RNA Binding Protein 2(GRP2)結(jié)合，解除GRP2對小麥表達的抑制，促進開花。

植物可以通過預(yù)期周期性的(約24 h)環(huán)境變化協(xié)調(diào)自身生物進程，以更適應(yīng)外界環(huán)境，這個過程依賴于植物精確的晝夜節(jié)律(Circadian rhythm)，這種節(jié)律主要由依次表達的5個Pseudo-Response Regulator(PRR)基因及部分冗余基因Circadian Clock-Associated 1(CCA1)和Late Elongated Hypocotyl(LHY)共同維持，這些基因與GIGANTEA(GI)、LUX ARRHYTHMO(LUX)、Early Flowering 3(ELF3)、ELF4等基因相互作用，構(gòu)成了極其復(fù)雜的基因表達反饋網(wǎng)絡(luò)，進而調(diào)節(jié)()表達。光照可以使CO蛋白更穩(wěn)定，在黑暗條件下CO蛋白被泛素蛋白酶體所降解，因此只有在白天表達才能促進和()表達，并導(dǎo)致提前開花。在小麥中，基因沉默導(dǎo)致小麥不能開花；表達受光周期和生理節(jié)律調(diào)控，其在擬南芥中的過表達導(dǎo)致擬南芥提早開花，且在缺失突變體(與野生型擬南芥相比明顯延遲開花)中恢復(fù)了其野生表型；小麥()在擬南芥中的過表達導(dǎo)致其在短日照條件下延遲開花，而沉默導(dǎo)致小麥在長日照和短日照條件下均提早開花；和擬南芥中基因是開花過程中關(guān)鍵光周期響應(yīng)基因不同，小麥(，擬南芥的同源基因)決定了小麥開花過程中的光周期響應(yīng)；長日照條件下雙突變體(為野生型或顯性突變體)比野生型提前3 d開花，說明TaPPD1蛋白存在時，CO1和CO2甚至輕微抑制開花。

為進一步了解溫度和光照對小麥開花的影響機制，分別在光照及黑暗條件下對小麥進行春化，分析兩種條件下部分開花相關(guān)基因的表達情況，旨在明確光照對小麥的春化效應(yīng)及分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其處理

以小麥中麥175為試驗材料，選取大小一致、籽粒飽滿的種子，用75%酒精處理1 min，2%次氯酸鈉處理10 min，用無菌水沖洗3次；于 22 ℃、黑暗條件下催芽24 h，將催芽的種子播種于營養(yǎng)土和蛭石1∶1混合的基質(zhì)中，于22 ℃、光照條件下(16 h光照/8 h黑暗光周期，光照強度約4 000 lx)培養(yǎng)7 d(二葉期)；分別于上述光照條件和黑暗條件下，于4 ℃春化28 d。分別在春化0、7、14、21及28 d取10株材料，重復(fù)3次。將全部葉片經(jīng)過液氮速凍后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將剩余的小麥植株移栽到溫室中，?2 ℃、上述光照條件下繼續(xù)生長，統(tǒng)計抽穗時間，并于抽穗后統(tǒng)計植株主莖葉片數(shù)及株高。

1.2 RNA提取及cDNA合成

使用EasyPure Plant RNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取1.1中-80 ℃保存葉片的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，Nano Drop 2000(Thermo Fisher Scientific)檢測/值及RNA濃度。將總RNA稀釋至500 ng·μL，使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]合成cDNA，將其稀釋10倍作為Real-time PCR模板。

1.3 Real-time PCR

在NCBI上下載各相關(guān)參考序列，并在Ensembl Plants網(wǎng)站上(http://plants.ensembl.org/Multi/Tools/Blast)進行blastn分析，獲得在小麥中國春3個亞基因組上的對應(yīng)序列；根據(jù)這些序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計對應(yīng)的Real-time PCR引物(表1)。利用作為內(nèi)參基因，在 ABI 7500 Real-Time PCR System(Thermo Scientific)上進行Real-time PCR。使用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒。擴增體系20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，正反向引物(10 μmol·L)各0.6 μL，cDNA模板5 μL，RNase-Free ddHO 3.4 μL；擴增程序為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，按各自退火溫度退火 30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；溶解曲線分析程序： 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，緩慢升溫至95 ℃并持續(xù)30 s，60 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)分析采用2-△△C方法。

表1 供試引物及其序列Table 1 Primers used in this study and their sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 光照春化與暗春化對小麥表型的影響

表型分析結(jié)果表明，春化結(jié)束時，小麥處于三葉期，暗春化及光照春化的小麥表型沒有明顯差異。光照春化植株的平均抽穗期為100.53 d，而暗春化為120.27 d，比光照春化晚19.73 d，二者差異極顯著(< 0.01)。完成抽穗后，光照春化植株的平均主莖葉片數(shù)為6.5片，而暗春化植株的平均主莖葉片數(shù)為8.0片，二者差異極顯著 (<0.01)；光照春化植株的平均株高為32.43 cm，而暗春化植株的平均株高為28.86 cm，二者差異顯著(<0.05)。

2.2 光照春化及暗春化對小麥春化相關(guān)基因表達的影響

在春化前表達量很低，隨著春化的進行，其表達量迅速上調(diào)；在光照條件下，其上升幅度明顯高于黑暗條件(圖1A)。在春化前表達量相對較高，春化顯著抑制該基因的表達，其在暗春化下的表達量更低(圖1B)。隨著暗春化的持續(xù)而逐漸上調(diào)表達，并在春化21 d時達到峰值，隨后表達下調(diào)；在光照條件下，該基因在春化7 d時即達到表達峰值，至春化28 d時明顯較低；該基因在暗春化條件下的表達量比光照春化更高(圖1C)。在供試材料中均未被檢測出。

在光照春化條件下表達水平顯著高于春化前，但在暗春化條件下，僅在春化7 d時表達量顯著上調(diào)，春化更長時間與春化前相比沒有顯著差異(圖1E)。在光照春化7 d時表達水平較春化前有所下降，隨春化繼續(xù)進行，其表達水平恢復(fù)至春化前水平；暗春化導(dǎo)致其表達量較春化前顯著降低(圖1F)。在光照春化條件下總體表現(xiàn)為上調(diào)表達(僅在春化21 d時表達輕微下調(diào))，其在暗春化條件下的表達沒有明顯的規(guī)律(圖1G)。整體而言，、、在光照春化時表達量顯著高于暗春化(圖1E～圖1G)。

VL：光照春化；VD：暗春化。圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

隨著春化的持續(xù)，表達水平逐漸升高，其在光照條件下的上升幅度明顯高于黑暗條件，且黑暗條件下春化14 d后其表達已趨于穩(wěn)定(圖1D)。

2.3 光照春化及暗春化對小麥光周期基因表達的影響

較春化前而言，在光照春化條件下，表達水平顯著下降(圖2A)；表達僅在光照春化7 d時明顯降低，其他時間與春化前無明顯變化(圖2B)；光照春化導(dǎo)致表達水平顯著降低，但春化28 d時其表達水平恢復(fù)到春化前水平(圖2C)。在暗春化條件下，、以及表達較之春化前均顯著降低，且其表達量顯著低于光照春化(圖2A～圖2C)。

春化導(dǎo)致表達顯著上調(diào)，其表達水平達到峰值后逐漸下降，但光照春化和暗春化下該基因表達達到峰值的時間不同(光照春化21 d，暗春化14 d)，且光照春化的表達峰值高于暗春化(圖2D)；在光照春化及暗春化條件下表達量均顯著降低，但在暗春化條件下降低程度更高(圖2E)；在光照春化及暗春化條件下表達量上升，且在光照春化條件下表達量上升幅度更高(圖2F)。

圖2 光周期基因在光照春化及暗春化過程中的表達

3 討 論

表達在光照春化和暗春化條件下均逐漸上升，但光照春化導(dǎo)致其上升幅度更明顯(春化28 d時，光照春化表達量是暗春化條件下的4.5倍)；受到光照春化及暗春化的強烈抑制，但暗春化條件下的抑制效果更強；光照春化和暗春化過程中均未檢測到表達；由于抑制表達，在光照春化過程中的迅速表達受到、及低溫以外因素的影響。在小麥中，TaVRN3、14-3-3和TaFDL2蛋白組成六聚體FAC復(fù)合物(florigen activation complex)，結(jié)合啟動子并調(diào)控其表達。在六倍體小麥中至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了46個情況基因，17個基因，以及5個基因；這些基因家族成員廣泛互作，產(chǎn)生了大量的FAC復(fù)合體，在不同組織及發(fā)育階段響應(yīng)不同的FT-like信號；在春化過程中，可能存在這樣的FT-like信號，迅速誘導(dǎo)的表達。另一類開花相關(guān)蛋白(MADS-box)形成同源或異源四聚體，結(jié)合靶基因啟動子CArG-box元件并調(diào)控其表達。如MADS-box蛋白Vegetative to Reproductive Transition 2(TaVRT2)結(jié)合啟動子，并抑制的表達；另一種MADS-box蛋白HvVRN1的染色質(zhì)免疫共沉淀測序(ChIP-seq，chromatin immunoprecipitation sequencing)在大麥基因組中獲得了514個含CArG-box元件的結(jié)合位點，37個包含這些位點的基因受HvVRN1的調(diào)控；鑒于啟動子包含CArG-box元件，可能在春化過程中受到其他基因的誘導(dǎo)。還需要更多的試驗，來明確光照春化過程中導(dǎo)致顯著上調(diào)的基因。

中麥175中，被光照春化和暗春化上調(diào)，不符合其抑制開花的功能。在小麥和短柄草中，有些品種的被春化上調(diào)，有些品種被春化下調(diào)；該基因可能參與了某種反饋調(diào)節(jié)，靈活微調(diào)植物對春化作用的響應(yīng)能力。CO1/CO2/PPD1可能存在相似的反饋調(diào)節(jié)：長日照、突變體背景下，突變導(dǎo)致小麥明顯晚花；過表達導(dǎo)致長日照和短日照下大麥提前開花，說明是開花促進基因。長日照條件下及的同時缺失導(dǎo)致大麥開花顯著延遲，說明是開花促進基因；本試驗中、以及在光照春化條件下表達量明顯高于暗春化，也說明了這三個基因促進開花。長日照條件下、和的表型貢獻率說明是主要的開花促進基因，長日照條件下小麥突變體比雙突變體開花明顯延遲進一步證明了這個結(jié)果。然而PPD1蛋白存在時，和同時突變導(dǎo)致小麥在長日照和短日照條件下均提早開花，不符合它們促進開花的功能，暗示了CO1和CO2可能通過靈活微調(diào)參與的長日照促進開花過程。

在小麥中發(fā)現(xiàn)了3個同源基因，其中和在光照春化條件下上調(diào)表達，可能調(diào)控春化過程中組蛋白甲基化狀態(tài)，促進開花。是、的同源基因；和參與了擬南芥的染色質(zhì)組蛋白甲基化修飾，抑制春化過程中的表達，促進開花。在春化過程中逐漸上調(diào)，但不受春化過程調(diào)控，而被短日照條件誘導(dǎo)，抑制()基因表達，不依賴于促進擬南芥在短日照條件下開花。雖然和親緣關(guān)系較近，但僅有在暗春化條件下顯著下調(diào)，而與前人研究不同，在光照春化條件下其總體表達差異不明顯，因而可能參與了類似于擬南芥基因不依賴于的短日照促進開花過程。

4 結(jié) 論

光照春化比暗春化更有利于小麥開花；光照春化條件下，、、、、、、、、、、和的表達水平高于暗春化。推測光照和低溫通過影響生理節(jié)律基因的表達來調(diào)控下游基因的表達，其中一些基因(如、及一些未知基因)通過調(diào)控表達調(diào)控小麥開花；和表觀調(diào)控有關(guān)的基因同樣受到光照和低溫的調(diào)控。