張洪偉，焦義然，陳文燁，董福雙，杜進(jìn)民，王海波，周 碩

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北保定 071001；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北石家莊 050051；3.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050051)

禾谷類作物的抽穗期是其發(fā)育完全的幼穗從旗葉中抽出的時(shí)間，是決定其產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。在六倍體小麥中，該性狀主要受到三類因素的影響，即春化需求、光周期敏感性以及自身早熟性。春化需求是小麥需要經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的低溫才能開花的性質(zhì)；光周期敏感性是小麥只有在合適的光周期條件下才能開花的性質(zhì)；滿足春化需求和光周期條件后，不同小麥品種間的抽穗期仍有差異，這些差異由自身早熟性(earliness，Eps)決定。

在小麥中，關(guān)鍵的春化調(diào)控基因包括、以及，其中和是開花促進(jìn)基因，是開花抑制基因。小麥基因主要在頂端分生組織和葉片中表達(dá)，隨春化時(shí)間的持續(xù)而逐漸上調(diào)，是擬南芥定的同源基因；VRN1蛋白可以直接結(jié)合基因的啟動(dòng)子，在長(zhǎng)日照條件下促進(jìn)基因在葉片維管束細(xì)胞中的大量表達(dá)。作為擬南芥Flowering Locus T(FT)的同源蛋白，小麥VRN3被運(yùn)輸?shù)巾敹朔稚M織(shoot apical meristem，SAM)，同F(xiàn)lowering Locus D-like 2(FDL2)和14-3-3蛋白互作，進(jìn)一步促進(jìn)表達(dá)。小麥VRN1在促進(jìn)表達(dá)的同時(shí)，還可以結(jié)合的啟動(dòng)子，直接抑制其表達(dá)，從而解除該基因?qū)π←滈_花的抑制作用。小麥及均可被長(zhǎng)日照誘導(dǎo)，而且，VRN2可與CONSTANS 2(CO2)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Heme Activator Protein 3(HAP3)蛋白，形成VRN2/HAP3/HAP5三元復(fù)合物，解除CO2對(duì)表達(dá)的促進(jìn)作用，只有當(dāng)被春化所抑制時(shí)，CO2才可以結(jié)合啟動(dòng)子而促進(jìn)開花。

除、及基因外，還有其他基因和小麥春化有關(guān)。小麥的是擬南芥關(guān)鍵春化基因()的同源基因，是春化相關(guān)的開花抑制基因，可被抑制。擬南芥中Vernalization-Insensitive 3(VIN3)所介導(dǎo)的染色質(zhì)甲基化狀態(tài)改變是導(dǎo)致擬南芥FLC表達(dá)變化的主要原因之一，在小麥中發(fā)現(xiàn)，的同源基因()、和的表達(dá)均被春化上調(diào)。另外，小麥Vernalization-related 2(VER2)可與Glycine-rich RNA Binding Protein 2(GRP2)結(jié)合，解除GRP2對(duì)小麥表達(dá)的抑制，促進(jìn)開花。

植物可以通過預(yù)期周期性的(約24 h)環(huán)境變化協(xié)調(diào)自身生物進(jìn)程，以更適應(yīng)外界環(huán)境，這個(gè)過程依賴于植物精確的晝夜節(jié)律(Circadian rhythm)，這種節(jié)律主要由依次表達(dá)的5個(gè)Pseudo-Response Regulator(PRR)基因及部分冗余基因Circadian Clock-Associated 1(CCA1)和Late Elongated Hypocotyl(LHY)共同維持，這些基因與GIGANTEA(GI)、LUX ARRHYTHMO(LUX)、Early Flowering 3(ELF3)、ELF4等基因相互作用，構(gòu)成了極其復(fù)雜的基因表達(dá)反饋網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而調(diào)節(jié)()表達(dá)。光照可以使CO蛋白更穩(wěn)定，在黑暗條件下CO蛋白被泛素蛋白酶體所降解，因此只有在白天表達(dá)才能促進(jìn)和()表達(dá)，并導(dǎo)致提前開花。在小麥中，基因沉默導(dǎo)致小麥不能開花；表達(dá)受光周期和生理節(jié)律調(diào)控，其在擬南芥中的過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥提早開花，且在缺失突變體(與野生型擬南芥相比明顯延遲開花)中恢復(fù)了其野生表型；小麥()在擬南芥中的過表達(dá)導(dǎo)致其在短日照條件下延遲開花，而沉默導(dǎo)致小麥在長(zhǎng)日照和短日照條件下均提早開花；和擬南芥中基因是開花過程中關(guān)鍵光周期響應(yīng)基因不同，小麥(，擬南芥的同源基因)決定了小麥開花過程中的光周期響應(yīng)；長(zhǎng)日照條件下雙突變體(為野生型或顯性突變體)比野生型提前3 d開花，說明TaPPD1蛋白存在時(shí)，CO1和CO2甚至輕微抑制開花。

為進(jìn)一步了解溫度和光照對(duì)小麥開花的影響機(jī)制，分別在光照及黑暗條件下對(duì)小麥進(jìn)行春化，分析兩種條件下部分開花相關(guān)基因的表達(dá)情況，旨在明確光照對(duì)小麥的春化效應(yīng)及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其處理

以小麥中麥175為試驗(yàn)材料，選取大小一致、籽粒飽滿的種子，用75%酒精處理1 min，2%次氯酸鈉處理10 min，用無(wú)菌水沖洗3次；于 22 ℃、黑暗條件下催芽24 h，將催芽的種子播種于營(yíng)養(yǎng)土和蛭石1∶1混合的基質(zhì)中，于22 ℃、光照條件下(16 h光照/8 h黑暗光周期，光照強(qiáng)度約4 000 lx)培養(yǎng)7 d(二葉期)；分別于上述光照條件和黑暗條件下，于4 ℃春化28 d。分別在春化0、7、14、21及28 d取10株材料，重復(fù)3次。將全部葉片經(jīng)過液氮速凍后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩⑹Ｓ嗟男←溨仓暌圃缘綔厥抑?，?2 ℃、上述光照條件下繼續(xù)生長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)抽穗時(shí)間，并于抽穗后統(tǒng)計(jì)植株主莖葉片數(shù)及株高。

1.2 RNA提取及cDNA合成

使用EasyPure Plant RNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取1.1中-80 ℃保存葉片的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，Nano Drop 2000(Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)/值及RNA濃度。將總RNA稀釋至500 ng·μL，使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]合成cDNA，將其稀釋10倍作為Real-time PCR模板。

1.3 Real-time PCR

在NCBI上下載各相關(guān)參考序列，并在Ensembl Plants網(wǎng)站上(http://plants.ensembl.org/Multi/Tools/Blast)進(jìn)行blastn分析，獲得在小麥中國(guó)春3個(gè)亞基因組上的對(duì)應(yīng)序列；根據(jù)這些序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的Real-time PCR引物(表1)。利用作為內(nèi)參基因，在 ABI 7500 Real-Time PCR System(Thermo Scientific)上進(jìn)行Real-time PCR。使用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒。擴(kuò)增體系20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，正反向引物(10 μmol·L)各0.6 μL，cDNA模板5 μL，RNase-Free ddHO 3.4 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，按各自退火溫度退火 30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析程序： 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，緩慢升溫至95 ℃并持續(xù)30 s，60 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)分析采用2-△△C方法。

表1 供試引物及其序列Table 1 Primers used in this study and their sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 光照春化與暗春化對(duì)小麥表型的影響

表型分析結(jié)果表明，春化結(jié)束時(shí)，小麥處于三葉期，暗春化及光照春化的小麥表型沒有明顯差異。光照春化植株的平均抽穗期為100.53 d，而暗春化為120.27 d，比光照春化晚19.73 d，二者差異極顯著(< 0.01)。完成抽穗后，光照春化植株的平均主莖葉片數(shù)為6.5片，而暗春化植株的平均主莖葉片數(shù)為8.0片，二者差異極顯著 (<0.01)；光照春化植株的平均株高為32.43 cm，而暗春化植株的平均株高為28.86 cm，二者差異顯著(<0.05)。

2.2 光照春化及暗春化對(duì)小麥春化相關(guān)基因表達(dá)的影響

在春化前表達(dá)量很低，隨著春化的進(jìn)行，其表達(dá)量迅速上調(diào)；在光照條件下，其上升幅度明顯高于黑暗條件(圖1A)。在春化前表達(dá)量相對(duì)較高，春化顯著抑制該基因的表達(dá)，其在暗春化下的表達(dá)量更低(圖1B)。隨著暗春化的持續(xù)而逐漸上調(diào)表達(dá)，并在春化21 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后表達(dá)下調(diào)；在光照條件下，該基因在春化7 d時(shí)即達(dá)到表達(dá)峰值，至春化28 d時(shí)明顯較低；該基因在暗春化條件下的表達(dá)量比光照春化更高(圖1C)。在供試材料中均未被檢測(cè)出。

在光照春化條件下表達(dá)水平顯著高于春化前，但在暗春化條件下，僅在春化7 d時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)，春化更長(zhǎng)時(shí)間與春化前相比沒有顯著差異(圖1E)。在光照春化7 d時(shí)表達(dá)水平較春化前有所下降，隨春化繼續(xù)進(jìn)行，其表達(dá)水平恢復(fù)至春化前水平；暗春化導(dǎo)致其表達(dá)量較春化前顯著降低(圖1F)。在光照春化條件下總體表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)(僅在春化21 d時(shí)表達(dá)輕微下調(diào))，其在暗春化條件下的表達(dá)沒有明顯的規(guī)律(圖1G)。整體而言，、、在光照春化時(shí)表達(dá)量顯著高于暗春化(圖1E～圖1G)。

VL：光照春化；VD：暗春化。圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

隨著春化的持續(xù)，表達(dá)水平逐漸升高，其在光照條件下的上升幅度明顯高于黑暗條件，且黑暗條件下春化14 d后其表達(dá)已趨于穩(wěn)定(圖1D)。

2.3 光照春化及暗春化對(duì)小麥光周期基因表達(dá)的影響

較春化前而言，在光照春化條件下，表達(dá)水平顯著下降(圖2A)；表達(dá)僅在光照春化7 d時(shí)明顯降低，其他時(shí)間與春化前無(wú)明顯變化(圖2B)；光照春化導(dǎo)致表達(dá)水平顯著降低，但春化28 d時(shí)其表達(dá)水平恢復(fù)到春化前水平(圖2C)。在暗春化條件下，、以及表達(dá)較之春化前均顯著降低，且其表達(dá)量顯著低于光照春化(圖2A～圖2C)。

春化導(dǎo)致表達(dá)顯著上調(diào)，其表達(dá)水平達(dá)到峰值后逐漸下降，但光照春化和暗春化下該基因表達(dá)達(dá)到峰值的時(shí)間不同(光照春化21 d，暗春化14 d)，且光照春化的表達(dá)峰值高于暗春化(圖2D)；在光照春化及暗春化條件下表達(dá)量均顯著降低，但在暗春化條件下降低程度更高(圖2E)；在光照春化及暗春化條件下表達(dá)量上升，且在光照春化條件下表達(dá)量上升幅度更高(圖2F)。

圖2 光周期基因在光照春化及暗春化過程中的表達(dá)

3 討 論

表達(dá)在光照春化和暗春化條件下均逐漸上升，但光照春化導(dǎo)致其上升幅度更明顯(春化28 d時(shí)，光照春化表達(dá)量是暗春化條件下的4.5倍)；受到光照春化及暗春化的強(qiáng)烈抑制，但暗春化條件下的抑制效果更強(qiáng)；光照春化和暗春化過程中均未檢測(cè)到表達(dá)；由于抑制表達(dá)，在光照春化過程中的迅速表達(dá)受到、及低溫以外因素的影響。在小麥中，TaVRN3、14-3-3和TaFDL2蛋白組成六聚體FAC復(fù)合物(florigen activation complex)，結(jié)合啟動(dòng)子并調(diào)控其表達(dá)。在六倍體小麥中至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了46個(gè)情況基因，17個(gè)基因，以及5個(gè)基因；這些基因家族成員廣泛互作，產(chǎn)生了大量的FAC復(fù)合體，在不同組織及發(fā)育階段響應(yīng)不同的FT-like信號(hào)；在春化過程中，可能存在這樣的FT-like信號(hào)，迅速誘導(dǎo)的表達(dá)。另一類開花相關(guān)蛋白(MADS-box)形成同源或異源四聚體，結(jié)合靶基因啟動(dòng)子CArG-box元件并調(diào)控其表達(dá)。如MADS-box蛋白Vegetative to Reproductive Transition 2(TaVRT2)結(jié)合啟動(dòng)子，并抑制的表達(dá)；另一種MADS-box蛋白HvVRN1的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序(ChIP-seq，chromatin immunoprecipitation sequencing)在大麥基因組中獲得了514個(gè)含CArG-box元件的結(jié)合位點(diǎn)，37個(gè)包含這些位點(diǎn)的基因受HvVRN1的調(diào)控；鑒于啟動(dòng)子包含CArG-box元件，可能在春化過程中受到其他基因的誘導(dǎo)。還需要更多的試驗(yàn)，來明確光照春化過程中導(dǎo)致顯著上調(diào)的基因。

中麥175中，被光照春化和暗春化上調(diào)，不符合其抑制開花的功能。在小麥和短柄草中，有些品種的被春化上調(diào)，有些品種被春化下調(diào)；該基因可能參與了某種反饋調(diào)節(jié)，靈活微調(diào)植物對(duì)春化作用的響應(yīng)能力。CO1/CO2/PPD1可能存在相似的反饋調(diào)節(jié)：長(zhǎng)日照、突變體背景下，突變導(dǎo)致小麥明顯晚花；過表達(dá)導(dǎo)致長(zhǎng)日照和短日照下大麥提前開花，說明是開花促進(jìn)基因。長(zhǎng)日照條件下及的同時(shí)缺失導(dǎo)致大麥開花顯著延遲，說明是開花促進(jìn)基因；本試驗(yàn)中、以及在光照春化條件下表達(dá)量明顯高于暗春化，也說明了這三個(gè)基因促進(jìn)開花。長(zhǎng)日照條件下、和的表型貢獻(xiàn)率說明是主要的開花促進(jìn)基因，長(zhǎng)日照條件下小麥突變體比雙突變體開花明顯延遲進(jìn)一步證明了這個(gè)結(jié)果。然而PPD1蛋白存在時(shí)，和同時(shí)突變導(dǎo)致小麥在長(zhǎng)日照和短日照條件下均提早開花，不符合它們促進(jìn)開花的功能，暗示了CO1和CO2可能通過靈活微調(diào)參與的長(zhǎng)日照促進(jìn)開花過程。

在小麥中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)同源基因，其中和在光照春化條件下上調(diào)表達(dá)，可能調(diào)控春化過程中組蛋白甲基化狀態(tài)，促進(jìn)開花。是、的同源基因；和參與了擬南芥的染色質(zhì)組蛋白甲基化修飾，抑制春化過程中的表達(dá)，促進(jìn)開花。在春化過程中逐漸上調(diào)，但不受春化過程調(diào)控，而被短日照條件誘導(dǎo)，抑制()基因表達(dá)，不依賴于促進(jìn)擬南芥在短日照條件下開花。雖然和親緣關(guān)系較近，但僅有在暗春化條件下顯著下調(diào)，而與前人研究不同，在光照春化條件下其總體表達(dá)差異不明顯，因而可能參與了類似于擬南芥基因不依賴于的短日照促進(jìn)開花過程。

4 結(jié) 論

光照春化比暗春化更有利于小麥開花；光照春化條件下，、、、、、、、、、、和的表達(dá)水平高于暗春化。推測(cè)光照和低溫通過影響生理節(jié)律基因的表達(dá)來調(diào)控下游基因的表達(dá)，其中一些基因(如、及一些未知基因)通過調(diào)控表達(dá)調(diào)控小麥開花；和表觀調(diào)控有關(guān)的基因同樣受到光照和低溫的調(diào)控。