吳嘉思，蘭悅嘉，王 俊，王 歡

? 藥理與臨床?

表小檗堿調(diào)控CD39-NLRP3-GSDMD焦亡路徑改善膿毒癥肺損傷的機制研究

吳嘉思1，蘭悅嘉2，王 俊3，王 歡2

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 3. 雅安市人民醫(yī)院藥劑科，四川 雅安 625000

基于CD39-NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）-GSDMD焦亡路徑探究表小檗堿改善膿毒癥肺損傷的作用機制。通過AMP-Glo TM實驗考察黃連異喹啉生物堿成分小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿及藥根堿的CD39酶促活性。小鼠ip脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，12 mg/kg）建立膿毒癥肺損傷模型，分別于造模前24 h和造模0.5 h后給予表小檗堿或MCC950，造模后24 h，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠肺組織病理變化；計算肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量，評價肺腫脹；ELISA法檢測肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和IL-17A水平。采用1 μg/mL LPS聯(lián)合5 mmol/L三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）/5 μmol/L nigericin/150 μg/mL MSU或轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL poly（dA:dT）刺激人源單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞復(fù)制炎癥模型，給予表小檗堿或VX-765干預(yù)，采用Western blotting法檢測細(xì)胞CD39-NLRP3-GSDMD路徑蛋白表達；ELISA法檢測上清液中IL-1β水平；采用免疫熒光評估NLRP3炎癥小體組裝情況；采用掃描電鏡評價細(xì)胞焦亡情況；采用BzATP介導(dǎo)配體門控離子通道受體7（ligand-gated ion channel receptor 7，P2X7）通道開放，考察表小檗堿對P2X7功能的作用。表小檗堿的CD39酶促活性最佳，半數(shù)致死濃度（median effective concentration，EC50）值為14.23 μmol/L。與對照組比較，模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)異常并顯示炎性浸潤，且肺腫脹明顯（＜0.01），肺泡灌洗液中炎性因子水平顯著上調(diào)（＜0.01）；表小檗堿干預(yù)后，以上變化得到了有效逆轉(zhuǎn)（＜0.05、0.01），并呈劑量相關(guān)性。以上藥效與表小檗堿上調(diào)CD39蛋白表達水平、抑制P2X7過表達、干擾NLRP3炎癥小體組裝、降低GSDMD-N蛋白表達水平、逆轉(zhuǎn)GSDMD介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡并降低IL-1β水平有關(guān)（＜0.05、0.01）。表小檗堿通過抑制膿毒癥肺損傷小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、MCP-1和IL-17A水平逆轉(zhuǎn)肺損傷和肺腫脹，進一步改善膿毒癥肺損傷，可能與調(diào)控CD39-NLRP3-GSDMD焦亡路徑相關(guān)。

表小檗堿；膿毒癥肺損傷；CD39；炎癥小體；焦亡

膿毒癥肺損傷（sepsis-induced acute lung injury，SALI）嚴(yán)重威脅生命健康，是重癥監(jiān)護室膿毒癥患者死亡的重要原因，其特征包括中性粒細(xì)胞整合、多種細(xì)胞因子釋放以及肺泡-毛細(xì)血管完整性破壞，同時可見非液體靜力性肺水腫和通透性升高[1]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增約1800萬例患者，發(fā)病率為0.3%，并以1.5%/年的速度增長[2]。歷年來臨床專家就SALI的生物標(biāo)志物是否應(yīng)納入共識會議定義進行了激烈的討論。目前SALI治療方法包括靜脈給予抗生素，此方法相應(yīng)機制不明確，且針對不同細(xì)胞因子的不同抗生素聯(lián)合使用容易導(dǎo)致不良反應(yīng)的疊加[3]。另一方面，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)分子修飾化學(xué)藥帶來的較大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)也阻礙其在SALI患者中的實際應(yīng)用[4]。因此，揭示SALI潛在發(fā)病機制、尋求更易獲取、更經(jīng)濟的新型替代藥物需求迫切。

近年來，嘌呤能調(diào)節(jié)性“剎車”在炎癥應(yīng)答中的角色受到越來越多的關(guān)注。研究表明，CD39介導(dǎo)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）→二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）→一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）水解過程，而后AMP被CD73進一步水解為腺苷。胞外ATP與配體門控離子通道受體7（ligand-gated ion channel receptor 7，P2X7）受體綁定觸發(fā)巨噬細(xì)胞促炎信號，而腺苷則與A2B腺苷受體綁定介導(dǎo)M?抗炎信號，以上路徑可對巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答起到調(diào)節(jié)性“剎車”作用[5]。CD39-P2X7作為嘌呤能“正反饋”促炎路徑，已有諸多證據(jù)明確了其對下游炎癥小體-焦亡通路的調(diào)控作用。有關(guān)SALI發(fā)病機制的研究顯示，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體激活誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞焦亡是肺損傷和肺腫脹的主要原因之一[6]。CD39在肺泡巨噬細(xì)胞中也多有表達[7]，CD39-P2X7路徑很可能通過調(diào)控NLRP3炎癥小體-焦亡參與SALI的發(fā)生與發(fā)展。故本研究關(guān)注CD39-NLRP3-GSDMD證據(jù)鏈的上游銜接環(huán)節(jié)，即CD39-P2X7路徑在SALI病程的參與機制具有臨床指導(dǎo)意義。

中醫(yī)角度多從“濕邪致病”闡釋膿毒癥的病機，其特點包括“濕、熱、毒、瘀、虛”[8]。黃連始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歸草部，列為上品，為苦寒燥濕的代表藥物，功兼清熱燥濕、瀉火解毒。臨床上黃連作為單味藥治療膿毒癥的療效顯著[9]?，F(xiàn)代學(xué)者針對黃連生物活性進行了諸多探索。成分-效用研究顯示小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿和表小檗堿為黃連的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。單味藥黃連及其效應(yīng)成分能負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞中眾多炎癥通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并發(fā)揮“多成分、多靶點”的抗炎作用，尤其是小檗堿，近年來積累了大量的研究，并保持穩(wěn)定增長的研究熱度[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃連堿及巴馬汀抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路激活，干擾LPS聯(lián)合ATP介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的啟動和組裝[13-16]，而黃連成分是否以及如何調(diào)控CD39-NLRP3-GSDMD焦亡路徑改善膿毒癥肺損傷尚不清楚。故本研究擬從黃連主要異喹啉單體成分中篩選促CD39酶活性作用最強的成分，并針對此成分開展SALI改善作用及潛在作用機制研究。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠48只，8～9周齡，體質(zhì)量（28±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。動物于12 h晝夜交替環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，許可文號SYXK（川）2014-124。動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動物保護與使用委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2017-21）。

1.2 細(xì)胞系

人源單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

表小檗堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號6873-09-2）、小檗堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號2086-83-1）、黃連堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號3486-66-6）、鹽酸巴馬?。ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號10605-02-4）、鹽酸藥根堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94%，批號960383-96-4）、番瀉苷A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，批號81-27-6）購自成都曼思特生物科技有限公司；AMP-GloTM試劑盒（批號V5011）購自美國Promega公司；LPS、ATP、β-巰基乙醇、YO-PRO-1、BzATP、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司，批號分別為L4391-1MG、A1852-1VL、M3184、SML1792、B6396、RNBF8134；佛波酯（phorbol ester，PMA，批號S1819）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；尼日尼亞菌素（nigericin，批號28643-80-3）、尿酸結(jié)晶（monosodium urate，MSU，批號1198-77-2）、poly（dA:dT，批號86828-69-5）購自InvivoGen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號D120705）購自上海源培生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（批號8118334）購自美國Gibco公司；NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）、CD39、P2X7、GSDMD抗體購自美國CST公司，批號分別為15101、2225、91851、13809、69469S；凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）抗體（批號sc-365611）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號180411）購自成都谷歌生物科技有限公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＋L）二抗（批號A0423）、Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗小鼠IgG（H＋L）二抗（批號A0460）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑（批號24348600）購自Roche公司；Caspase-1抑制劑Belnacasan（VX-765，批號S2228）、NLRP3抑制劑MCC950（批號S8930）購自美國Selleck公司；中等強度RIPA裂解液（批號AR0102）購自武漢博士德生物工程有限公司；人白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、IL-17A ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號分別為70-EK106/2-96、70-EK187-96、70-EK117/2-96。

1.4 儀器

SpectraMaxR iD5型全波長多功能酶標(biāo)儀[美國美谷分子儀器（上海）有限公司]；Forma 3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SP8 SR STED型超高分辨激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；JSM-IT510型InTouchScop掃描電子顯微鏡（SEM，日本電子公司）；SW-CJ-2FD型超凈作臺（上海蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；AE2000型倒置顯微鏡（Motic股份有限公司）；Mini PROTEAN型蛋白電泳儀、Mini Trans-Blot蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDoc超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Milli-Q Plus超級純水儀（美國Millipore公司）；SK-O180-S型數(shù)顯圓周搖床（上海珂淮儀器有限公司）。

2 方法

2.1 CD39酶活性促進篩選實驗

按照AMP-GloTM試劑盒說明書，對黃連單體成分小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿和表小檗堿進行CD39酶活性促進作用篩選，單體終濃度為10 μmol/L，另設(shè)對照組加入DMSO，采用酶標(biāo)儀測定吸光度（）值，采用GraphPad Prism 8.4.0軟件擬合數(shù)據(jù)計算半數(shù)致死濃度（median effective concentration，EC50）值。

2.2 體內(nèi)實驗

2.2.1 分組、造模與給藥 48只雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、MCC950組（10 mg/kg）和表小檗堿低、中、高劑量（30、60、120 mg/kg）[17]組，每組8只。除對照組外，其余各組ip 0.3 mL LPS（12 mg/kg）建立SALI模型，分別于造模前24 h和造模0.5 h后ip 0.3 mL MCC950或表小檗堿，造模后24 h收集各組小鼠肺組織及肺泡灌洗液。

2.2.2 肺組織病理學(xué)觀察 每組取4只小鼠收集左肺組織，生理鹽水清洗后用OCT包埋膠固定，冰凍切片成8 μm薄片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

2.2.3 肺腫脹度評估 取“2.2.2”項下各組小鼠右肺，生理鹽水清洗后用濾紙吸干水分，稱定質(zhì)量標(biāo)記為濕質(zhì)量；60 ℃條件下烘干24 h，稱定質(zhì)量標(biāo)記為干質(zhì)量，記錄濕質(zhì)量/干質(zhì)量。

2.2.4 ELISA法檢測肺泡灌洗液中IL-1β、MCP-1和IL-17A水平 取各組剩余4只小鼠，參考文獻方法[2]收集肺泡灌洗液，4000 r/min離心10 min，吸取上清，按照試劑盒說明書測定IL-1β、MCP-1和IL-17A水平。

2.3 體外實驗

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、0.05 mmol/L β-巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

2.3.2 Western blotting法檢測CD39、P2X7、GSDMD蛋白表達 THP-1細(xì)胞以1×106個/mL接種于6孔板中，加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，貼壁后隨機分為對照組、模型組、小檗堿（10 μmol/L）或番瀉苷A（10 μmol/L）組或VX-765（0.5 μmol/L）組和表小檗堿低、中、高劑量（3、10、30 μmol/L）組。除對照組外，其余各組加入LPS（1 μg/mL）預(yù)處理3 h；各給藥組分別加入相應(yīng)藥物孵育3 h后，除對照組外各組另加入5 mmol/L ATP繼續(xù)刺激45 min。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉，分別加入CD39、P2X7、GSDMD抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，于凝膠成像儀中曝光顯影。

2.3.3 YO-PRO-1染料攝取實驗 THP-1細(xì)胞以5×105個/mL接種于poly-D-賴氨酸包被的96孔板上，用檢測緩沖液清洗細(xì)胞，加入含1 μmol/L YO-PRO-1和10 μmol/L表小檗堿的檢測緩沖液80 μL，37 ℃孵育20 min；細(xì)胞在485 nm激發(fā)，530 nm記錄發(fā)射，記錄持續(xù)120 s，在20 s時加入300 μmol/L BzATP，以530 nm的最大變化量進行定量分析，評價P2X7通道蛋白開放功能。

2.3.4 ELISA法檢測上清液中IL-1β水平 THP-1細(xì)胞接種于96孔板中，加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，貼壁后隨機分為對照組、模型組、VX-765（0.5 μmol/L）組和表小檗堿低、中、高劑量（3、10、30 μmol/L）組。分別進行以下處理后，收集各組培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒說明書測定IL-1β水平。

（1）LPS＋ATP：除對照組外，其余各組加入LPS（1 μg/mL）預(yù)處理3 h；各給藥組分別加入相應(yīng)藥物孵育3 h后，除對照組外各組另加入5 mmol/L ATP繼續(xù)刺激45 min。

（2）LPS＋nigericin：除對照組外，其余各組加入LPS（1 μg/mL）預(yù)處理3 h；各給藥組加入相應(yīng)藥物孵育1 h后，除對照組外各組另加入5 μmol/L nigerincin繼續(xù)刺激6 h。

（3）LPS＋MSU：除對照組外，其余各組加入LPS（1 μg/mL）預(yù)處理3 h；各給藥組加入相應(yīng)藥物孵育1 h后，除對照組外各組另加入150 μg/mL MSU繼續(xù)刺激6 h。

（4）poly（dA:dT）轉(zhuǎn)染：除對照組外，其余各組加入0.5 μg/mL Lip2000轉(zhuǎn)染poly（dA:dT），4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，各給藥組加入相應(yīng)藥物繼續(xù)孵育24 h。

2.3.5 免疫熒光法觀察NLRP3炎癥小體組裝情況 THP-1細(xì)胞接種于96孔板中，加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，貼壁后隨機分為對照組、模型組、VX-765（0.5 μmol/L）組和表小檗堿（30 μmol/L）組。除對照組外，其余各組加入LPS（1 μg/mL）預(yù)處理3 h；各給藥組分別加入相應(yīng)藥物孵育3 h后，除對照組外各組另加入5 mmol/L ATP繼續(xù)刺激45 min。以多聚甲醛固定細(xì)胞，加入NLRP3兔抗和ASC鼠抗，4 ℃孵育過夜；加入DAPI、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＋L）二抗及Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗小鼠IgG（H＋L）二抗，室溫孵育2 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，評價NLRP3炎癥小體組裝情況。

2.3.6 SEM觀察細(xì)胞焦亡 按“2.3.5”項下方法進行分組及處理，用2.5%戊二醛固定細(xì)胞，加入1%四氧化鋨和3%亞鐵氰化鉀，4 ℃孵育1 h，于0.3%硫代卡波苷中室溫孵育5 min，于1%四氧化鋨中4 ℃浸泡20 min。樣品經(jīng)梯度乙醇脫水并嵌入切片后，使用含1%甲苯胺藍(lán)和2%硼酸鹽的溶液進行染色，于SEM下觀察并拍照，評價細(xì)胞焦亡情況。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 黃連中CD39酶活性促進作用最強的異喹啉生物堿成分——表小檗堿

如圖1所示，黃連生物堿小檗堿、黃連堿、藥根堿、表小檗堿和巴馬汀顯示不同程度的CD39酶活性促進作用，其中表小檗堿作用最強（＜0.01），EC50值為14.23 μmol/L，故選擇表小檗堿進行后續(xù)實驗。

3.2 表小檗堿減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺損傷

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠肺組織可見肺泡壁中度增厚，肺泡結(jié)構(gòu)不清，肺泡輕度擴張并伴有中性粒細(xì)胞浸潤，同時可見大量支氣管上皮細(xì)胞壞死，黏液分泌增多。表小檗堿干預(yù)后肺泡結(jié)構(gòu)趨于完整，炎性細(xì)胞明顯減少，黏液分泌受到抑制，提示肺損傷程度減輕。與對照組比較，模型組小鼠肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量值明顯升高（＜0.01），提示模型組小鼠肺腫脹；與模型組比較，MCC950及表小檗堿中、高劑量組小鼠肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量值明顯降低（＜0.01）。與對照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子IL-1β、MCP-1和IL-17A水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，MCC950組小鼠肺泡灌洗液中IL-1β和IL-17A水平均明顯降低（＜0.01）；表小檗堿中、高劑量組肺泡灌洗液中IL-1β、MCP-1和IL-17A水平均明顯降低（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

箭頭表示肺泡擴張、中性粒細(xì)胞浸潤及支氣管上皮細(xì)胞壞死 與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.3 表小檗堿調(diào)控CD39-P2X7嘌呤能通路蛋白表達及功能

如圖3-A所示，與對照組比較，LPS聯(lián)合ATP介導(dǎo)CD39表達下調(diào)及P2X7蛋白過表達（＜0.01）；表小檗堿中、高劑量組顯著上調(diào)CD39蛋白表達（＜0.05、0.01），并抑制P2X7蛋白表達（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性；陽性對照藥物小檗堿和番瀉苷A分別上調(diào)CD39和下調(diào)P2X7蛋白表達水平（＜0.05、0.01），與文獻報道[18-19]一致。如圖3-B所示，采用BzATP介導(dǎo)P2X7通道開放，表小檗堿干預(yù)后明顯抑制YO-PRO-1染料攝取，提示表小檗堿抑制P2X7功能。

圖3 表小檗堿調(diào)控CD39-P2X7嘌呤能通路蛋白表達(A) 及功能(B) (, n = 3)

3.4 表小檗堿抑制CD39-P2X7下游NLRP3和黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎癥小體激活

如圖4-A所示，與對照組比較，LPS聯(lián)合ATP、LPS聯(lián)合nigericin、LPS聯(lián)合MSU（激活NLRP3）以及poly（dA:dT）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（激活A(yù)IM2）均引發(fā)炎癥小體激活，引發(fā)IL-1β大量分泌（＜0.01）；Caspase-1特異性抑制劑VX-765以及各劑量表小檗堿不同程度抑制以上4組刺激物介導(dǎo)的IL-1β生成，且表小檗堿作用呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。采用激光共聚焦顯微鏡考察NLRP3炎癥小體的組裝，如圖4-B所示，LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)pro Caspase-1與ASC間、ASC與NLRP3間蛋白-蛋白相互綁定，VX-765及表小檗堿明顯逆轉(zhuǎn)以上蛋白間相互作用。

3.5 表小檗堿逆轉(zhuǎn)LPS聯(lián)合ATP介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡

如圖5-A所示，LPS聯(lián)合ATP介導(dǎo)焦亡標(biāo)志性蛋白GSDMD-N蛋白的過表達（＜0.01），而Caspase-1特異性抑制劑VX-765及中、高劑量的表小檗堿明顯降低GSDMD-N蛋白表達水平（＜0.05、0.01），且表小檗堿的作用呈劑量相關(guān)性。如圖5-B所示，LPS聯(lián)合ATP刺激誘導(dǎo)細(xì)胞膜空洞的形成，提示細(xì)胞焦亡發(fā)生；VX-765及表小檗堿干預(yù)后細(xì)胞膜孔洞形成受到明顯抑制，提示表小檗堿逆轉(zhuǎn)LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

4 討論

膿毒癥的特征是宿主對入侵病原體的反應(yīng)失調(diào)，可導(dǎo)致多個危及生命的器官功能障礙。其中肺是最先也是最常衰竭的器官，也是膿毒癥患者死亡的最重要預(yù)后因素之一。目前針對SALI尚無特效療法。中醫(yī)以“濕邪致病”定義膿毒癥病機，而黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的藥效，且臨床上治療膿毒癥療效確切。本研究從CD39-P2X7嘌呤能路徑入手，揭示了黃連異喹啉的單體成分表小檗堿調(diào)控NLRP3-GSDMD焦亡改善SALI的新機制。

本研究采用LPS建立小鼠SALI模型，肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)肺泡壁中度增厚，肺泡結(jié)構(gòu)不清，肺泡輕度擴張并伴有中性粒細(xì)胞浸潤，同時可見大量支氣管上皮細(xì)胞壞死，黏液分泌增多。而表小檗堿干預(yù)后，可明顯觀測到肺組織結(jié)構(gòu)趨于完整，炎性細(xì)胞減少。通過考察肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)LPS造模后小鼠肺腫脹增加，而中、高劑量的表小檗堿能夠明顯緩解肺腫脹。進一步檢測小鼠肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示表小檗堿有效抑制IL-1β、MCP-1和IL-17A產(chǎn)生。綜合以上宏觀指標(biāo)和通路下游指標(biāo)，表小檗堿對LPS介導(dǎo)的SALI具有明確的改善作用。目前已有文獻報道證實單味藥黃連[20]、小檗堿[21]、黃連堿[22]和巴馬汀[23]可改善SALI，本研究補充證實了另一黃連異喹啉成分表小檗堿逆轉(zhuǎn)SALI的藥效，可為黃連的抗炎作用提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

圖4 表小檗堿抑制4組刺激物誘導(dǎo)的IL-1β過度分泌(A) 并能逆轉(zhuǎn)LPS聯(lián)合ATP介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體組裝(B) (, n = 6)

A-Western blotting檢測焦亡蛋白表達 B-SEM檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，箭頭表示細(xì)胞膜上孔洞

目前SALI的發(fā)病機制尚不完全清楚，現(xiàn)有研究已明確了NLRP3炎癥小體-焦亡路徑參與介導(dǎo)SALI的部分機制[24]，而CD39-P2X7嘌呤能路徑作為NLRP3炎癥小體的上游調(diào)控者，有關(guān)其對SALI發(fā)生發(fā)展的研究還很局限。為深入研究表小檗堿調(diào)控CD39-NLRP3-GSDMD路徑并改善SALI的作用機制，本研究采用LPS聯(lián)合ATP刺激THP-1細(xì)胞激活嘌呤能通路，發(fā)現(xiàn)CD39蛋白表達受到抑制而P2X7蛋白表達升高，且P2X7通道被打開，炎癥應(yīng)答明顯，而表小檗堿干預(yù)后以上改變得到逆轉(zhuǎn)，提示表小檗堿可介導(dǎo)嘌呤能調(diào)節(jié)性“剎車”。本研究結(jié)果證實表小檗堿從膜蛋白水平和功能層面便已開始行使抗炎藥效。黃連其他異喹啉單體成分對CD39-P2X7路徑的調(diào)節(jié)機制也有零星的證據(jù)。例如，在氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）刺激的巨噬細(xì)胞中，小檗堿下調(diào)P2X7受體水平[25]；在糖尿病神經(jīng)性疼痛大鼠模型中，巴馬汀抑制海馬P2X7受體表達[26]。本研究發(fā)現(xiàn)表小檗堿對CD39的上調(diào)作用及P2X7蛋白水平和功能的抑制作用，極大程度上為黃連調(diào)控嘌呤能通路提供了佐證。

進一步探究表小檗堿對炎癥小體激活和組裝的影響，發(fā)現(xiàn)與小檗堿類似，表小檗堿降低4組刺激物誘導(dǎo)的IL-1β分泌，提示表小檗堿干擾NLRP3（LPS聯(lián)合ATP/nigericin/MSU）和AIM2炎癥小體（polydA:dT）的激活。此外，表小檗堿逆轉(zhuǎn)LPS聯(lián)合ATP介導(dǎo)的pro Caspase-1-ASC間和ASC-NLRP3蛋白-蛋白相互作用，由此抑制NLRP3炎癥小體組裝?？紤]到NLRP3炎癥小體激活引起的Caspase-1剪切功能成熟可切割焦亡調(diào)控靶標(biāo)GSDMD，游離的端GSDMD介導(dǎo)細(xì)胞膜孔洞的形成并最終導(dǎo)致焦亡。本研究發(fā)現(xiàn)表小檗堿與Caspase-1特異性抑制劑VX-765功能類似，可明顯抑制LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的GSDMD-N蛋白過表達并減少細(xì)胞膜孔洞的形成，阻礙細(xì)胞焦亡的發(fā)生（圖6）。

焦亡作為有炎癥參與的細(xì)胞程序性死亡方式，參與了多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展。除本研究關(guān)注的膿毒癥以外，近年來焦亡熱點疾病類型包括自身免疫疾病、感染類疾病和腫瘤[27-28]。目前針對以上疾病治療的代表性化學(xué)藥包括甾體類藥物、免疫抑制劑和單抗藥物等，而該類藥物存在不良反應(yīng)多（代謝紊亂、誘發(fā)或加重感染等）以及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)相對較大的缺點。中醫(yī)治療SALI主要從改善“濕、熱、毒、瘀、虛”入手，而黃連作為代表性清熱燥濕、瀉火解毒上品中藥，具有靶點豐富、不良反應(yīng)小和價格相對低廉的優(yōu)勢。本研究明確了黃連異喹啉單體成分表小檗堿改善SALI的藥效并揭示了其調(diào)控CD39-NLRP3-GSDMD焦亡路徑潛在機制，可為表小檗堿及黃連開發(fā)為抗膿毒癥藥物提供理論支撐，也有助于拓展中醫(yī)藥治療膿毒癥和焦亡相關(guān)疾病的思路。

標(biāo)紅部分為表小檗堿的直接靶位

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of epiberberine on ameliorating sepsis-induced lung injury via modulation of CD39-NLRP3-GSDMD and downstream pyroptosis

WU Jia-si1, LAN Yue-jia2, WANG Jun3, WANG Huan2

1. School of Acupuncture and Tuina, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Department of Pharmacy, Ya’an People’s Hospital, Ya’an 625000, China

To explore the mechanism of epiberberine on improving sepsis-induced lung injury based on CD39-NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3)-GSDMD and downstream pyroptosis.CD39 enzymatic activity of isoquinoline alkaloids fromsuch as berberine, coptisine, palmatine, epiberberine and jatrorrhizine, were investigated by AMP-GloTMexperiment. Mice were ip lipopolysaccharide (LPS, 12 mg/kg) to establish sepsis-induced lung injury model, epiberberine or MCC950 were given 24 h before and 0.5 h after modeling, and pathological changes of lung tissue in mice were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining at 24 h after modeling; Wet weight/dry weight ratio of lung tissue was calculated to evaluate lung swelling; Levels of interleukin-1β (IL-1β), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and IL-17A in alveolar lavage fluid were detected by ELISA. The 1 μg/mL LPS combined with 5 mmol/L adenosine triphosphate (ATP)/5 μmol/L nigericin/150 μg/mL MSU or transfection of 0.5 μg/mL poly(dA:dT) were used to stimulate THP-1 cells to replicate inflammatory model, epiberberine or VX-765 was given to intervene. The expressions of CD39-NLRP3-GSDMD pathway protein were detected by Western blotting; IL-1β level in supernatant was detected by ELISA; Immunofluorescence was used to evaluate the assembly of NLRP3 inflammatory bodies; Scanning electron microscope was used to evaluate the cell pyroptosis. BzATP-mediated channel opening of ligand-gated ion channel receptor 7 (P2X7) was used to investigate the effect of epiberberine on P2X7 function.Enzymatic activity of CD39 in epiberberine was the best, with median effective concentration (EC50) of 14.23 μmol/L. Compared with control group, mice in model group showed abnormal lung tissue structure and inflammatory infiltration, and lung swelling was obvious (< 0.01), and levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid were significantly increased (< 0.01); After epiberberine intervention, above changes were effectively reversed (< 0.05, 0.01), and with a dose-dependent relationship. Above effects were related to up-regulation of CD39 protein expression, inhibition of P2X7 over-expression, interference of NLRP3 inflammatory body assembly, reduction of GSDMD-N protein expression, reversal of GSDMD-mediated macrophage scorch and reduction of IL-1β level by epiberberine (< 0.05, 0.01).Epiberberine can reverse lung injury and lung swelling by inhibiting IL-1β, MCP-1 and IL-17A levels in alveolar lavage fluid of mice with septic lung injury, which may be related to regulating CD39-NLRP3-GSDMD and downstream pyroptosis.

epiberberine; sepsis-induced lung injury; CD39; inflammasome; pyroptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01 - 0112 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.014

2022-08-30

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（82104491）；中國博士后科學(xué)基金面上資助地區(qū)專項支持計劃（2021M693789）；四川省自然科學(xué)基金面上項目（2023NSFCSC2036）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者提升計劃項目（BSH2020024）

吳嘉思，講師，博士后，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥藥理與毒理研究。E-mail: wujiasi@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]