劉 艷，王 敏，李曉毛，匡海學(xué)，楊炳友*

基于DJ-1/Nrf2/HO-1信號通路探討北柴胡地上部分多糖組分對癲癇小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

劉 艷1，王 敏1，李曉毛2，匡海學(xué)1，楊炳友1*

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223023

探討北柴胡地上部分多糖組分（polysaccharides from aerial parts of，ABP）對戊四唑致癇小鼠的預(yù)防作用及作用機制。C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、丙戊酸鈉（125 mg/kg）組、癲癇寧片（1200 mg/kg）組和ABP高、低劑量（100、25 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后60 min，除對照組外，其余各組ip戊四唑（60 mg/kg）。通過行為學(xué)評價ABP預(yù)防癲癇的作用；采用蘇木素-伊紅（HE）染色、免疫組化法檢測海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)變化；采用ELISA法測定海馬組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、谷氨酸脫羧酶65（glutamic acid decarboxylase 65，GAD65）、GAD67、G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)向整流鉀通道1（G protein gated inwardly rectifying K channels 1，GIRK1）、-甲基--天冬氨酸受體1（-methyl--aspartic acid receptor，NMDAR1）、γ-氨基丁酸A型受體（γ-aminobutyric acid type A，GABA AR）水平；采用Western blotting檢測海馬組織中DJ-1、特異性蛋白1（specificity protein 1，SP1）、p-SP1、核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白表達(dá)。采用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型進(jìn)行驗證。與模型組比較，ABP明顯改善小鼠癲癇癥狀，表現(xiàn)為軀體僵直率和死亡率降低等（＜0.01）；海馬錐體細(xì)胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，GFAP陽性表達(dá)面積明顯降低；顯著降低海馬組織中Caspase-3、GFAP、GAD65、GAD67、GIRK1及NMDAR1水平（＜0.01），升高GABA AR水平（＜0.01）；顯著下調(diào)癲癇小鼠海馬組織和H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中DJ-1、p-SP1、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)（＜0.01）。ABP可以減輕癲癇發(fā)作期間DJ-1/Nrf2/HO-1介導(dǎo)的癲癇氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮預(yù)防癲癇的作用。

北柴胡；多糖；癲癇；氧化應(yīng)激；DJ-1/Nrf2/HO-1通路

癲癇俗稱“羊癲風(fēng)”，是大腦神經(jīng)元突發(fā)異常放電而導(dǎo)致的短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病[1]。全世界有近5000萬人患有癲癇[2]。癲癇發(fā)作涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元損傷等諸多因素[3-4]，其常見病理特征是病理和組織學(xué)變化，如海馬區(qū)的神經(jīng)膠質(zhì)化和神經(jīng)元死亡[5-6]。大腦中神經(jīng)元興奮性異常增加及過度同步化放電是癲癇發(fā)病的基礎(chǔ)，神經(jīng)元的異常放電會產(chǎn)生大量活性氧，觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[7]。包括癲癇在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)病癥會出現(xiàn)大腦氧化損傷，并削弱其抗氧化能力[8]，氧化應(yīng)激在此類病癥病理中發(fā)揮重要作用。癲癇動物模型是分析抗癲癇藥物和探析其發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)，戊四唑可使致癇動物產(chǎn)生與人類極為相似的行為及神經(jīng)病理學(xué)改變[1]，在戊四唑致癇小鼠的大腦中，氧化應(yīng)激導(dǎo)致自由基產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)了癲癇的發(fā)展，氧化應(yīng)激進(jìn)一步破壞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞大分子，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的損傷甚至死亡[9]。但到目前為止，癲癇的氧化應(yīng)激機制仍在探究之中。

北柴胡DC.作為一種被臨床廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥，常在癲癇處方中用作君藥，已被臨床證明具有較好的抗癲癇作用[10-11]。北柴胡地上部分與其藥用部位根具有相似的成分與療效，其多糖具有較好的抗癲癇及抗氧化作用。為了進(jìn)一步明確北柴胡地上部分多糖組分（polysaccharides from aerial parts of，ABP）對癲癇的預(yù)防效果及可能機制，本研究建立戊四唑致癇小鼠模型，通過行為學(xué)、ELISA、Western blotting等技術(shù)考察ABP對癲癇的預(yù)防作用及作用機制，以期充分利用北柴胡藥材植物資源，為ABP治療癲癇提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物和細(xì)胞

SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，由遼寧長盛生物科技有限公司提供，許可證號SCXK（遼）2020-0001。動物在20～23 ℃和50%～60%的標(biāo)準(zhǔn)化濕度條件下飼養(yǎng)。動物實驗獲得黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20201230001）。

PC12細(xì)胞由武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心提供。

1.2 藥材

北柴胡地上部分采摘自黑龍江省大慶市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室樊銳鋒教授鑒定為傘形科植物北柴胡DC.的干燥莖葉，藥材樣本（編號20190901）保存在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實驗室。

1.3 藥品與試劑

戊四唑（批號MKCC5472）購自美國Sigma-Aldrich公司；丙戊酸鈉（批號AHG0462）購自Sanofi公司；癲癇寧片（批號6907911100246，國藥準(zhǔn)字號Z53020771）購自昆明中藥廠有限公司；CCK-8試劑（批號K101819133EF5E）、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2，批號BCCG3062）購自APEx BIO公司；DMEM培養(yǎng)基（批號8120512）購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號710N0314））購自美國Sigma公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）ELISA試劑盒（批號20210315）購自武漢博士德生物工程有限公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）ELISA試劑盒（批號AG02158177）購自北京Bioss生物技術(shù)有限公司；谷氨酸脫羧酶65（glutamic acid decarboxylase 65，GAD65）ELISA試劑盒（批號GR3278856-10）、GAD67 ELISA試劑盒（批號GR3278845-10）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（批號ab189491）購自英國Abcam公司；γ-氨基丁酸A型受體（γ-aminobutyric acid type A，GABA AR）ELISA試劑盒（批號202106）購自上海酶聯(lián)生物科技公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號042820200814）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IgG二抗（批號ZB2305）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DJ-1抗體（批號3560506011）、G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)向整流鉀通道1（G protein gated inwardly rectifying K channels 1，GIRK1）ELISA試劑盒（批號A9824）、核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（批號0072280102）、特異性蛋白1（specificity protein 1，SP1）抗體（批號5500002921）、GAPDH抗體（批號A102264575）、-甲基--天冬氨酸受體1（-methyl--aspartic acid receptor，NMDAR1）ELISA試劑盒（批號4000000684）購自ABclonal Technology公司；p-SP1抗體（批號EXA1384）購自FulenGen公司。

1.4 儀器

EPOCH2酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；BT25S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；TDL-4型低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WT-1ND型超凈臺（北京王堂藍(lán)翼科技有限公司）；BX60型、DP72型顯微鏡（日本Olympus公司）；2695型高效液相色譜（美國Waters公司）；Western blotting凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；Odyssey?CLx凝膠成像儀（美國LI-COR公司）。

2 方法

2.1 藥物制備與分析

ABP經(jīng)本課題組實驗室制備，并進(jìn)行了多糖的定性定量分析[12]，ABP中含有半乳糖醛酸（45.19%）、半乳糖（36.63%）、阿拉伯鼠李糖（12.13%）和甘露糖（6.05%），ABP的平均相對分子質(zhì)量為1.38×103。

2.2 分組、給藥及造模

將60只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、丙戊酸鈉（125 mg/kg）組、癲癇寧片（1200 mg/kg）組和ABP高、低劑量（100、25 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后60 min，除對照組外，其余各組ip戊四唑（60 mg/kg）。

2.3 行為學(xué)檢測

各組小鼠ip戊四唑后立即記錄小鼠癲癇發(fā)作情況。小鼠癇性發(fā)作分級采用Racine標(biāo)準(zhǔn)：0級，無驚厥；I級，口、面部肌肉陣攣；II級，在I級基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律點頭；III級，在II級基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢陣攣；IV級，在III級基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢伸直；V級，在IV級基礎(chǔ)上出現(xiàn)跌倒，記錄小鼠癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間、僵直率和軀體死亡率，剔除不達(dá)標(biāo)的小鼠。

2.4 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察海馬組織病理變化

各組小鼠末次給藥后禁食24 h，用10%戊巴比妥鈉完全麻醉后置于解剖臺，取海馬組織，用PBS洗滌后，于4%多聚甲醛中固定6～8 h（4 ℃），然后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液（4 ℃）過夜，用石蠟固定。將石蠟切片在水中脫蠟，置于蘇木精染料溶液中5 min，并用70%鹽酸醇分化10 s。用自來水徹底沖洗切片，使核變藍(lán)，蒸餾，洗滌，并放入伊紅染料溶液中1 min，然后進(jìn)行梯度醇脫水，二甲苯清除和樣品的樹脂密封，于顯微鏡下觀察。

2.5 免疫組化檢測海馬組織GFAP陽性表達(dá)

將各組小鼠海馬組織石蠟切片脫蠟至水，用抗原修復(fù)液（pH 6.0）預(yù)處理切片，3% H2O2孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，之后用PBS沖洗3次。逐滴加入GFAP抗體（1∶400），4 ℃溫育過夜。將組織浸入PBS中，逐滴加入IgG抗體和Fab段-HRP多聚體。將混合物在室溫下孵育30 min，然后每次用PBS洗滌細(xì)胞5次，每次3 min。DAB顯色，于顯微鏡下觀察并拍照，Motic Med 6.0進(jìn)行圖像采集分析，評估GFAP陽性表達(dá)的吸光度（）。

2.6 ELISA檢測海馬組織內(nèi)相關(guān)因子水平

取各組小鼠海馬組織，PBS沖洗后，制備組織勻漿液，按ELISA試劑盒說明書檢測Caspase-3、GFAP、GAD65、GAD67、GIRK1、NMDAR1、GABA AR水平。

2.7 CCK-8法檢測ABP對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力的影響

取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以1×105個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。加入不同質(zhì)量濃度（20、40、80 μg/mL）的ABP處理24 h，加入CCK-8試劑，檢測細(xì)胞存活率。設(shè)置對照組、模型組和ABP低、中、高劑量（20、40、80 μg/mL）組，各給藥組加入不同質(zhì)量濃度的ABP溶液培養(yǎng)24 h，模型組和各給藥組再加入經(jīng)DMEM稀釋的0.5 mmol/L H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h以建立細(xì)胞損傷模型，對照組常規(guī)培養(yǎng)，另設(shè)置陰性組無細(xì)胞只加培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑，檢測細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(給藥－陰性)/(對照－陰性)

2.8 Western blotting檢測海馬組織和H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中DJ1、p-SP1、Nrf2、HO-1、SP1蛋白表達(dá)

取各組小鼠海馬組織，用PBS沖洗2遍，放在冰盒上，加入RIPA裂解液，用組織研磨器研磨后轉(zhuǎn)至離心管，13 500 r/min離心20 min，收集上清蛋白。

取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以1×106個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜。設(shè)置對照組、模型組、丙戊酸鈉（1 μmol/L）組和ABP（80 μg/mL）組，各給藥組加入藥物培養(yǎng)24 h，模型組和各給藥組再加入0.5 mmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，對照組常規(guī)培養(yǎng)，收集細(xì)胞。加入RIPA裂解液提取蛋白。

采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，95 ℃金屬浴5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉，加入一抗，4 ℃搖床過夜；TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，熒光發(fā)光曝光，采用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 ABP減輕小鼠癲癇癥狀

如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠表現(xiàn)出前肢痙攣并伴隨不同程度的直立、強直陣攣和跌倒等的癥狀；與模型組比較，丙戊酸鈉組、癲癇寧片組和ABP高劑量組均能明顯改善小鼠癲癇癥狀，同時能夠顯著延長小鼠驚厥潛伏期（＜0.01），減少癲癇持續(xù)時間（＜0.01），顯著降低軀體強直性痙攣發(fā)生率和死亡率（＜0.01）。表明高劑量的ABP能夠預(yù)防癲癇的發(fā)生及發(fā)展。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2 ABP減輕癲癇小鼠海馬神經(jīng)元損傷

如圖2所示，對照組小鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈圓形及橢圓形，胞核大而圓，核仁較清晰，細(xì)胞排列有規(guī)律；模型組小鼠海馬組織CA3區(qū)可見少量錐體細(xì)胞固縮深染，細(xì)胞形狀不規(guī)則，少量錐體細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松；丙戊酸鈉組、癲癇寧片組和ABP高劑量組小鼠海馬錐體細(xì)胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，胞核大而圓，染色質(zhì)少，核仁明顯，未見明顯異常。表明ABP能夠改善戊四唑誘導(dǎo)的神經(jīng)元炎癥的發(fā)生。

紅色箭頭：炎癥浸潤；黑色箭頭：少量錐體細(xì)胞固縮深染，細(xì)胞形狀不規(guī)則，少量錐體細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松

3.3 ABP抑制癲癇小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬中GFAP陽性表達(dá)面積明顯增加；與模型組比較，丙戊酸鈉組、癲癇寧片組和ABP高劑量組GFAP陽性表達(dá)面積明顯降低。表明ABP能夠抑制戊四唑誘導(dǎo)的癲癇小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

3.4 ABP降低癲癇小鼠海馬組織中Caspase-3、GFAP、GAD65、GAD67、GIRK1、NMDAR1水平并升高GABA AR水平

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中Caspase-3、GFAP、GAD65、GAD67、GIRK1及NMDAR1水平均顯著升高（＜0.01），GABA AR水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，丙戊酸鈉組、癲癇寧片組和ABP高劑量組海馬組織中Caspase-3、GFAP、GAD65、GAD67、GIRK1及NMDAR1水平均顯著降低（＜0.05、0.01），GABA AR水平顯著升高（＜0.01）。表明ABP能夠逆轉(zhuǎn)戊四唑誘導(dǎo)的凋亡因子、神經(jīng)遞質(zhì)以及離子受體異常水平。

圖3 ABP對戊四唑致癇小鼠海馬組織GFAP蛋白表達(dá)的影響(×200)

圖4 ABP對戊四唑致癇小鼠海馬組織中凋亡因子及神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響(, n = 10)

3.5 ABP下調(diào)癲癇小鼠海馬組織中DJ-1、P-SP1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)

如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中DJ-1、p-SP1、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），SP1的表達(dá)無明顯變化；與模型組比較，丙戊酸鈉組、癲癇寧片組和ABP高劑量組海馬組織中DJ-1、p-SP1、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。表明戊四唑誘導(dǎo)的癲癇機制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，ABP能夠通過抑制氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮預(yù)防癲癇的作用。

3.6 ABP抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡

如圖6所示，ABP（20～80 μg/mL）對PC12細(xì)胞無毒性作用。與對照組比較，H2O2誘導(dǎo)24 h后，PC12細(xì)胞活力明顯下降（＜0.01）；與模型組比較，40、80 μg/mL的ABP均能預(yù)防神經(jīng)元損傷（＜0.01），且80 μg/mL ABP預(yù)防神經(jīng)元損傷作用最強。表明ABP能夠抑制H2O2導(dǎo)致的PC12細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。

3.7 ABP下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中DJ-1、P-SP1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)

如圖7所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞DJ-1、p-SP1、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），SP1表達(dá)無明顯變化；與模型組比較，丙戊酸鈉組和ABP組DJ-1、p-SP1、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。表明ABP能夠抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)通路來發(fā)揮預(yù)防癲癇的作用，與體內(nèi)實驗結(jié)果一致。

圖5 ABP對戊四唑致癇小鼠海馬組織中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 10)

圖6 ABP對PC12細(xì)胞 (A) 和H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞(B) 活力的影響(, n = 5)

圖7 ABP對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

4 討論

癲癇的發(fā)病以腦神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致反復(fù)性、發(fā)作性和短暫性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。海馬神經(jīng)元細(xì)胞是癲癇的主要病變部位之一，主要參與記憶、情感認(rèn)知等功能的神經(jīng)共病[13]，其神經(jīng)元損傷甚至死亡可引起海馬結(jié)構(gòu)完整性丟失[14]，可誘發(fā)記憶障礙[15-16]。癲癇發(fā)作已被證明以多種方式參與海馬神經(jīng)源性級聯(lián)反應(yīng)[17]。神經(jīng)元興奮性和抑制性的不平衡被認(rèn)為是癲癇發(fā)生的原因之一。

近年來，越來越多的研究表明癲癇發(fā)作與氧化應(yīng)激之間存在密切聯(lián)系[18]。氧化應(yīng)激能夠通過激活相關(guān)信號通路增加神經(jīng)元細(xì)胞的超興奮性，甚至引起細(xì)胞死亡[19]，降低癲癇發(fā)作的閾值，從而導(dǎo)致癲癇的發(fā)生和發(fā)展[20]。另外，癲癇發(fā)作會產(chǎn)生大量自由基，這時抗氧化系統(tǒng)和增多的氧自由基之間平衡失調(diào)[21]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，在多種癲癇動物模型中和癲癇患者腦組織標(biāo)本及血液標(biāo)本中，均可檢測到氧化應(yīng)激標(biāo)記物，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶[22]。針對癲癇的氧化應(yīng)激研究為進(jìn)一步明確癲癇的發(fā)病機制提供了重要方向。調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的過程受諸多因素的影響，因此，更好地了解氧化損傷的發(fā)病機制和分子變化，為預(yù)防癲癇提供新思路是必要和緊迫的。來自中藥的多糖因其獨特的抗氧化能力而受到廣泛關(guān)注[23-24]。本研究對ABP預(yù)防癲癇的作用及其機制進(jìn)行探索。

癲癇發(fā)作期間神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷的機制仍有待充分了解。研究表明線粒體功能障礙可能導(dǎo)致廣泛的急性和慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括癲癇和創(chuàng)傷性腦損傷。在線粒體參與癲癇發(fā)作的病理過程中，導(dǎo)致活性氧大量蓄積并造成神經(jīng)元的氧化損傷和死亡[25]，加重癲癇的發(fā)作，因此神經(jīng)元的死亡在癲癇發(fā)展中起重要作用。此外，線粒體生物能學(xué)受損與大多數(shù)癲癇誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生有關(guān)[19]。當(dāng)機體處于病態(tài)時，體內(nèi)氧化還原失衡，氧自由基過度堆積，線粒體因此而受到損傷，引起一系列的細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而參與癲癇的病理變化。關(guān)于癲癇動物模型的研究表明，線粒體內(nèi)氧化大分子損傷發(fā)生在癲癇發(fā)生發(fā)展的不同階段[26]。本研究結(jié)果表明，80 mg/kg的ABP可顯著降低癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度，延長癲癇發(fā)作潛伏期，因此，以80 mg/kg的ABP進(jìn)行后續(xù)機制研究。此外，癲癇發(fā)展過程中發(fā)生的病理生理變化，如海馬細(xì)胞丟失等，表明線粒體和氧化還原過程在疾病發(fā)展的不同方面具有潛在作用[27]。研究表明，海馬CA1區(qū)是難治性癲癇神經(jīng)元病理變化的主要部位[28]。在難治性癲癇的動物研究中推測癲癇的發(fā)作和發(fā)展與腦組織中神經(jīng)元的丟失存在關(guān)系[20]。經(jīng)組織病理學(xué)圖像分析，由戊四唑誘導(dǎo)的小鼠海馬CA1和CA3區(qū)結(jié)果顯示有明顯的細(xì)胞損傷跡象[29]。此外，本研究結(jié)果表明ABP對神經(jīng)元的丟失和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生顯著的影響。

氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在人類患者和實驗?zāi)Ｐ桶d癇的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[30-31]。DJ-1是一種氧化還原敏感蛋白，保護神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡的影響。在分子水平上，當(dāng)受到氧化應(yīng)激影響時，DJ-1通過破壞氧化應(yīng)激傳感器蛋白（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/Nrf2復(fù)合物來阻止Nrf2與Keap1的相互作用，充當(dāng)Nrf2的穩(wěn)定劑[32]。Nrf2是細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，對維持線粒體完整性和防止自由基產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙至關(guān)重要[33]。在穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2與Keap1結(jié)合，促進(jìn)Nrf2泛素化和蛋白質(zhì)體降解，導(dǎo)致基礎(chǔ)Nrf2活性降低[34]。在氧化應(yīng)激條件下，Keap1被氧化，導(dǎo)致其對Nrf2的親和力降低，從而使Nrf2易位到細(xì)胞核。Nrf2是多種細(xì)胞保護、抗氧化和抗炎途徑相互干擾的關(guān)鍵攔截點[34]。Nrf2及其下游信號HO-1充當(dāng)促氧化應(yīng)激源的傳感器，促氧化應(yīng)激源作為一種代償機制被誘導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，戊四唑致癇小鼠海馬組織和H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)顯著高于正常水平，在ABP預(yù)處理組中，Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均顯著降低。

綜上所述，ABP使戊四唑致癇小鼠海馬組織中DJ-1、Nrf2和HO-1的表達(dá)水平恢復(fù)正常，表明ABP預(yù)處理可以減輕癲癇發(fā)作期間DJ-1/Nrf2/HO-1介導(dǎo)的癲癇氧化應(yīng)激引起的損傷，從而發(fā)揮預(yù)防癲癇的作用。但這種作用是該組分總體效果的體現(xiàn)，還是某一種或多種成分作用的效果，還需要進(jìn)一步研究明確。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of polysaccharides from aerial parts ofon oxidative stress in brains of epileptic mice based on DJ-1/Nrf2/HO-1 signaling pathway

LIU Yan1, WANG Min1, LI Xiao-mao2, KUANG Hai-xue1, YANG Bing-you1

1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Key Laboratory of Basic and Application Research of Beiyao, Ministry of Education, Harbin 150040, China 2. Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College, Huai’an 223023, China

To investigate the preventive effect and mechanism of polysaccharide from aerial parts of(ABP) on pentylenetetrazole-induced epilepsy in mice.C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group, sodium valproate (125 mg/kg) group, epileptic tablets (1200 mg/kg) group and ABP high-, low-dose (100, 25 mg/kg) groups, with 10 mice in each group. Each administration group was ig corresponding drug, control group and model group were ig equal volume 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution, once a day for 7 d. 60 min after the last administration, except for control group, other groups were ip pentylenetetrazole (60 mg/kg). The effect of ABP on preventing epilepsy was evaluated by behavior; The pathomorphological changes of hippocampal neurons were detected by hematoxylin eosin (HE) staining and immunohistochemistry; The levels of cystein-asparate protease-3 (Caspase-3), glial fibrillary acidic protein (GFAP), glutamic acid decarboxylase 65 (GAD65), GAD67, G protein gated inwardly rectifying K channels 1 (GIRK1),-methyl--aspartate acid receptor 1 (NMDAR1) and γ-aminobutyric acid type A receptor (GABA AR) in hippocampus were detected by ELISA; Western blotting was used to detect DJ-1, specific protein 1 (SP1), p-SP1, nuclear factor E2 related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase-1 (HO-1) protein expression in hippocampus. The oxidative stress model of PC12 cells induced by hydrogen peroxide (H2O2) was used to verified.Compared with model group, ABP significantly improved the epileptic symptoms of mice, which showed a decrease in rate of body stiffness and mortality (< 0.01); Hippocampal pyramidal cells were regularly arranged with clear structure, and GFAP positive expression area was reduced; The levels of Caspase-3, GFAP, GAD65, GAD67, GIRK1 and NMDAR1 in hippocampus were significantly decreased (< 0.01); DJ-1, p-SP1, Nrf2 and HO-1 protein expressions in hippocampus of epileptic mice and H2O2-induced PC12 cells were significantly decreased (< 0.01).ABP can reduce DJ-1/Nrf2/HO-1 mediated oxidative stress during epileptic seizures, thus playing a role in preventing epilepsy.

DC.; polysaccharides; epilepsy; oxidative stress; DJ-1/Nrf2/HO-1 pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01 - 0142 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.017

2022-08-03

國家自然科學(xué)基金面上項目（81973440）；黑龍江省“頭雁”團隊支持項目（黑龍江省頭雁行動領(lǐng)導(dǎo)小組文件[2019]5號）

劉 艷（1987—），博士，副教授，主要研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: lifeliuyan@163.com

通信作者：楊炳友（1970—），博士，教授，主要研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (0451)82193007 E-mail: ybywater@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]