陳建國，楊中鐸, 2*，楊立軍，楊淑紅

粉防己根中1個新的阿樸啡型生物堿及其細胞毒活性

陳建國1，楊中鐸1, 2*，楊立軍1，楊淑紅1

1. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院甘肅 蘭州 730050 2. 蘭州理工大學(xué)溫州泵閥工程研究院浙江 溫州 325100

研究粉防己根的化學(xué)成分及其生物活性。采用各種柱色譜方法分離純化化學(xué)成分，應(yīng)用紅外、高分辨質(zhì)譜、核磁共振譜學(xué)技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；采用MTT法測定化合物對人肝癌HepG2細胞的抑制活性。從粉防己根的生物堿提取物中分離得到1個新的阿樸啡型生物堿，鑒定為7-甲基-7-(氯甲基)-9-羥基-6,7二氫-5苯并[]-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊基[6,5,4-]喹啉-7-銨（1）；化合物1對HepG2細胞顯示出較強的增殖抑制活性，其半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為（6.61±3.67）μg/mL?；衔?為新化合物，命名為粉防己堿E（stephtetrandrine E），具有作為抗腫瘤藥物開發(fā)的潛在價值。

粉防己；阿樸啡型生物堿；結(jié)構(gòu)鑒定；粉防己堿E；細胞活力；磷酸二酯酶1

粉防己為防己科（Menispermaceae）千金藤屬Lour.植物粉防己S. Moore的干燥根，廣泛分布于浙江、安徽、福建等省，主要用于自身免疫性疾病和風(fēng)濕病的治療[1]，具有解熱、利尿、消炎、抗糖尿病和抗肝纖維化的活性[2]。阿樸啡型生物堿具有聯(lián)苯的四環(huán)結(jié)構(gòu)，伴有多種氧化態(tài)型和多種取代基。1991年，司端運等[3]首次從粉防己的地上部分分離鑒定了6個阿樸啡類生物堿：防己醌堿、堇醌堿、氧化南天竹啡堿、無根藤米里丁、南天竹啡堿（nantenine）和無根藤新堿。2016年，Dong等[4]從香青藤的塊莖中分離并鑒定了1種新的阿樸啡類生物堿香青藤寧堿（illigeranine），該化合物顯示出對丁酰膽堿酯酶和乙酰膽堿酯酶中等強度的抑制活性，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為（31.62±1.15）和（81.69±2.07）μmol/L。2009年，Chen等[5]從鐵線蓮中分離并鑒定了1種新的阿樸啡生物堿β-木果酚堿（β-magnoflorine），其對青霉UC-4376顯示出較強的抗真菌活性。到目前為止，已從20個科的100多個屬植物中分離出500多個阿樸啡生物堿[6-7]。為了進一步尋找新的具有生物活性的阿樸啡生物堿，本研究應(yīng)用酸提堿沉法提取生物堿，綜合應(yīng)用大孔樹脂、硅膠、LH-20等多種色譜學(xué)方法對粉防己的化學(xué)成分進行研究，應(yīng)用紅外、高分辨質(zhì)譜、核磁共振等譜學(xué)技術(shù)鑒定，得到了1個新生物堿，結(jié)構(gòu)為7-甲基-7-(氯甲基)-9-羥基-6,7二氫-5苯并[]-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊基[6,5,4-]喹啉-7-銨（7-(chloromethyl)-9-hydroxy-7-methyl-6,7- dihydro-5-benzo[]-1,3-benzodioxolo[6,5,4-]- quinolin-7-ium，1），命名為粉防己堿E，結(jié)構(gòu)見圖1；并采用MTT法測定了化合物1對人肝癌HepG2細胞的抑制活性。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Bruker Avance III型核磁共振譜儀（600 MHz，瑞士Bruker公司）；Delta Plus型高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Finnigan公司）；JASCO P-1030型旋光儀（日本JASCO公司）；Perkin Elmer 1600型傅里葉變換紅外色譜儀（KBr壓片，美國Perkin-Elmer公司）；柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠柱色譜（瑞典Amersham Pharmacia公司）；HPD-100大孔吸附樹脂（鄭州勤實科技有限公司）；制霉菌素（批號N141226）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。-半胱氨酸（批號C108237，質(zhì)量分數(shù)99%）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；表柔比星（批號MB1094）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。磷酸二酯酶1（phosphodiesterase 1，PDE1，批號P3243）購自Sigma公司。尖孢鐮刀菌購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院（批號BNCC336354）。HepG2細胞由四川大學(xué)時間生物學(xué)重點實驗室贈送。

粉防己根購自甘肅蘭州黃河藥材市場，經(jīng)蘭州理工大學(xué)楊林副教授鑒定為粉防己S. Moore的干燥根。標本（2018-ylj-1）保存于蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院天然藥物實驗室。

2 方法

2.1 提取與分離

干燥的粉防己根（20.0 kg）粉碎后用95%乙醇水提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得到乙醇提取物。乙醇提取物加3 L熱水懸浮，用稀鹽酸（5%）調(diào)節(jié)pH至2.0，靜置過夜后，抽濾除去不溶物。濾液用氨水（25%）調(diào)節(jié)pH至10.0，用CHCl3（1.5 L×4）萃取得到總生物堿（500 g）?？偵飰A溶解于10%的乙醇中，進行大孔樹脂柱色譜，乙醇-水溶液（10%、30%、50%、70%、90%、100%）梯度洗脫，得到6個組分（Fr. 1～6）。

對Fr. 2（60 g）進行硅膠柱色譜，用三氯甲烷-甲醇（20∶1→1∶1）梯度洗脫，薄層色譜（TLC）檢測合并得到4個組分（Fr. 2.1～2.4）。組分Fr. 2.4進行硅膠柱色譜分離純化，三氯甲烷-丙酮（30∶1→2∶1）梯度洗脫，TLC檢測合并得到5個組分（Fr. 2.4.1～2.4.5）。組分Fr. 2.4.2用LH-20柱色譜分離純化，甲醇洗脫得到化合物1（5.5 mg）。

2.2 生物活性測定

2.2.1 細胞活力測定 采用MTT法檢測HepG2細胞的體外細胞活力。首先，收集對數(shù)生長期的細胞，用培養(yǎng)基將細胞重新懸浮成濃度為1×104～3×104個細胞/mL的細胞懸浮液，然后將細胞懸浮液按每孔100 μL接種到96孔板中。將96孔板置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中在37 ℃培養(yǎng)過夜。實驗分為3組，對照組、實驗組和陽性藥（表柔比星）組。第2天，實驗組各孔中加入100 μL各濃度梯度的藥物，每個藥物濃度設(shè)置3個平行孔。對照組各孔中加入100 μL含0.1%二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基。陽性藥組各孔中加入100 μL各濃度梯度的表柔比星。上述處理組，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育72 h。向96孔板的每個孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，在37 ℃下孵育2～4 h形成甲瓚晶體，去除上清液。向每個孔中加入150 μL DMSO溶解甲瓚晶體。完全溶解后，用酶標儀在波長570 nm下測定吸光度（）值。根據(jù)公式計算藥物對腫瘤細胞的生長抑制率，再使用Graphpad Prism軟件計算IC50值[8]。

生長抑制率＝(對照－實驗)/對照

2.2.2 PDE1活性測定 測定方法參照文獻方法[9]。在96孔板中，加入160 μL含0.11 mol/L氯化鈉和15 mmol/L氯化鎂的0.11 mol/L tris-HCl緩沖液（pH 8.9）、PDE1終濃度為0.000 18 U/孔、20 μL的樣品（化合物1）或20 μL的陽性藥-半胱氨酸。在45 ℃下孵育20 min，加入20 μL的0.65 mmol/L底物（對硝基苯基胸腺嘧啶-5-磷酸），繼續(xù)孵育15 min后，在酶標儀上405 nm處測定值。實驗分4組，樣品組加20 μL樣品，空白組用20 μL tris-HCl緩沖液，樣品本底組加20 μL樣品并用20 μL tris-HCl緩沖液代替底物，完全抑制組用20 μL 200 μg/mL的陽性藥-半胱氨酸。每組平行測定3次，用酶標儀在波長405 nm下測定值，根據(jù)值的變化計算抑制率。

抑制率＝[(空白－完全抑制)－(樣品－樣品本底)]/(空白－完全抑制)

2.2.3 抗尖孢鐮刀菌生長活性測定 測定方法參照文獻報道[10]。將接種至PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～6 d，然后用10 mL雙倍濃度的PDA液體培養(yǎng)基沖洗得懸浮液，使用4層滅菌紗布過濾菌絲體，得到分生孢子液。并用分光光度計測定分生孢子液在625 nm處的值，并用2倍濃度的PDA原液稀釋分生孢子液，使值處于0.09～0.12。在此稀釋濃度上再稀釋100倍即得實驗用孢子懸浮液。在96孔板的各孔中加入50 μL孢子懸浮液，加入50 μL陽性藥（制霉菌素）或待測樣品。將96孔板放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL的碘硝基四唑紫（iodonitrotetrazolium chloride，INT）染色劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化，加入INT后顏色不變紅的孔所對應(yīng)的樣品可認定為有抗尖孢鐮刀菌活性。使用50 μL無菌水代替樣品作為陰性對照組。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，[α]20 D＋90.0° (10, CH3OH)。HRESIMS給出分子式C19H17NO3Cl（/342.088 9 [M]+（計算值342.089 2）。紅外光譜在3419 cm?1處顯示有羥基?；衔?的1H-和13C-NMR波譜數(shù)據(jù)（表1）顯示有1個甲基、4個亞甲基、5個次甲基和9個季碳信號。同時NMR數(shù)據(jù)還表明化合物1具有1個-甲基 [H3.41 (3H, s, H-17),C50.4 (C-17)]、1個氯甲基[H5.49 (2H, s, H-18),C69.7 (C-18)]、1個二氧亞甲基[H6.26 (2H, s, H-19),C102.9 (C-19)] 和5個芳環(huán)質(zhì)子 [H7.34 (1H, s, H-5), 7.86 (1H, s, H-11), 7.88 (1H, dd,= 9.3, 2.6 Hz, H-14), 7.61 (1H, t,= 9.3 Hz, H-15), 9.06 (1H, dd,= 9.3, 2.6 Hz, H-16)]?；衔?的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)與已知的去氫阿樸啡生物堿相似[11-13]，這表明化合物1是去氫阿樸啡生物堿的類似物。H-19/C-6、H-19/C-7、H-5/C-6、H-5/C-7之間的HMBC相關(guān)峰（圖2）表明二氧亞甲基與B-環(huán)并合形成1,3二氧五環(huán)。H-18/C-2、H-2/C-18、H-18/C-17、H-17/C-18、H-2/C-17之間的HMBC相關(guān)峰（圖2）表明，甲基和氯甲基連接到氮原子上形成季胺。H-11/C-10、H-11/C-12、H-11/C-20、H-11/C-9之間的HMBC相關(guān)峰表明C環(huán)形成了芳環(huán)。由于D環(huán)中的3個質(zhì)子分別顯示H9.06 (dd,= 9.3, 2.6 Hz), 7.61 (t,= 9.3 Hz), 7.88 (dd,= 9.3, 2.6 Hz) 峰，因此D環(huán)中的羥基只能被取代在C-13或C-16位。通過查閱文獻報道[11,14-15]，發(fā)現(xiàn)當去氫阿樸啡生物堿的C-16位沒有羥基取代時，H-16的化學(xué)位移通常較大，H為8.5～9.1，而當在C-16位有羥基取代時，D環(huán)上質(zhì)子的化學(xué)位移通常不超過H8.0?；衔?的H-16的化學(xué)位移達到H9.06，這表明羥基應(yīng)該連接到C-13，而不是C-16。

綜合NMR圖譜信息，對化合物1的碳氫信號進行歸屬，見表1。鑒定化合物1的結(jié)構(gòu)為7-甲基- 7-(氯甲基)-9-羥基-6,7二氫-5苯并[]-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊基[6,5,4-]喹啉-7-銨；經(jīng)SciFinder Scholar檢索，化合物1為1個新的阿樸啡型生物堿，命名為粉防己堿E，結(jié)構(gòu)見圖1。

表1 化合物1的1H-NMR 和13C-NMR數(shù)據(jù)(600/150 MHz, CD3OD)

圖2 化合物1的1H-1H COSY和HMBC相關(guān)

3.2 生物活性測定結(jié)果

通過MTT法、高通量抗真菌活性測定法、紫外分光光度法（酶標儀上利用96孔板測定）分別測定了化合物1對HepG2細胞的增殖、尖孢鐮刀菌的生長和PDE1的抑制活性。結(jié)果表明，化合物1對HepG2細胞增殖有較強的抑制活性，其IC50值為（6.61±3.67）μg/mL，陽性藥表柔比星的IC50值為（4.01±1.15）μg/mL。化合物1在10 mg/mL時對尖孢鐮刀菌生長無明顯抑制活性（加入INT后顏色變紅），化合物1對PDE1無明顯抑制活性。

4 討論

本研究從粉防己根的生物堿提取物中分離得到1個新的阿樸啡型生物堿，粉防己堿E，其表現(xiàn)出良好的抗HepG2細胞增殖的活性。另外，本研究同時發(fā)現(xiàn)了4個雙芐基異喹啉類生物堿，粉防己堿A～D，其中粉防己堿C也表現(xiàn)出良好的抑制HepG2細胞增殖的活性[16]。這些研究結(jié)果將為粉防己根開發(fā)成抗腫瘤產(chǎn)品提供了理論支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new aporphine alkaloid fromroots ofand its cytotoxicity

CHEN Jian-guo1, YANG Zhong-duo1, 2, YANG Li-jun1, YANG Shu-hong1

1. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 2. Wenzhou Engineering Institute of Pump & Valve, Lanzhou University of Technology, Wenzhou 325105, China

To study the chemical constituents ofthe roots ofand its biological activities.The chemical constituents were isolated by various column chromatography methods, the structures of the isolated compounds were identified by IR, HRESIMS, 1D, 2D NMR spectra and the human hepatoma cell HepG2 inhibitory activity was tested by MTT method.A new aporphine alkaloid (1) was isolated from the alkaloid extract of the roots of, which was identified as 7-(chloromethyl)-9-hydroxy-7-methyl-6,7-dihydro-5-benzo[]-1,3-benzodioxolo[6,5,4-]quinolin-7-ium; Compound 1 showed potent inhibition against HepG2 cells with its half maximal inhibitory concentration of (6.61±3.67) μg/mL.Compound 1 is a new compound, named stephtetrandrine E, which has potential value as an anti-tumor agent.

S. Moore; aporphine alkaloid; structure elucidation; stephtetrandrine E; cell viability; phosphodiesterase 1

R284.1

A

0253 - 2670(2023)01 - 0041 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.006

2022-10-27

國家自然科學(xué)基金資助項目（22267011）；甘肅省高等學(xué)校產(chǎn)業(yè)支撐計劃項目（2022CYZC-29）；溫州市科技局項目（2022Y0872）；甘肅省自然科學(xué)基金資助項目（20JR5RA458）

陳建國（1997—），男，碩士研究生，研究方向為天然藥物化學(xué)。E-mail: 392085702@qq.com

通信作者：楊中鐸，男，教授，碩導(dǎo)，研究方向為天然藥物化學(xué)。Tel: (0931)2973727 E-mail: yangzhongduo@126.com

[責任編輯 王文倩]